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基于网络药理学与细胞实验探讨至真方抗结直肠癌的作用机制

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中医学报 2024年

作者：韩惠杰李永静赵永波刘辉王松坡上海市第一人民医院中医科上海中医药大学附属曙光医院传统中医科上海市第一人民医院神经内科

目的：基于网络药理学、分子对接及实验验证初步探讨至真方抗结直肠癌（colorectal cancer CRC）的核心靶点、关键活性成分、信号通路和作用机制。方法：分别使用TCMSP和GeneCards数据库筛选至真方的作用靶点以及结直肠癌的疾病靶点；... 详细信息

目的：基于网络药理学、分子对接及实验验证初步探讨至真方抗结直肠癌（colorectal cancer CRC）的核心靶点、关键活性成分、信号通路和作用机制。方法：分别使用TCMSP和GeneCards数据库筛选至真方的作用靶点以及结直肠癌的疾病靶点；并通过Venn图映射出药物靶点与疾病靶点的共同靶点；借助String数据库及Cytoscape＿v3.7.2软件构建PPI网络及“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图；同时进行GO和KEGG富集分析；将至真方的关键活性成分与核心靶点进行分子对接验证；最后通过CCK-8实验检测至真方对结直肠癌细胞的抑制作用，RT-qPCR检测核心靶点mRNA的表达，Western blot检测核心靶点的表达。结果：共收集到至真方相关靶点225个，结直肠癌相关靶点10317个，至真方抗结直肠癌的潜在作用靶点共193个，其中AKT1、TP53为至真方抗结直肠癌的核心靶点，Quercetin、Luteolin为至真方的关键活性成分；GO和KEGG富集分析筛选出PI3K/Akt信号通路、p53信号通路为至真方抗结直肠癌的主要信号通路；分子对接表明至真方关键活性成分与核心靶点具有较强的结合活性，CCK8结果表明至真方对人大肠癌细胞SW620的生长有抑制作用；RT-qPCR结果显示，与对照组相比，至真方可上调SW620细胞AKT1、TP53 mRNA的表达量（P至真方可降低SW620细胞p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量，升高p53蛋白相对表达量（P至真方可能通过调节AKT1、TP53核心靶点的表达，进而调控PI3K/Akt/p53信号通路来抑制结直肠癌细胞的增殖而发挥抗结直肠癌作用。

关键词：结直肠癌至真方网络药理学实验验证作用机制

至真方调控肿瘤相关巨噬细胞抑制大肠癌耐药的机制研究

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至真方调控肿瘤相关巨噬细胞抑制大肠癌耐药的机制研究

作者：伏杰上海中医药大学

学位级别：硕士

目的研究肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞在大肠癌耐药中的作用,探讨至真方调控肿瘤相关巨噬细胞极化,进而抑制大肠癌耐药的作用机制,为中医药干预大肠癌、改善肿瘤多药耐药提供实验室依据。方法(1)构建TAMs模型并使用q RT-PCR鉴定,将T... 详细信息

