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Hsp70蛋白自身磷酸化对其分子伴侣功能的影响

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第7期22卷 553-558页

作者：吕元明陶蕾张利能上海交通大学第六人民医院中心实验室上海200233 复旦大学上海医学院生物化学研究室上海200032

近年对分子伴侣蛋白Hsp70作用机制的研究发现,其ATP功能区域X光晶体结构有一个新的钙离子结合区域,这个新的功能区域与Hsp70分子的ADP结合、ATP水解及合成有关.有报道认为,Hsp70蛋白的NDP激酶样作用,通过形成酸不稳定性自身磷酸化中间... 详细信息

近年对分子伴侣蛋白Hsp70作用机制的研究发现,其ATP功能区域X光晶体结构有一个新的钙离子结合区域,这个新的功能区域与Hsp70分子的ADP结合、ATP水解及合成有关.有报道认为,Hsp70蛋白的NDP激酶样作用,通过形成酸不稳定性自身磷酸化中间体催化γ-磷酸基团在ATP和ADP间传递,组氨酸H89与这个新的区域有密切关系,有可能与Hsp70蛋白形成自身磷酸化中间体有关.本研究运用基因定位诱导突变技术,将89位组氨酸以丝氨酸替代(H89S),通过比较Hsp70野生型及突变型蛋白的自身磷酸化过程的改变,及其对Hsp70蛋白体外荧光素酶活性影响的不同,初步探讨Hsp70作用机制.结果发现,突变的H89S蛋白自身磷酸化过程及体外变性荧光素酶重折叠受到抑制.野生型蛋白未受到影响,野生型Hsp70可以形成酸不稳定的自身磷酸化中间体,产生CDP依赖性解磷酸反应,而H89S突变型蛋白不能形成这种反应.89位组氨酸点突变能显著降低ATP酶交换反应及体外变性荧光素酶重折叠水平,但它的自身磷酸化可能并非唯一必需的介导位点或只是一个选择性的功能侧链.

关键词： Hsp70 自身磷酸化 ATP合成及分解荧光素酶再折叠

点突变对HSP70蛋白自身磷酸化和ATP反应的影响

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上海第二医科大学学报 2005年第9期25卷 925-927页

作者：吕元明王瑛高锋上海交通大学第六人民医院临床试验中心上海200233

目的通过比较HSP70野生型和突变型蛋白的自身磷酸化及ATP分解合成反应的不同,探讨HSP70的作用机制。方法运用基因定位诱导突变技术,将89和227位组氨酸分别替代以丝氨酸(H89S,H227S),分析野生型和突变型HSP70蛋白的自身磷酸化过程,对两... 详细信息

目的通过比较HSP70野生型和突变型蛋白的自身磷酸化及ATP分解合成反应的不同,探讨HSP70的作用机制。方法运用基因定位诱导突变技术,将89和227位组氨酸分别替代以丝氨酸(H89S,H227S),分析野生型和突变型HSP70蛋白的自身磷酸化过程,对两种蛋白的ATP分解和合成变化进行研究。结果突变的H89S蛋白自身磷酸化、ATP分解和合成受到抑制,有剂量反应关系存在;野生型和H227S蛋白的ATP交换过程未受到影响。结论89位组氨酸点突变能显著降低ATP酶交换反应,但它的自身磷酸化可能并非必须的介导位点或只是一个选择性的功能侧链。

关键词： HSP70 自身磷酸化 ATP合成和分解

脑缺血诱导Ca2＋／CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的抑制作用

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生物化学与生物物理学报 1994年第1期 119-122页

作者：张光毅唐放鸣赵昇皓徐州医学院生化教研室

脑缺血诱导Ｃａ２＋／ＣａＭ依赖性蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的抑制作用张光毅，唐放鸣，赵昇皓（徐州医学院生化教研室，２２１００２）关键词脑缺血；Ｃａ２＋／ＣａＭ依赖性蛋白激酶Ⅱ；自身磷酸化兴奋住氨基酸通过其突触后膜受体导致ｏ... 详细信息

脑缺血诱导Ｃａ２＋／ＣａＭ依赖性蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的抑制作用张光毅，唐放鸣，赵昇皓（徐州医学院生化教研室，２２１００２）关键词脑缺血；Ｃａ２＋／ＣａＭ依赖性蛋白激酶Ⅱ；自身磷酸化兴奋住氨基酸通过其突触后膜受体导致ｏｄｅ内流，不仅具有诱导和...

