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Ⅰ型过敏试验动物模型比较研究

中国实验方剂学杂志 2013年第18期19卷 193-197页

作者：帅维维朱丹凤蒋宝平程建明南京中医药大学南京210029 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室南京210029 江苏省名医验方研究与产业化工程实验室南京210029

目的:通过观察速发型过敏反应发生时的敏感指标的含量变化,比较常用于中药注射剂速发型过敏反应的几种动物模型的优劣。方法:①以卵蛋白为致敏原,直接对SD大鼠、BN大鼠、豚鼠进行致敏和激发,通过观察过敏反应的症状,ELISA法测量血清中的... 详细信息

目的:通过观察速发型过敏反应发生时的敏感指标的含量变化,比较常用于中药注射剂速发型过敏反应的几种动物模型的优劣。方法:①以卵蛋白为致敏原,直接对SD大鼠、BN大鼠、豚鼠进行致敏和激发,通过观察过敏反应的症状,ELISA法测量血清中的IgE、组胺、类胰蛋白酶以及β-氨基己糖苷酶的含量变化。②SD大鼠皮下注射致敏后的动物血清进行被动皮肤过敏试验,观察大鼠皮下是否出现蓝斑以及蓝斑面积。结果:①在致敏和激发途径、注射卵蛋白的剂量、次数、间隔时间相同的情况下,SD大鼠、BN大鼠、豚鼠血清中IgE、组胺、类胰蛋白酶以及β-氨基己糖苷酶的含量与相应的生理盐水组比均具有显著性的差异。其中豚鼠血清中IgE、类胰蛋白酶以及β-氨基己糖苷酶的变化率均高于SD大鼠和BN大鼠。BN大鼠血清中的组胺变化率高于豚鼠和SD大鼠。②被动过敏试验显示:BN大鼠卵蛋白组在SD大鼠上可造成明显的蓝斑。结论:仅采用豚鼠作为评价中药注射剂过敏反应的动物模型尚不能完全反映注射剂是否能引起过敏反应,增加不同品种试验动物以及相关检测指标,能更加全面的评价中药注射剂的致敏性。

关键词：过敏试验致敏性评价动物模型

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热加工鲜花生的蛋白致敏性变化评估研究

热加工鲜花生的蛋白致敏性变化评估研究

作者：张英南昌大学

学位级别：硕士

花生作为八大类食物过敏原之一,是一种常见的食物和食品加工原料,可引起严重的过敏反应。花生经常是经过加工之后被食用,但是加工对花生蛋白致敏性的影响至今还没有统一的认识,这可能与现有研究中不统一的蛋白提取方法和致敏性评估方法... 详细信息

