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用T-DNA插入突变的方法获得稻瘟病菌致病突变体

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浙江农业学报 2008年第6期20卷 391-395页

作者：李亚孔慧敏梁慎方敏彦阎霞王政逸浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所浙江杭州310029 甘肃农业大学草业学院甘肃兰州730070

利用农杆菌介导转化的方法共得到1 114个稻瘟病菌转化子,经感病大麦和水稻离体叶片接种鉴定获得3个致病缺陷或下降突变体:A1-134、A1-452、和A2-1-8,其中A1-134和A1-452的致病性下降,而A2-1-8突变体的致病性丧失。对这些突变体的分生孢... 详细信息

利用农杆菌介导转化的方法共得到1 114个稻瘟病菌转化子,经感病大麦和水稻离体叶片接种鉴定获得3个致病缺陷或下降突变体:A1-134、A1-452、和A2-1-8,其中A1-134和A1-452的致病性下降,而A2-1-8突变体的致病性丧失。对这些突变体的分生孢子形态、产孢、附着胞形成等表型分析的结果发现,A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株Guy11的7.7%,分生孢子为圆球形,无隔膜或只有一个隔膜;A1-452产孢量明显增多,为Guy11的22倍;A2-1-8的分生孢子为长针形,产孢量略有下降;A1-134和A1-452在疏水表面的附着胞形成率与Guy11相近,而A2-1-8则不能形成附着胞。研究结果为进一步鉴定和分离这些突变体的T-DNA标记基因奠定了基础。

关键词：稻瘟病菌根癌农杆菌介导转化 T-DNA插入突变致病突变体

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农杆菌介导的稻瘟病菌致病突变菌株的筛选

植物病理学报 2009年第2期39卷 160-167页

作者：周惠萍吴毅歆辻元人久保康之何月秋云南农业大学教育部生物多样性与病虫害控制重点实验室昆明650201 本京都府立大学农学部植物病理实验室日本京都府立大学农学部植物病理实验室

利用1个致病能力非常弱的稻瘟病菌菌株CY2和农杆菌介导T-DNA方法,已成功地获得了5000多个转化子,并以多个转化子混合接种含25个不同抗病基因的近等基因系,获得了30个致病突变体。但突变体针对不同的无毒基因有很大差别,从含有Pi-ta2的F1... 详细信息

利用1个致病能力非常弱的稻瘟病菌菌株CY2和农杆菌介导T-DNA方法,已成功地获得了5000多个转化子,并以多个转化子混合接种含25个不同抗病基因的近等基因系,获得了30个致病突变体。但突变体针对不同的无毒基因有很大差别,从含有Pi-ta2的F128-1上获得了14个突变体,从含有Pi-a的IRBL-2上获得了7个突变体,从含有Pik-s的IRBL-4上获得了2个突变体,而从其它抗病基因的品系上未发现任何突变体,故T-DNA似乎有插入热点。不同突变体在携带相同抗病基因的品系上的致病性存在很大差异,表明这些近等基因系可能还携带其它抗稻瘟病基因。CY2不能侵染普遍认为不含抗稻瘟病基因的丽江新团黑谷(LTH),而7个突变体则能成功地使其发病,表明LTH亦含有抗稻瘟病基因。

关键词：稻瘟病菌农杆菌介导的遗传转化转化子致病突变体

香蕉枯萎病菌2种细胞壁降解酶酶活性平板检测方法

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华南农业大学学报 2013年第3期34卷 340-344页

作者：施金秀林先丰姜乃月凌金锋李敏慧姜子德华南农业大学资源环境学院广东广州510642

以病原真菌香蕉枯萎病菌4号生理小种为材料,建立了多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的平板检测方法.多聚半乳糖醛酸酶的最佳产酶和检测条件为:诱导底物为果胶,接种孢子终浓度为1×104mL-1,培养时间为3 d.37℃时检测的多聚半乳糖醛酸酶活性最... 详细信息