关键词：脑缺血 Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ 自身磷酸化

人红细胞胰岛素受体自身磷酸化的酶联免疫吸附测定

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中华内分泌代谢杂志 1998年第6期14卷 373-376页

作者：朱宁王嘉仪田恩江汤新之天津医科大学生化教研室

目的建立人红细胞胰岛素受体自身磷酸化测定法。方法应用合成的磷酸酪氨酸钥孔帽贝血蓝蛋白（ＰＹＫＬＨ）免疫家兔得到抗血清，将纯化的抗磷酸酪氨酸抗体作为第一抗体，羊抗兔Ｉｇ酶结合物（辣根过氧化物酶标记）作为第二抗体，建... 详细信息

目的建立人红细胞胰岛素受体自身磷酸化测定法。方法应用合成的磷酸酪氨酸钥孔帽贝血蓝蛋白（ＰＹＫＬＨ）免疫家兔得到抗血清，将纯化的抗磷酸酪氨酸抗体作为第一抗体，羊抗兔Ｉｇ酶结合物（辣根过氧化物酶标记）作为第二抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定法。结果批内变异系数为８．４％，批间变异系数为９．０％。２０例健康人的红细胞ＩＲ的自身磷酸化活性，测定值为０．１５０±０．０２２ｎｍｏｌＰＹ／ｍｇ受体蛋白。在体外，胰岛素在１０－６ｍｏｌ／Ｌ时对自身磷酸化达到最大激活。结论用酶免法测定人红细胞胰岛素受体灵敏、特异、简便，为胰岛素作用机制的理论研究、胰岛素受体基因突变的检测和糖尿病及其它胰岛素抵抗综合症的病因及治疗的探讨提供了有效的方法。

关键词：胰岛素受体自身磷酸化胰岛素抵抗抗体

热性惊厥对大鼠海马钙调蛋白激酶Ⅱ磷酸化状态和学习记忆的影响

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热性惊厥对大鼠海马钙调蛋白激酶Ⅱ磷酸化状态和学习记忆的影响

作者：周慧华中科技大学

学位级别：硕士

目的：在热性惊厥（FS）导致神经损伤的过程中海马是一个重要区域。钙调蛋白依赖激酶Ⅱ（CaMKII）的磷酸化状态调节着神经可塑性和meta可塑性，但其在热性惊厥下如何发挥作用尚不清楚。方法：大鼠出生后第10-12天（P10-P12）以吹风... 详细信息

目的：在热性惊厥（FS）导致神经损伤的过程中海马是一个重要区域。钙调蛋白依赖激酶Ⅱ（CaMKII）的磷酸化状态调节着神经可塑性和meta可塑性，但其在热性惊厥下如何发挥作用尚不清楚。方法：大鼠出生后第10-12天（P10-P12）以吹风机为热源建立FS模型，根据其惊厥频率分为惊厥Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、对照组;P60天用western blot检测不同分期大鼠海马CaMKII的表达以及其磷酸化状态。P60天利用水迷宫检测不同组大鼠的学习记忆能力。结果：不同惊厥分期大鼠海马CaMKII的表达以及T286磷酸化状态与对照组相比均无差异，但惊厥组大鼠海马CaMKII T305的表达与对照组有显著差异;水迷宫实验惊厥II期大鼠与对照组无差异，但惊厥I期和III期大鼠在P60-P61天与对照组相比有显著差异，P62-63天则无差别。结论：发育期惊厥改变了大鼠海马CaMKII的T286和T305位点磷酸化平衡状态,但不影响酶本身的表达;热性惊厥影响大鼠的学习能力，但大鼠的记忆能力则与对照组无显著差异。

关键词：热性惊厥钙调蛋白激酶Ⅱ T286 T305 自身磷酸化学习和记忆

骨科疾病与非受体酪氨酸激酶家族激酶关系研究进展

同方学位论文库评论

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同方学位论文库

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中华实验外科杂志 2013年第12期30卷 2766-2768页