目的研究肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞在大肠癌耐药中的作用,探讨至真方调控肿瘤相关巨噬细胞极化,进而抑制大肠癌耐药的作用机制,为中医药干预大肠癌、改善肿瘤多药耐药提供实验室依据。方法(1)构建TAMs模型并使用q RT-PCR鉴定,将TAMs与HCT-116共培养后,流式细胞术观察HCT-116细胞的凋亡,Western Blot检测HCT-116细胞耐药蛋白及Hedgehog信号通路相关蛋白的表达;(2)CCK-8法观察至真方对TAMs增殖的影响,进而用q RT-PCR检测至真方对TAMs中i NOS、Arg-1、IL-10、IL-12、TGF-β基因表达的影响,Western Blot检测至真方作用后TAMs中Arg-1及STAT3表达情况,ELISA检测至真方干预后TAMs分泌TGF-β、IL-10、IL-12水平的变化;(3)构建移植瘤小鼠模型,随机分为对照组、5-FU组、ZZF组、ZZF+5-FU组,采用免疫组化检测瘤体内ABCG2和Arg-1的表达,ELISA检测血清中IL-10、IL-12、TGF-β炎性因子的表达,流式细胞术检测瘤体组织中TAMs的占比;(4)至真方干预TAMs后,采用Western Blot检测HCT-116细胞耐药蛋白及Hedgehog信号通路相关蛋白的变化、流式细胞术观察HCT-116细胞凋亡的改变。结果(1)经过IL-4诱导建立TAMs模型,q RT-PCR结果显示TAMs中Arg-1、CD206m RNA表达与RAW264.7组相比均升高(P<0.01)。Western Blot检测结果,TAMs与HCT-116共培养组与HCT-116组相比较,耐药蛋白P-gp、ABCG2表达明显升高(P<0.01)。流式结果提示,HCT-116对照组凋亡率为(16.54±3.48)%,HCT-116+TAMs组凋亡率为(10.19±2.01)%,HCT-116+TAMs组凋亡率明显低于HCT-116组(P<0.01)。Western Blot结果示,HCT-116+TAMs组Hedgehog信号通路关键蛋白Ptch1、Gli1表达,明显较HCT-116对照组Ptch1、Gli1蛋白表达升高(P<0.01)。(2)CCK-8结果示,ZZF对TAMs具有明显的生长抑制作用,随着浓度的升高对TAMs生长抑制作用越明显。q RT-PCR结果显示,与TAMs对照组相比,ZZF中、高剂量干预组,TAMs中i NOS m RNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);Arg-1 m RNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);ZZF低、中、高剂量干预组,TAMs中IL-10 m RNA表达水平明显降低(P<0.01);ZZF中、高剂量干预组,IL-12 m RNA表达水平明显升高(P<0.05);与TAMs对照组相比,ZZF高剂量干预组,TAMs中TGF-βm RNA表达水平明显降低(P<0.05)。Western Blot结果提示,TAMs组与RAW264.7组比较,TAMs中标志性蛋白Arg-1蛋白升高(P<0.01),使用ZZF干预后,Arg-1表达水平降低(P<0.05)。ELISA结果显示,TAMs分泌的TGF-β水平明显高于RAW264.7巨噬细胞(P<0.01),ZZF低、中、高剂量干预后,TGF-β水平均明显降低(P<0.01);TAMs分泌的IL-10水平明显高于RAW264.7巨噬细胞(P<0.05),ZZF低、中、高剂量干预后,IL-10水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);TAMs分泌的IL-12水平明显低于RAW264.7巨噬细胞(P<0.01),ZZF中、高剂量干预后,IL-12水平升高(P<0.05,P<0.01)。Western Blot结果提示,ZZF低、中、高剂量干预组与TAMs组相比,STAT3信号通路关键蛋白p-STAT3的表达明显降低(P<0.01)。(3)与对照组比较,ZZF组瘤体大小变化不明显,5-FU组瘤体较对照组有所减小,抑瘤率为61.22%(P<0.05),ZZF+5-FU组瘤体体积明显小于对照组,抑瘤率为78.34%(P<0.01)。免疫组化示,ZZF组Arg-1表达较对照组明显下降(P<0.05),5-FU组ABCG2表达较对照组有所下降(P<0.05),ZZF+5-FU组耐药蛋白ABCG2和Arg-1表达均较对照组降低(P<0.05)。ELISA结果示,5-FU、ZZF+5-FU组小鼠外周血中TGF-β的含量与对照组相比明显降低(P<0.05);ZZF组、5-FU组与ZZF+5-FU组小鼠血清中IL-10的含量与对照组相比明显降低(P<0.05,P<0.01),ZZF+5-FU组小鼠血清中IL-12的含量与对照组相比明显升高(P<

关键词：大肠癌耐药肿瘤相关巨噬细胞 Hedgehog 至真方

至真方介导miR-30a靶向调控COX-2对人胃癌细胞侵袭迁移的影响

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至真方介导miR-30a靶向调控COX-2对人胃癌细胞侵袭迁移的影响