以病原真菌香蕉枯萎病菌4号生理小种为材料,建立了多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的平板检测方法.多聚半乳糖醛酸酶的最佳产酶和检测条件为:诱导底物为果胶,接种孢子终浓度为1×104mL-1,培养时间为3 d.37℃时检测的多聚半乳糖醛酸酶活性最大;纤维素酶的最佳产酶和检测条件为:诱导底物为羧甲基纤维素,接种孢子终浓度为1×105mL-1,培养时间为3 d,37℃时检测的纤维素酶活性最大.在此基础上,筛选已获得的香蕉枯萎病菌4号生理小种致病力减弱突变体,获得了2株多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶酶活性显著降低的致病突变体.

关键词：香蕉枯萎病菌纤维素酶多聚半乳糖醛酸酶酶活性平板检测致病突变体

水稻抗白叶枯病基因Xa30对应的病原菌无毒基因研究

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水稻抗白叶枯病基因Xa30对应的病原菌无毒基因研究

作者：车晋英中国农业科学院

学位级别：硕士

由革兰氏阴性菌引起的水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）是水稻生产上最严重的细菌性病害,在世界产稻国均有报道。白叶枯病菌寄主特异性强,且与水稻之间为典型的基因对基因互作关系,是分子植物病理学中研究植物与病原物互作... 详细信息

由革兰氏阴性菌引起的水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）是水稻生产上最严重的细菌性病害,在世界产稻国均有报道。白叶枯病菌寄主特异性强,且与水稻之间为典型的基因对基因互作关系,是分子植物病理学中研究植物与病原物互作的重要模式系统之一。根据基因对基因学说,植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因与相应的来源于病原物的无毒基因互作所决定的,无毒基因决定了病原菌对含有相应抗性基因的寄主植物发生特异性不亲和反应。明确Xoo致病性的分子机理对于揭示Xoo与水稻的互作机制以及制定病害防治策略具有重要的科学意义。目前,水稻黄单胞菌水稻致病变种韩国菌株KACCl0331、日本菌株MAFF311018和菲律宾国际鉴别菌株PXO99的基因组序列已经公布,这为我们研究水稻白叶枯病菌与水稻的相互作用提供了良好的生物信息资源,但仍然不能够解释大批未知功能基因。Xoo突变体库的建立是开展病原菌功能基因组学研究的有效途径。本实验室前期利用Tn5转座系统构建了国际鉴别小种PXO99的突变体库,库容量达24192个克隆。根据T-DNA插入基因组计算公式,插入概率达到99%,覆盖PXO99基因组6倍。本实验室从我国普通野生稻中发掘、鉴定了一个编号为Y238的新抗源,经遗传分析证明其抗性是受一个新的显性基因控制,该抗病基因被命名为Xa30。利用Xa30的近等基因系CBB30I,已将其定位在水稻第11号染色体长臂上。国际鉴别小种PXO99是一个毒性很强的菌株,具有广谱致病性,大多数水稻品种对其表现感病,而CBB30I对其表现抗病。为了研究抗病基因Xa30与病原菌PXO99的互作机理,本研究利用近等基因系CBB30I筛选PXO99突变体库,从中寻找对应CBB30I的无毒基因。主要研究结果如下:1.田间接种鉴定筛选突变体库:采用人工剪叶接种法将15540个PXO99突变体菌分别接种在CBB30I植株上,每个突变体菌接种1个植株,15-18天后进行调查,经过初步筛选,共获得210个使CBB30I植株感病的突变体菌。2.突变体菌复筛鉴定:将获得的210个突变体菌在CBB30I上进一步接种,同时以感病品种IR24为对照,最终确认23个突变体菌能使CBB30I水稻品种产生不同程度的致病症状。3.分子检测Tn5插入:采用PCR和Southern bloting方法对上述23个突变菌株进行了Tn5转座子插入检测,结果表明使CBB30I抗性发生改变的突变体菌株均为转座子插入引起,只有一个突变体菌为双拷贝插入,其它均为单拷贝插入。***5插入位点左右边界基因组序列获得:利用PCR walking方法,包括基因组酶切、加入接头、二轮PCR等技术,共获得9个致病突变体菌Tn5插入位点左右边界基因组片段。5.生物信息学分析:将9个致病突变体菌左右边界的侧翼片段进行测序。测序后经Blast比对结果发现:编号XMC-103的突变体菌,Tn-5插入的基因编码假定蛋白（hypothetical protein）,其下游有一基因talC6a,编码蛋白为TAL effector AvrBs3/pthA,与该基因配对的抗病基因目前还未有报道);编号XMC-89、XMC-100、XMC-101、XMC-105、XMC-107,Tn-5插入的基因分别编码LysR家族中的转录调节蛋白（transcriptional regulator, LysR family）、分割蛋白（partition protein）、ATP-dependent RNA helicase、假定蛋白（hypothetical protein:其下游蛋白为two-component system regulatory protein with HD-GYP domain）、肽酶（peptidase）;XMC-41、XMC-55、XMC-92,Tn5插入破坏的基因编码产物分别为青霉素酰基转移酶Ⅱ（penicillin acylaseⅡ）、马来酰乙酰乙酸异酶（maleylacetoacetate isomerase ）、组氨酸激酶传感蛋白（sensor histidine kinase）的基因,推测由于Tn-5插入阻断蛋白活性,使突变体菌株表现出对水稻品种CBB30I的致病性从无毒转变为有毒。