花生作为八大类食物过敏原之一,是一种常见的食物和食品加工原料,可引起严重的过敏反应。花生经常是经过加工之后被食用,但是加工对花生蛋白致敏性的影响至今还没有统一的认识,这可能与现有研究中不统一的蛋白提取方法和致敏性评估方法有关。探索鲜花生加工后,蛋白提取方法和致敏性评估方法对花生蛋白潜在致敏性的影响,揭示热加工对鲜花生蛋白的消化性和潜在致敏性的影响,将为花生制品加工的优化提供依据。本论文以新鲜花生为研究对象,采用不同的热加工方式进行处理,并用丙酮脱脂制备成脱脂粉。一方面利用不同方法提取脱脂粉中的花生蛋白,比较不同提取方法和加工方法对花生蛋白提取的影响;另一方面利用花生脱脂粉进行体外模拟胃肠消化,分析热加工处理对蛋白的消化性的影响。最后通过不同的体外致敏性评估方法,分析加工前后花生的蛋白提取液和脱脂粉消化产物的IgE结合能力以及诱导人嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒的能力。研究的主要方法、结果和结论如下:1.将新鲜花生进行相应的处理:鲜花生带壳水煮(100℃,15 min)、鲜花生去壳水煮(100℃,15 min)、鲜花生带壳烘烤(170°C,35 min)、鲜花生去壳烘烤(170°C,20 min)和鲜花生去壳油炸(152°C,400 s),之后去壳去红衣,研磨,丙酮脱脂,得到花生脱脂粉。采用凯氏定氮法测定各样品中的总蛋白含量。结果表明,花生样品的总蛋白含量为51.84%,经过热加工后样品中总蛋白含量为52.29%(带壳水煮)、51.69%(去壳水煮)、51.78%(带壳烘烤)、52.71%(去壳烘烤)和54.21%(油炸),即热加工后花生总蛋白含量无显著变化。2.利用三种提取方法从脱脂粉中提取花生蛋白:方法一用50 mmol/L的Tris-HCl(pH 7.2)与脱脂粉10:1的体积质量比重复浸提;方法二用20 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.2)与脱脂粉20:1的体积质量比混合浸提取;方法三用高序列离液剂与脱脂粉以50:1的体积质量比混合,超声提取。利用考马斯亮蓝法测定所得提取液中的蛋白浓度并计算提取率,通过电泳分析各提取液中的蛋白组分差异。结果表明,方法一和方法二对热加工后花生中蛋白的提取率分别处于7.20%8.58%和5.21%3.24%范围内,显著低于各自对未加工花生的蛋白提取率(45.35%,40.77%)。从电泳结果可以看出方法三提取得到的花生蛋白所含的蛋白组分条带最多;分析各过敏原组分含量可知,在Tris-HCl缓冲液(方法一和方法二)提取的提取液中,热加工明显降低了Ara h 1单体的提取率,方法一对未加工花生样品中的Ara h 1单体的提取率为29.55%,而热加工后的提取率最高仅有1.57%(去壳烘烤)。在方法三得到的提取液结果中可以看到,烘烤虽降低了Ara h 1和Ara h 2等蛋白单体的提取效率,但提取获得了较多的高分子量蛋白聚集体。3.利用圆二色光谱法和紫外光谱法测定花生蛋白提取液的高级结构,利用Tricine-SDS-PAGE鉴定脱脂粉中花生总蛋白的消化性。结果表明,不同提取方法得到的花生蛋白的高级结构不同。方法一提取得到的带壳烘烤、去壳烘烤和油炸花生蛋白的α-螺旋含量(分别为24.05%,15.70%,11.80%)比方法二中对应样品的α-螺旋含量高(分别为3.05%,8.75%,5.45%)。在方法三的提取过程中,花生蛋白的结构会被破坏,对鲜花生未加工样品而言,方法一和方法二所提取得到的花生蛋白中α-螺旋含量在20%左右(分别为23.10%和20.05%),而方法三提取得到的未加工花生蛋白中α-螺旋含量仅有7.10%。热加工也会影响花生蛋白的高级结构,表现为α-螺旋或β-结构含量的降低,使得花生蛋白结构展开或无序。4.利用竞争抑制ELISA法鉴定花生蛋白提取液和花生脱脂粉胃肠消化产物的IgE结合能力,并利用BLI方法测定过敏原与IgE的结合常数。结果显示,BLI方法的实验结果与ELISA检测结果高度一致。在Tris-HCl(方法一和方法二)提取的情况下,带壳水煮处理和带壳烘烤处理可以显著降低花生蛋白的IgE结合能力,去壳烘烤处理不会显著影响花生蛋白的IgE结合能力,油炸增强了花生蛋白的IgE结合能力。方法一中各样品的IC值为:未加工1.22μg/mL、带壳水煮3.29μg/mL、去壳水煮1.81μg/mL、带壳烘烤2.78μg/mL、去壳烘烤0.95μg/mL和油炸0.73μg/mL,方法二中各样品的IC值为:未加工1.14μg/mL、带壳水煮3.77μg/mL、去壳水煮2.74μg/mL、带壳烘烤4.93μg/mL、去壳烘烤1.25μg/mL和油炸0.67μg/mL。在方法三提取得到的花生蛋白中(鲜花生未加工样品IC=11.02μg/mL),带壳水煮(IC=13.12μg/mL)和去壳