作者：刘小微上海交通大学

学位级别：硕士

目的:胃癌是我国发病率、死亡率第二高的癌症。大量研究发现miRNA通过调控其靶基因的表达,可能是胃癌发生发展的重要机制之一。本课题在前期研究发现至真方可改善消化道肿瘤多药耐药的基础上,从其介导miR-30a靶向调控COX-2基因的角度,... 详细信息

目的:胃癌是我国发病率、死亡率第二高的癌症。大量研究发现miRNA通过调控其靶基因的表达,可能是胃癌发生发展的重要机制之一。本课题在前期研究发现至真方可改善消化道肿瘤多药耐药的基础上,从其介导miR-30a靶向调控COX-2基因的角度,进一步探讨至真方对人胃癌细胞侵袭迁移能力的影响及作用机制。方法:(1)构建COX-2基因3’UTR区荧光素酶报告质粒,用双荧光素酶报告基因法(Duel-Luciferase)验证miR-30a可与COX-2基因3’UTR靶向结合,并抑制其荧光活性;(2)用Real-time PCR、Western blot法检测miR-30a对COX-2mRNA及蛋白水平的表达影响;(3)Transwell实验观察miR-30a对人胃癌细胞侵袭迁移的影响;(4)CCK-8法检测至真方醇提物对人胃癌细胞MKN45的48h抑制率;(5)Transwell实验观察至真方对人胃癌细胞侵袭迁移的影响;(6)用Real-time PCR、Western blot法检测至真方对miR-30a及COX-2 mRNA、蛋白水平的表达影响。结果:1、在293T细胞中,转染miR-30a模拟物组与miR-67(阴性对照)组相比,COX-2基因3’UTR的荧光活性降低(P至真方醇提物对人胃癌细胞MKN45有明显的增殖抑制作用,48h的IC、IC、IC分别是301.97μg/mL、120.79μg/mL、60.39μg/mL。5、分别用低、中、高(60、120、300μg/mL)浓度的至真方干预胃癌MKN45细胞48h后,与空白对照组(No treatment)相比,细胞的侵袭迁移细胞数减少(P至真方干预胃癌MKN45细胞48h后,与空白对照组(No treatment)相比,细胞中miR-30a的表达上调(P至真方可抑制人胃癌细胞的侵袭与迁移,其机制可能与介导miR-30a靶向调控COX-2的表达有关。

关键词：胃癌 miR-30a COX-2 至真方侵袭迁移

至真方抑制自噬改善大肠癌HCT-116/L-OHP细胞耐药性

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中国中西医结合消化杂志 2019年第2期27卷 87-91,96页

作者：王浩刘巧丽伏杰王松坡上海交通大学附属第一人民医院中医科上海200080

[目的]探讨至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药性的影响,并从自噬角度探讨至真方改善大肠癌HCT116/L-OHP耐药的可能作用机制。[方法]CCK-8及Western blot检测大肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药性;mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系检测至真方... 详细信息

[目的]探讨至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药性的影响,并从自噬角度探讨至真方改善大肠癌HCT116/L-OHP耐药的可能作用机制。[方法]CCK-8及Western blot检测大肠癌HCT116/L-OHP细胞耐药性;mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系检测至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞自噬的影响;流式细胞术检测至真方对大肠癌HCT116/L-OHP细胞凋亡诱导作用;Western blot检测至真方干预后耐药细胞自噬标志蛋白Beclin-1、SQSTM1/P62、LC3的表达。[结果]至真方可下调LC3、Beclin-1、上调SQSTM1/P62的表达(P至真方干预组随着浓度的降低,黄点(自噬体)和红点(自噬溶酶体)数量均减少(P至真方可通过抑制HCT-116/L-OHP细胞自噬活性,增加大肠癌HCT-116/L-OHP细胞凋亡率,恢复其部分敏感性。

关键词：大肠癌多药耐药至真方自噬

至真方调控M2巨噬细胞来源外泌体逆转大肠癌细胞耐药的机制研究

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中国中西医结合消化杂志 2021年第3期29卷 193-198页