关键词：水稻白叶枯病菌 PCR walking 致病突变体无毒基因

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黄单胞细菌致病相关基因的克隆

黄单胞细菌致病相关基因的克隆

作者：徐安毕海南大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是世界水稻生产中的主要病害之一,也是我国水稻高产、稳产的主要限制因素之一。随着水稻基因组的测序完成,以及白叶枯病菌在水稻上的致病特异性,水稻与白叶枯病菌的互作研究已经成为现今研究植物-病... 详细信息

水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是世界水稻生产中的主要病害之一,也是我国水稻高产、稳产的主要限制因素之一。随着水稻基因组的测序完成,以及白叶枯病菌在水稻上的致病特异性,水稻与白叶枯病菌的互作研究已经成为现今研究植物-病原菌相互关系的首选材料。同时,利用抗性基因选育抗病品种是防治白叶枯病的有效手段,目前国际上命名的水稻白叶枯病基因已达30个之多。中国农业科学院作物科学研究所从普通野生稻(Oryzae rufipogon)中发掘鉴定的新基因Xa23是迄今发现的抗谱最广、抗性转移效应最强的全生育期完全显性的白叶枯病抗性基因,不同遗传背景的F1植株从苗期到成株期均表现高度抗病,是改良水稻、特别是杂交稻白叶枯病抗性的优异抗源,迄今,在自然界未发现能使Xa23致病的白叶枯菌株。水稻白叶枯病由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起。水稻黄单胞杆菌PXO99是迄今发现的致病性最强、致病谱最广的菌株,除携带有Xa23的水稻品种CBB23外,几乎对所有的水稻品种致病。于是,我们用抗谱最广的水稻CBB23(Xa23)与致病谱最广的白叶枯病菌PXO99为材料,研究植物与病原菌之间典型的特异性互作关系。克隆PXO99对CBB23(Xa23)的致病基因,将有助于阐明白叶枯病菌的广谱致病性机理。我们实验室利用Tn5转座系统,建立了容量为24192个突变体菌的PXO99突变体库,本研究以每个突变菌株对应一株水稻的方式,通过大量的人工剪叶接种,筛选了包含24192个突变体的Tn5-PXO99突变体库,经过初步筛选,获得121个可疑致病突变菌株,然后采用注射接种和人工剪叶接种相结合的接种鉴定方法,经过反复筛选鉴定,最终确认14个可使CBB23(Xa23)水稻产生不同严重程度的致病症状的突变菌株,并对这14个致病突变体进行PCR分子检测Tn5的插入,Southern检测转座子Tn5插入拷贝数。在这14个致病突变体中,我们选择了两个单拷贝Tn5插入、致病性较强的致病突变体XMS-16、XMS-86进行侧翼序列分析,通过PCR walking的方法,分离出Tn5插入位点侧翼片段并测序。通过比对Xoo KACC10331genomic DNA序列,发现转座子Tn5在XMS-16和XMS-86基因组中的插入位点分别位于该基因组的788957bp处和3254316bp处,分别破坏了基因Xoo0774和Xoo3031,基因Xoo0774编码一个158个氨基酸的外膜蛋白,基因Xoo3031为一个编码330个氨基酸的细胞色素过氧化物酶CCPs。对这两个基因进行了生物信息学分析,并讨论了这两个基因可能的致病机理。