关键词：花生热加工蛋白提取脱脂粉致敏性评价 KU812细胞模型

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鸡蛋卵转铁蛋白及其铁螯合物致敏性的评估

鸡蛋卵转铁蛋白及其铁螯合物致敏性的评估

作者：高琳南昌大学

学位级别：硕士

食物过敏是一个危害全球的公共卫生问题,有研究认为,鸡蛋是第二大过敏原食物。目前已知的鸡蛋过敏原主要有卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶。卵类黏蛋白因其热稳定性好,耐消化,被认为是一种致敏性很高的鸡蛋过敏原。但是,最... 详细信息

食物过敏是一个危害全球的公共卫生问题,有研究认为,鸡蛋是第二大过敏原食物。目前已知的鸡蛋过敏原主要有卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶。卵类黏蛋白因其热稳定性好,耐消化,被认为是一种致敏性很高的鸡蛋过敏原。但是,最近有研究表明,卵转铁蛋白的致敏性与卵类黏蛋白相似,值得我们关注。由于卵转铁蛋白有较强的铁离子螯合能力,而且与铁离子螯合后卵转铁蛋白的三级结构发生明显改变。因此,卵转铁蛋白与铁离子螯合后其致敏性的变化也值得关注。本论文以鸡蛋卵转铁蛋白为研究对象,开展了鸡蛋卵转铁蛋白及其铁螯合物致敏性的评估,主要研究内容包括:①鸡蛋卵转铁蛋白的分离纯化及其铁螯合物的制备;②通过小鼠实验模型对卵转铁蛋白及其铁螯合物的致敏性进行评价;③基于树突状细胞抗原加工的方法对鸡蛋卵转铁蛋白及其铁螯合物的致敏性进行评价。研究的主要方法、结果及结论如下。1.先通过CM Sepharose Fast Flow阳离子交换层析结合经基磷灰石疏水层析的方法,制备得到鸡蛋卵转铁蛋白。然后将卵转铁蛋白溶液置于NTA-Fe3+溶液中透析,制备得到了较高纯度的卵转铁蛋白铁螯合物。经尿素电泳鉴定,卵转铁蛋白及其铁离子螯合物的纯度分别达到98%与68%。2.通过小鼠模型评价了卵转铁蛋白及其铁螯合物的致敏性。小鼠空肠组织切片结果表明,经卵转铁蛋白及其铁螯合物免疫的小鼠均出现肠道过敏反应,但是并没有引起全身性的过敏反应症状。与卵转铁蛋白组小鼠相比,卵转铁蛋白铁螯合物组小鼠血清中的sigG与sigGl水平,脾细胞增殖水平,以及与食物过敏相关的细胞因子IFN-γ,均显著下调(P致敏性较低,并且卵转铁蛋白铁螯合物的致敏性低于卵转铁蛋白。3.体外培养小鼠骨髓来源的树突状细胞,并测定了树突状细胞对过敏原的摄取率。结果显示,树突状细胞对卵转铁蛋白的摄取率显著低于对卵转铁蛋白铁螯合物的摄取率(P致敏性并非正相关。4.在使用组织蛋白酶D模拟树突状细胞对过敏原的加工实验中,卵转铁蛋白与其铁螯合物均无显著性的变化,表明单独使用组织蛋白酶D并不能模拟树突状细胞对过敏原的加工,应考虑使用多种复合酶,同时提示我们,为了更好地了解树突状细胞对过敏原的加工与食物过敏的关系,应该进一步研究树突状细胞将加工后的过敏原呈递给T细胞后所引发的T细胞反应类型。

关键词：卵转铁蛋白铁螯合物致敏性评价小鼠模型树突状细胞

关键氨基酸对花生致敏原Ara h 2致敏性的影响

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关键氨基酸对花生致敏原Ara h 2致敏性的影响

作者：周晓娅南昌大学

学位级别：硕士

花生是世界上最常见的过敏食物之一,花生致敏原中Ara h 2是致敏性最强的组分之一。严格避免摄入是对过敏患者唯一可靠的预防方式。然而,由于花生和花生产品在食品中的广泛使用,这种做法非常困难,因此人们试图将视线转移到食品本身。蛋... 详细信息