作者：钱艺伟隋华韩惠杰李永静李琦王松坡上海交通大学附属第一人民医院中医科上海200080 上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科

目的:探讨至真方通过调控M2巨噬细胞来源的外泌体逆转大肠癌细胞耐药的机制。方法:采取差异超速离心法分别提取M2巨噬细胞来源的外泌体以及100μg/mL至真方醇提物预处理的M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜观察外泌体的形态,We... 详细信息

目的:探讨至真方通过调控M2巨噬细胞来源的外泌体逆转大肠癌细胞耐药的机制。方法:采取差异超速离心法分别提取M2巨噬细胞来源的外泌体以及100μg/mL至真方醇提物预处理的M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜观察外泌体的形态,Western blot鉴定外泌体的标志蛋白;通过共培养体系将HCT116细胞分为3组:对照组(HCT116+PBS)、M2型巨噬细胞来源的外泌体与HCT116细胞共培养组(HCT116+M2-Exo)、至真方醇提物预处理的外泌体与HCT116细胞共培养组(HCT116+M2-Exo-ZZF),使用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测耐药蛋白、凋亡蛋白表达。结果:M2型巨噬细胞在体外成功诱导(P至真方醇提物预处理后,肿瘤细胞增殖率减弱(P至真方醇提物能够干预M2型巨噬细胞外泌体,使肿瘤细胞增殖减弱,促进肿瘤细胞凋亡并影响耐药蛋白表达从而降低结肠癌HCT116细胞对5-Fu的耐药性。

关键词：大肠癌 M2巨噬细胞外泌体至真方耐药

至真方调控Hedgehog/ABCG2信号途径改善大肠癌细胞的多药耐药性

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中国中西医结合消化杂志 2018年第3期26卷 270-274页

作者：段佩雯王浩伏杰王松坡上海交通大学附属第一人民医院中医科上海200080

[目的]探讨至真方醇提物(ZZR)对大肠癌多药耐药细胞HCT-8/5-FU细胞耐药性的改善作用,并从Hedgehog/ABCG2信号途径探讨至真方改善大肠癌多药耐药的可能作用机制。[方法]高效液相色谱法鉴定至真方醇提物中的5种主要成分;CCK-8法检测大肠... 详细信息

[目的]探讨至真方醇提物(ZZR)对大肠癌多药耐药细胞HCT-8/5-FU细胞耐药性的改善作用,并从Hedgehog/ABCG2信号途径探讨至真方改善大肠癌多药耐药的可能作用机制。[方法]高效液相色谱法鉴定至真方醇提物中的5种主要成分;CCK-8法检测大肠癌多药耐药细胞HCT-8/5-FU的多药耐药性及至真方对其耐药性的改善作用;应用Real-Time PCR和western blot方法分别从基因和蛋白水平检测至真方对Hedghog/ABCG2信号途径的调节作用。[结果]HCT-8/5-FU细胞有明显多药耐药性,至真方醇提物干预HCT-8/5-FU细胞48h后,能增加其对不同化疗药物(5-FU、L-OHP、Taxol)的敏感性,且Hedgehog通路上关键因子-Gli1与ABCG2的mRNA相对表达量均明显下调(P至真方醇提物能够有效改善HCT8/5-FU细胞多药耐药,其机制可能与抑制Hedgehog信号通路活性从而降低ABCG2蛋白表达有关。

关键词：大肠癌多药耐药至真方 Hedgehog/ABCG2

至真方对人大肠癌细胞株HCT8/VCR多药耐药的逆转作用及P-gp表达的影响

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现代生物医学进展 2010年第7期10卷 1242-1246页

作者：陈志霞孔令春孙玉舫王松坡上海交通大学附属第一人民医院中医科上海200080

目的:研究至真方对大肠癌耐药细胞株HCT-8/VCR的逆转作用及P糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法:MTT法测定至真方含药血清对HCT-8/VCR细胞株的逆转作用,并以流式细胞术测定P-gp的表达。结果:经至真方含药血清作用72h后,HCT-8/VCR细胞株对化... 详细信息