关键词：水稻黄单胞杆菌白叶枯病致病突变体致病性无毒基因

根癌农杆菌介导苹果树腐烂病菌的遗传转化及转化子文库构建

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根癌农杆菌介导苹果树腐烂病菌的遗传转化及转化子文库构建

作者：胡杨西北农林科技大学

学位级别：硕士

苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali ***,Vmm)引起的苹果树腐烂病给陕西乃至全国苹果生产造成了严重的威胁。了解该病菌的致病相关基因,将有助于深入认识该病害致病机理,对该病害的科学有效防控有重要意义。但是,到目前为止,关于该病菌致病相关... 详细信息

苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali ***,Vmm)引起的苹果树腐烂病给陕西乃至全国苹果生产造成了严重的威胁。了解该病菌的致病相关基因,将有助于深入认识该病害致病机理,对该病害的科学有效防控有重要意义。但是,到目前为止,关于该病菌致病相关基因未见报道。根癌农杆菌介导的遗传转化由于简单方便而被广泛用于真菌致病相关基因的研究。因此,为了发掘该病菌的致病相关基因,本研究首次将根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)引入 Vmm,利用携带pBIG2RHPH2-GFP-GUS质粒的根癌农杆菌EHA105对苹果树腐烂病菌(Vmm)分生孢子进行转化,建立并优化了遗传转化体系,构建并评估了转化子文库。所得转化体系及转化子文库将为苹果树腐烂病菌致病相关基因的发掘奠定良好的技术和材料基础。本研究主要结果如下:1.建立了Vmm的转化体系,并对过滤膜,农杆菌培养条件进行了优化。结果发现(1)过滤膜可以省略;(2)根癌农杆菌的MM培养环节可由LB培养代替;(3)根癌农杆菌的IM培养环节中AS(Acetosyringone)对转化效率无影响;(4)根癌农杆菌的IM培养环节可以省略。最简便体系为LB-CM。2.通过对共培养时间,根癌农杆菌数量进行优化,得出优化体系为:根癌农杆菌经过LB过夜培养后,不经过IM培养,调节OD660至0.3,与Vmm分生孢子悬浮液(106个/mL)直接混合后共培养于CM上2 d,再用含有抗生素的PDA覆盖。转化效率约为26个转化子/105个分生孢子。3.由于通过携带pBIG2RHPH2-GFP-GUS质粒的根癌农杆菌EHA105进行转化所得转化子检测不到绿色荧光.;含pSK1044质粒的根癌农杆菌SK1044被用于对Vmm的转化,结果显示Vmm被gfp(green fluorescent protein)成功标记。4.构建了约6000个转化子组成的文库,并对文库进行了质量评估。结果显示249株随机挑选的转化子通过连续5次无筛选培养,243株转化子依然能够在含有60μg/mL潮霉素B的PDA上生长,表明转化子有丝分裂稳定;20株随机挑选转子均能通过PCR扩增出相应条带,表明hph基因(hygromycin B phosphotransferase)被成功整合到Vmm基因组上;对随机挑选的致病突变体进行Southern blot分析显示,所挑选的菌株均含有hph基因,并有27.8%(5/18)的致病突变体为T-DNA单拷贝插入。

关键词：根癌农杆菌介导的遗传转化苹果树腐烂病菌转化体系优化 gfp标记致病突变体