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自闭症相关突变对GPR50介导的线粒体自噬的影响和机制

自闭症相关突变对GPR50介导的线粒体自噬的影响和机制

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作者：黄泽平苏州大学

学位级别：硕士

目的:自闭谱系障碍综合征(Autism spectrum disorder,ASD,简称自闭症)患者脑内存在着线粒体功能异常。然而,线粒体功能障碍在ASD中的病理机制仍不清楚。实验室前期发现GPR50(G protein coupled receptor 50)可以作为线粒体自噬受体调控... 详细信息

目的:自闭谱系障碍综合征(Autism spectrum disorder,ASD,简称自闭症)患者脑内存在着线粒体功能异常。然而,线粒体功能障碍在ASD中的病理机制仍不清楚。实验室前期发现GPR50(G protein coupled receptor 50)可以作为线粒体自噬受体调控线粒体自噬,且GPR50的缺失会导致小鼠出现自闭症样行为。研究发现男性自闭症患者GPR50上存在着两个突变位点:Δ502-505、T532A,提示GPR50ASD相关的两个突变可能是ASD发病的遗传风险因素。本论文拟分析这两个ASD相关突变对GPR50作为线粒体自噬受体的功能的影响和机制,并探索其在神经发育过程中的作用。方法:首先构建GPR50 ASD相关的两个突变体的质粒,分别命名为GPR50(Δ502-505)-FLAG(*** T502TGH505)和 GPR50(T532A)-FLAG(a.a.T532 突变为A532)。实验室前期实验发现了 GPR50 的 LIR(LC3 interacting Region)位点(a.a.Y 305 WTI 308),因此构建GPR50的LIR位点突变的质粒(a.a.Y 305 WTI 308突变为A305 AAA 308),作为GPR50自噬功能障碍的阳性对照质粒,命名为mLIR8-FLAG。第一步探索GPR50 ASD两个相关突变对线粒体自噬的影响;在细胞中表达GPR50 ASD相关的两个突变体,检测其对线粒体膜蛋白的调控。在加入自噬阻断的药物,检测在阻断自噬后对线粒体膜蛋白的调控作用。随后通过细胞免疫荧光染色的方法,检测GPR50ASD相关的两个突变体对线粒体自噬的影响。自噬受体具有两个典型的作用,具有与LC3结合的结构域,通过与LC3结合招募正在组装的自噬小体;具有招募到底物的能力。通过免疫沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)的实验方法,检测GPR50 ASD相关的两个突变体与LC3的结合能力。用CCCP(Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone)诱导线粒体损伤,利用免疫荧光以及细胞线粒体组分分离实验,检测线粒体损伤时GPR50到线粒体的招募能力。从而探索GPR50 ASD相关的两个突变体对GPR50作为线粒体自噬受体促进线粒体自噬的影响。第二步检测GPR50 ASD相关的两个突变体对线粒体功能的影响;通过检测线粒体的氧消耗率(oxygen consumption rate,OCR)的方法来检测线粒体功能。进一步通过细胞内活性氧、ATP(Adenosine 5’-triphosphate)和线粒体膜电位的变化来检测线粒体的功能。提取小鼠原代神经元,利用TMRE染色检测GPR50ASD两个相关突变对神经元线粒体膜电位的作用,从而检测对神经元线粒体功能的作用。最后检测GPR50 ASD相关的两个突变体对神经元发育的调控;通过对神经元树突的分支和树突长度进行分析,来探索GPR50ASD相关的两个突变体对神经元树突形态发育的调控。结论:GPR50 ASD相关的两个突变体损伤了 GPR50作为线粒体自噬受体降解线粒体膜蛋白的功能;进一步探索发现GPR50 ASD相关的两个突变体减弱了 GPR50与LC3的结合能力、降低了 GPR50招募到损伤线粒体上的效率。GPR50缺失会导致线粒体功能障碍,其可被转染野生型GPR50质粒所挽救,但是不能被GPR50 ASD相关的两个突变体所挽救;GPR50缺失会导致神经树突发育障碍,其亦可被转染野生型GPR50质粒所挽救,但是不能被GPR50ASD相关的两个突变体所挽救。综上所述,GPR50 ASD相关的两个突变体通过减弱GPR50与LC3的结合、降低GPR50被招募到损伤线粒体的效率,破坏了 GPR50作为线粒体自噬受体的功能,从而导致线粒体功能障碍,继而引发神经元发育障碍。本论文提示,GPR50 ASD相关的两个突变体引发的线粒体自噬障碍可能是导致ASD发病的关键机制。

关键词：神经元发育自闭谱系障碍综合征线粒体自噬线粒体功能

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