作者：胡超蔡林武汉大学中南医院骨科 430071

非受体酪氨酸激酶（Src）家族激酶（SFKs）由Lyn、Hck、Lck、Blk、Src、Yes、Fyn、Fgr、Brk、Frk和Srm共11个成员组成.它们构型相似,有相同的功能域,共同参与细胞的转化以及细胞内信号传递过程,具有重要的生理功能[1-5].其中,Src蛋白是... 详细信息

非受体酪氨酸激酶（Src）家族激酶（SFKs）由Lyn、Hck、Lck、Blk、Src、Yes、Fyn、Fgr、Brk、Frk和Srm共11个成员组成.它们构型相似,有相同的功能域,共同参与细胞的转化以及细胞内信号传递过程,具有重要的生理功能[1-5].其中,Src蛋白是目前研究最多的成员,也是与人类疾病联系最为密切的蛋白[6-8].现就近年来关于SFKs特别是Src蛋白与骨科常见疾病的相关性予以综述.Src蛋白的结构与功能：Src蛋白有至少7个不同功能的结构域.C端区域具有Tyr527调控残基,此残基磷酸化或去磷酸化可调节Src蛋白的活性;SH1区是一个双裂结构,是Src蛋白催化区域,三磷酸腺苷（ATP）与铰链区结合发生自身磷酸化,可触发激酶的活性;SH2区与SH1结构域通过一段富含脯氨酸的SH2激酶链接区相邻,SH2区与C端Tyr527的结合可抑制激酶本身的活性;SH3区具有与富含脯氨酸序列蛋白结合的特性;SH4与SH3区之间有一段区分SFKs成员的特殊区域,其生物学功能暂不明确;SH4区位于N端,包含蛋白质棕榈化和豆蔻酰化的位点,这些位点的改变可使Src蛋白锚定于质膜内侧.

关键词：受体酪氨酸激酶骨科疾病家族细胞内信号传递 c蛋白去磷酸化 Src 自身磷酸化

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甲磺酸伊马替尼合成路线图解

中国医药工业杂志 2008年第10期39卷 786-788页

作者：付利强王鹏程卯生赵冬梅沈阳药科大学制药工程学院沈阳华泰药物研究有限公司辽宁沈阳110016

甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate，1），化学名为4-[（4-甲基-1-哌嗪基）甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-（3．吡啶基）-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐，是瑞士Novartis公司研发的Bcr—Abl酪氨酸激酶受体抑制剂，2001年首次在美国上... 详细信息

甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate，1），化学名为4-[（4-甲基-1-哌嗪基）甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-（3．吡啶基）-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐，是瑞士Novartis公司研发的Bcr—Abl酪氨酸激酶受体抑制剂，2001年首次在美国上市，商品名Gleevec。本品可通过竞争结合ATP位点，特异性阻止酪氨酸激酶受体自身磷酸化，影响细胞信号转导，

关键词：甲磺酸盐合成路线图解酪氨酸激酶受体细胞信号转导受体抑制剂自身磷酸化苯甲酰胺竞争结合

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的分子调节与突触可塑性

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中国药理学通报 2014年第7期30卷 897-901页

作者：贺文彬张俊龙于龙川陈乃宏脑藏象学山西省高等学校重点实验室山西中医学院基础医学院山西太原030024 天然产物活性物质与功能国家重点实验室中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050 北京大学生命科学学院北京100871

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是一种在学习和记忆形成机制中具有重要作用的蛋白激酶,它存在于大多数组织中,但以神经元中表达量最高。大多数具有激酶活性的蛋白分子在组织中的表达量... 详细信息

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是一种在学习和记忆形成机制中具有重要作用的蛋白激酶,它存在于大多数组织中,但以神经元中表达量最高。大多数具有激酶活性的蛋白分子在组织中的表达量都相对较低,所以CaMKⅡ在神经系统中高度表达具有其特殊意义。该文将较为全面的对CaMKⅡ的分子结构与自身磷酸化特征、亚细胞空间定位及其在突触可塑性中的作用进行综述。

关键词：钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ 自身磷酸化亚细胞空间定位突触可塑性长时程增强学习和记忆

热休克蛋白Hsp70 ATP-ADP转换活性及分子伴侣功能研究

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热休克蛋白Hsp70 ATP-ADP转换活性及分子伴侣功能研究