花生是世界上最常见的过敏食物之一,花生致敏原中Ara h 2是致敏性最强的组分之一。严格避免摄入是对过敏患者唯一可靠的预防方式。然而,由于花生和花生产品在食品中的广泛使用,这种做法非常困难,因此人们试图将视线转移到食品本身。蛋白质结构会影响致敏性,但影响致敏性的分子机制仍不清楚,特别是决定致敏性的蛋白关键结构仍有待研究。本论文以发现影响蛋白质潜在致敏性的局部结构为出发点。通过关键氨基酸的突变分别破坏线性表位、二硫键、疏水核心、电荷核心四种结构,从而定向改造致敏原Ara h 2。实验表征突变前后Ara h 2整体结构变化,软件模拟突变前后Ara h 2局部结构变化,通过血清学、细胞学、动物实验系统地评价突变前后Ara h 2潜在致敏性变化。对比结构变化与潜在致敏性变化,以期找到影响致敏原致敏性的关键结构。本文的研究方法、主要结果与结论如下:1、选取疏水核心及电荷核心中关键氨基酸,将其突变为理化性质相反的氨基酸,设计5个突变体。疏水核心破坏后疏水氨基酸间距离变远,电荷核心破坏后局部静电势能面完全改变,结构变化与设计预期基本一致,突变体设计成功。加上破坏致敏原Ara h 2二硫键、优势表位的3个突变体,共8个突变体。天然Ara h 2通过天然花生脱脂再由阴离子交换层析柱纯化,野生型Ara h2和8个突变体通过大肠杆菌原核表达,利用镍离子亲和柱纯化,所有样品纯度均在85%之上。2、通过圆二色谱和紫外吸收光谱法表征突变前后Ara h 2整体结构变化,通过分子动力学Gromacs模拟结构并借助Py MOL、VMD、Elli Pro等软件分析局部结构变化。结果显示,氨基酸突变不仅会影响局部结构同样也会影响远程结构,不同氨基酸突变可能带来某个局部结构静电势的相似变化,如RDPYSPSQDPYSPS。破坏二硫键后,α-螺旋含量降低,β-转角含量增加,芳香族氨基酸的溶剂可及表面积减小。破坏疏水核心后内部紧凑结构被破坏,整体结构向外扩散。破坏电荷核心后螺旋结构变得更加紧凑,无规则卷曲可能部分转化为螺旋。3、通过间接竞争ELISA法检测Ig E结合能力。结果发现,Ara h 2中不同结构对其与Ig E结合能力的影响排序为:疏水核心>结构更加紧凑的电荷核心=所有二硫键>线性表位>电荷核心。疏水核心对Ig E结合有关键作用,突变疏水氨基酸残基后Ig E结合能力降低最明显,其中疏水核心L、M、F、L影响更大。疏水核心破坏后蛋白溶剂可及表面积和疏水残基溶剂可及表面积增加,而苯丙氨酸的溶剂可及表面积减小,苯丙氨酸F、F可能是致敏原Ara h 2与Ig E结合的关键位点之一。4、基于KU812细胞株脱颗粒模型、Balb/c小鼠模型评价突变前后Ara h 2的致敏性变化。通过细胞炎症因子分泌、小鼠临床症状、血清中特异性抗体、血清中肥大细胞蛋白酶1及食物过敏相关细胞因子综合评价突变前后Ara h 2的致敏性变化。结果表明,二硫键对于对Ara h 2的潜在致敏性强弱至关重要,破坏二硫键后致敏性强弱与芳香族氨基酸的溶剂可及表面积大小正相关。疏水核心L、A可以抑制组胺的形成。破坏电荷核心后螺旋结构更加紧凑,局部结构的负电势减少,潜在致敏性减弱。

关键词： Ara h 2 关键氨基酸分子动力学模拟致敏性评价

南美白对虾主要过敏原鉴定及酶法消减技术的研究

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南美白对虾主要过敏原鉴定及酶法消减技术的研究

作者：吴海明天津商业大学

学位级别：硕士

以南美白对虾、中国明对虾、刀额新对虾以及虾蛄四种海虾为研究对象,对四种海虾过敏原蛋白组分进行研究。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对四种海虾过敏原组分进行分析,经免疫印迹鉴定其主要过敏原。南美白对虾的主要过敏原为99kDa、33kDa、19... 详细信息