目的:研究至真方对大肠癌耐药细胞株HCT-8/VCR的逆转作用及P糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法:MTT法测定至真方含药血清对HCT-8/VCR细胞株的逆转作用,并以流式细胞术测定P-gp的表达。结果:经至真方含药血清作用72h后,HCT-8/VCR细胞株对化疗的耐药性显著下降,对长春新碱逆转指数为0.937±0.093,其逆转倍数大于13.6倍,与维拉帕米比较无统计学差异(P>0.05)。HCT-8/VCR细胞的P-gp表达显著高于HCT-8(P至真方含药血清作用后P-gp表达显著降低(P至真方可以逆转人大肠癌耐药细胞株HCT-8/VCR的多药耐药性,其机制可能与其下调P-gp的表达有关。

关键词：至真方药耐药大肠癌 P糖蛋白

至真方对人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR中核因子-κB及P糖蛋白表达的影响

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中国中西医结合消化杂志 2011年第6期19卷 389-393页

作者：张旭蔡松柏陈志霞孔令春王松坡上海交通大学附属第一人民医院中医科上海200080

[目的]从核因子-κB(NF-κB)途径研究至真方对大肠癌多药耐药(MDR)细胞株———人大肠癌细胞株及长春新碱细胞株(HCT-8/VCR)的逆转作用及P糖蛋白(P-gp)表达的影响。[方法]CCK-8法测定HCT-8/VCR的MDR性及至真方含药血清对HCT-8/VCR细胞... 详细信息

[目的]从核因子-κB(NF-κB)途径研究至真方对大肠癌多药耐药(MDR)细胞株———人大肠癌细胞株及长春新碱细胞株(HCT-8/VCR)的逆转作用及P糖蛋白(P-gp)表达的影响。[方法]CCK-8法测定HCT-8/VCR的MDR性及至真方含药血清对HCT-8/VCR细胞株的逆转作用;Real-time PCR及Western blot检测NF-κB/p65、MDR1mRNA,NF-κB/p65、P-gp蛋白的表达。[结果]至真方含药血清可明显抑制HCT-8/VCR细胞生长。不同浓度至真方含药血清作用24h后,HCT-8/VCR细胞NF-κB/p65、MDR1mRNA及NF-κB/p65、P-gp蛋白表达均降低,且呈浓度依赖性,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P至真方对人大肠癌MDR细胞株HCT-8/VCR的逆转作用可能与其下调NF-κB、P-gp的表达相关。

关键词：至真方大肠癌多药耐药核因子-κB P糖蛋白

至真方调控Hedgehog信号通路对HCT-8/VCR多药耐药的影响

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中国中西医结合消化杂志 2015年第3期23卷 151-155页

作者：梁伟王慧君唐阳蔡松柏张旭王松坡上海交通大学附属第一人民医院中医科上海200080

[目的]探讨至真方含药血清对人大肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR多药耐药性的逆转作用,及对Hedgehog信号通路中Smo、Gli1表达的影响。[方法]CCK-8法测定细胞多药耐药性及存活率;Real-time PCR及Western blot分别从基因及蛋白水平检测P-g... 详细信息

[目的]探讨至真方含药血清对人大肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR多药耐药性的逆转作用,及对Hedgehog信号通路中Smo、Gli1表达的影响。[方法]CCK-8法测定细胞多药耐药性及存活率;Real-time PCR及Western blot分别从基因及蛋白水平检测P-gp和Hedgehog信号通路中Smo、Gli1的表达。[结果]至真方含药血清作用24h、48h后,HCT-8/VCR生存率明显降低;至真方含药血清作用24h后,HCT-8/VCR细胞P-gp(P-Glycoprotein)、Smo、Gli1基因及蛋白表达均降低,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。[结论]至真方对HCT-8/VCR的逆转作用可能与其抑制Hedgehog信号通路,下调该通路相关蛋白表达进而下调P-gp表达,增加HCT-8/VCR对化疗药物的敏感性有关。

关键词：至真方大肠癌多药耐药 Hedgehog信号通路