作者：曲宁厦门大学

学位级别：硕士

热休克蛋白是细胞受热等因素刺激后诱导产生的蛋白质,是在生物进化中高度保守的蛋白质分子家族,广泛存在于从原核到真核各种生物细胞内,后来研究证明热休克蛋白在正常生理条件下亦表达并起重要作用,其作为分子伴侣参与未折叠新生多肽链... 详细信息

热休克蛋白是细胞受热等因素刺激后诱导产生的蛋白质,是在生物进化中高度保守的蛋白质分子家族,广泛存在于从原核到真核各种生物细胞内,后来研究证明热休克蛋白在正常生理条件下亦表达并起重要作用,其作为分子伴侣参与未折叠新生多肽链、多蛋白复合物的组装和跨膜运输、转位、蛋白质降解,细胞内蛋白质合成后的加工等一系列生物活动,保护细胞生存。 Hsp70是热休克蛋白家族中最重要的一员,其诱导性显著,合成量较多。Hsp70功能发挥可能依赖ATP的结合、ATP-ADP的转换或Hsp70的自身磷酸化所引起构象的变化,进而引起的底物结合和释放。Hsp70蛋白家族具有一个共同的三级结构:N端高度保守ATPase功能域和C端底物结合功能域。Hsp70N端44-kD的ATPase功能域存在微弱的ATP水解活性,后来发现Hsp70不仅存在ATP水解活性还存在ATP合成活性,Hsp70表现的是ATP-ADP转换活性。本实验首先以牛脑Hsp70为研究对象,确定Hsp70 ATP-ADP转换活性发生部位。用糜蛋白酶酶切Hsp70,获得了稳定的44-kD片段,用C14标记的[14C]ATP生成[14C]ADP的量测定ATPase活性;反过来由[14C]ADP生成[14C]ATP的量测定ATP合成酶活性。为获得准确的结论排除NDP激酶可能对实验的影响,按照纯化Hsp70 44-kD片段的方法对等物质量NDP激酶和Hsp70混合物进行酶切、纯化,检测得到的44-kD片段的ATP-ADP转换活性,确定Hsp70 ATP-ADP转换活性是Hsp70自身固有的,位于其N端44-kD片段处。 Hsp70与NDP激酶相似通过形成酸或碱不稳定自身磷酸化中间体催化γ-磷酸基团在ATP和ADP间传递。本实验研究了酸稳定的磷酸中间体的生成。纯化后的Hsp70、44-kD蛋白片段与标记的[γ-32P] ATP反应,SDS-PAGE后在酸性条件下处理凝胶,Hsp70与44-kD蛋白片段的放射自显影图谱都显示酸稳定的自身磷酸化,推测可能是丝/苏氨酸磷酸化。用CNBr裂解磷酸化的44-kD蛋白片段,磷酸化片段位于裂解后的12-kD片段,氨基酸测序为Lys128-Met237。赖氨酰肽链内切酶酶切、反相分离、氨基酸测序确定磷酸化位点为204位苏氨酸,与大肠杆菌Hsp70---DnaK的199位苏氨酸磷酸化一致。人Hsp70与牛Hsp70无论氨基酸序列还是三级结构都存在高度同源性。本实验选择人Hsp70中两金属结合位点的3个氨基酸来研究其对Hsp70功能的影响及作用机理。Lys71、Thr204和His227分别位于ATPase功能域两金属结合位点内,测定Hsp70K71A、T204A突变体ATP-ADP转换活性发现二者ATP-ADP的转换活性几乎完全丧失,无磷酸化中间体的形成。用变性荧光素酶的重折叠实验检测Hsp70的分子伴侣功能,Hsp70K71A、T204A突变体体外帮助变性荧光素酶的重折叠功能受到抑制。H227S突变体的ATP-ADP的转换活性几乎完全丧失,但是其磷酸化中间体未受影响,而且体外帮助变性荧光素酶的重折叠功能比野生型Hsp70稍有降低。ADP部分抑制了野生型Hsp70变性荧光素酶的重折叠,但是对第二个金属结合位点的H227S突变体的重折叠功能没有影响,进一步证实第二个金属结合位点可能与ADP结合相关。

关键词：热休克蛋白70 ATP-ADP转换自身磷酸化分子伴侣