以南美白对虾、中国明对虾、刀额新对虾以及虾蛄四种海虾为研究对象,对四种海虾过敏原蛋白组分进行研究。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对四种海虾过敏原组分进行分析,经免疫印迹鉴定其主要过敏原。南美白对虾的主要过敏原为99kDa、33kDa、19kDa以及14kDa的蛋白质组分;中国明对虾的主要为39kDa、33kDa和28kDa的蛋白质组分;刀额新对虾的主要为33kDa和24kDa的蛋白质组分;虾蛄的为56kDa和48kDa的蛋白组分。用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对南美白对虾蛋白水解,消减过敏原,通过间接酶联免疫吸附实验进行检测,以OD492nm值为指标确定三种蛋白酶的最佳水解条件。胰蛋白酶最佳水解条件为:pH8.0,酶底比1:100,45℃,底物浓度3%,水解时间3h;木瓜蛋白酶的为pH6.5,酶底比1:100,60℃,底物浓度3%,水解时间3h;菠萝蛋白酶的为:pH7.5,酶底比1:100,55℃,底物浓度5%,水解时间3h。以卵白蛋白为阳性对照,PBS溶液为阴性对照,建立豚鼠全身过敏反应和离体肠管平滑肌收缩反应过敏试验动物模型。结果显示,用0.01g/100mL卵白蛋白致敏并激发后,100%豚鼠全身过敏反应呈阳性。相似质量浓度的南美白对虾蛋白(0.01g/100mL)的全身过敏反应与阳性对照组相近,离体肠管平滑肌过敏性收缩反应的实验结果与全身过敏反应结果相似。对南美白对虾的三种蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶)水解产物的致敏性进行评价,结果显示,三种南美白对虾的蛋白酶水解产物所致的全身过敏反应均明显减弱同时三种南美白对虾的蛋白酶水解产物致敏的离体肠管平滑肌对南美白对虾蛋白和三种水解产物攻击的反应也明显减弱。用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶水解虾肉,通过间接酶联免疫吸附实验进行检测,以OD492nm值为指标确定最佳水解条件。结果表明,胰蛋白酶最佳水解条件为:pH值为8.0,酶与底物比1:100,水解温度为45℃,底物浓度为5%,水解时间为3h,水解物OD值为0.085;木瓜蛋白酶最佳水解条件为pH值为6.5,酶与底物比1:100,水解温度为60℃,底物浓度为5%,水解时间为3h,水解物OD值为0.049。研究发现用木瓜蛋白酶水解虾肉,其过敏原的消减效果最好。

关键词：南美白对虾过敏原蛋白鉴定酶解消减过敏原致敏性评价

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花粉过敏动物模型的研究进展

黑龙江动物繁殖 2022年第3期30卷 23-31页

作者：宋天园肖兰王甜夏建珍鲁碧楠唐丽民族医药教育部重点实验室(中央民族大学) 北京100081 中央民族大学药学院北京100081 北京协和医学院护理学院北京100144 中央民族大学附属校医院北京100081

花粉等植物性过敏原导致的各类变态反应性疾病逐年高发,成为全球性公共卫生问题和各国政府日益关注的环境与健康风险。花粉过敏动物模型是研究植物源过敏性疾病的发生及其过敏机制等的关键环节,可为花粉过敏机制及相关研究提供重要依据... 详细信息

花粉等植物性过敏原导致的各类变态反应性疾病逐年高发,成为全球性公共卫生问题和各国政府日益关注的环境与健康风险。花粉过敏动物模型是研究植物源过敏性疾病的发生及其过敏机制等的关键环节,可为花粉过敏机制及相关研究提供重要依据,也可对花粉过敏原进行有效准确的评价和检测,推动防治策略研究。文章围绕花粉过敏动物模型的品系种类、模型构建方法、繁育策略、检测与评价等方面的研究资料进行综述,通过总结近年来花粉过敏动物模型研究的优缺点及其应用情况,为建立适宜的花粉过敏研究实验动物模型及其相关的基础和应用研究提供参考。

关键词：花粉过敏动物模型过敏机制致敏性评价过敏原检测