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作者：张由美苏州大学

学位级别：硕士

目的研究芍药苷对PC12细胞的保护作用,并探讨其对自噬-溶酶体通路的影响。方法环境毒素MPP+诱导PC12细胞损伤,同时给予芍药苷进行干预,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）、乳酸脱氢酶（LDH）和流式细胞技术检测细胞存活率、损伤... 详细信息

目的研究芍药苷对PC12细胞的保护作用,并探讨其对自噬-溶酶体通路的影响。方法环境毒素MPP+诱导PC12细胞损伤,同时给予芍药苷进行干预,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）、乳酸脱氢酶（LDH）和流式细胞技术检测细胞存活率、损伤程度、凋亡率及细胞内游离钙离子浓度的变化,Western blot检测细胞内LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Lamp2a蛋白表达水平的变化。结果 MPP+处理24 h,PC12细胞的存活率显著降低（P＜0.001）,漏出至上清液中的LDH较正常对照组显著增多（P＜0.001）,同时细胞凋亡率也显著升高（P＜0.001）,细胞内钙离子浓度增加（P＜0.01）。芍药苷（50μmol·L-1）提高了PC12细胞的存活率（P＜0.001）,减少了LDH的漏出（P＜0.001）,降低了细胞凋亡率（P＜0.001）,抑制了钙内流（P＜0.01）。Western blot显示MPP+处理导致LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达水平显著降低,分别是正常水平的0.64±0.05倍（P＜0.01）和0.58±0.10倍（P＜0.01）,同时Lamp2a蛋白表达升高至正常水平的1.34±0.14倍（P＜0.05）,而芍药苷能够显著提高LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达水平（P＜0.05）,并抑制了Lamp2a的异常激活（P＜0.001）结论芍药苷对PC12细胞具有明显的保护作用,并能拮抗MPP+对自噬-溶酶体通路的影响。

关键词：芍药苷自噬-溶酶体通路 PC12细胞

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TET3保护SAH后自噬-溶酶体通路完整性

TET3保护SAH后自噬-溶酶体通路完整性

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第十八届中国医师协会神经外科医师年会

作者：丁鹏飞杭春华南京医科大学鼓楼临床医学院

目的蛛网膜下腔出血(SAH)是一种常见的急性和严重的神经外科疾病。其引起的早期脑损伤(EBI)是影响患者预后的重要因素。减少神经元凋亡是治疗EBI的关键,但目前缺乏较有效的方法。以往的研究表明,完整的自噬-溶酶体通路(ALP)可以有效保... 详细信息

目的蛛网膜下腔出血(SAH)是一种常见的急性和严重的神经外科疾病。其引起的早期脑损伤(EBI)是影响患者预后的重要因素。减少神经元凋亡是治疗EBI的关键,但目前缺乏较有效的方法。以往的研究表明,完整的自噬-溶酶体通路(ALP)可以有效保护缺血性卒中的神经元存活。然而,SAH后ALP是否完整尚不得而知,其中潜在的机制研究仍然缺乏。方法通过血红蛋白(Hb)构建SAH体外模型。通过Western blot(WB)检测Con、和Hb分别刺激3h、6h、12h、24h和48h的LC3Ⅱ/Ⅰ比值和P62的表达水平。使用自噬上游抑制剂3-MA和自噬下游抑制剂CQ分别进行干预,再次通过WB检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值和P62的表达水平。通过WB检测LAMP1和mCTSD/pro-CTSD的比值,检测SAH后溶酶体功能。通过免疫荧光检测LAMP1和CTSD在神经元上的表达并计算LAMP1和CTSD的共定位系数判断SAH后溶酶体功能。通过qpcr和WB检测SAH后TET3 m RNA和蛋白表达水平。通过MSigDB数据库和Chip-seq数据分析TET3的功能。通过维生素C激活TET3酶活性再通过WB检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62、LAMP1和m-CTSD/pro-CTSD的比值。结果 WB结果显示在Hb刺激神经元24h后,LC3Ⅱ/Ⅰ和P62的表达水平都出现了显著升高,提示SAH后自噬流受到抑制。3-MA显著降低了SAH后升高的LC3Ⅱ/Ⅰ,造成了P62的进一步累积。CQ虽然促进P62的积累,但是对LC3Ⅱ/Ⅰ无明显改变,这提示SAH后溶酶体功能受损。WB结果确认LAMP1和m-CTSD/pro-CTSD在SAH后下降。免疫荧光结果显示LAMP1和CTSD的共定位系数下降。qpcr和WB检测结果证明TET3的mRNA和蛋白表达水平都在SAH后发生了下降。MSigDB通路分析显示TET3主要参与溶酶体功能,并且Chipseq数据分析显示TET3富集在LAMP1和CTSD的转录起始位点。通过维生素C激活TET3酶活性之后,LC3Ⅱ/Ⅰ和P62显著下降,LAMP1和m-CTSD/proCTSD显著升高。结论 SAH后TET3表达的减少,导致ALP受损,自噬流受到抑制,自噬小体增加。维生素C激活TET3可在一定程度上改善SAH后的ALP功能。

关键词：蛛网膜下腔出血 TET3 神经元自噬-溶酶体通路

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恩格列净通过自噬-溶酶体途径改善糖尿病肾病小鼠肾组织损伤

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中国药理学通报 2023年第10期39卷 1938-1943页

作者：杨帆张亚京张晓云刘利飞黄家安王月华河北中医药大学中西医结合学院河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室河北中医药大学药学院河北中医药大学中医临床技能中心河北石家庄050091

目的探讨恩格列净对糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)小鼠肾脏保护作用及自噬-溶酶体通路的影响。方法db/m小鼠作为正常组(Control),db/db小鼠随机分为模型组(Model)、恩格列净组(Empagliflozin)。给药8周,检测小鼠24 h尿蛋白定... 详细信息

目的探讨恩格列净对糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)小鼠肾脏保护作用及自噬-溶酶体通路的影响。方法db/m小鼠作为正常组(Control),db/db小鼠随机分为模型组(Model)、恩格列净组(Empagliflozin)。给药8周,检测小鼠24 h尿蛋白定量(24 h urine protein,24 h-UTP)、血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HBA1c)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Scr)、血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemokine-1,MCP-1)水平;Western blot检测肾组织p62、LC3B、Beclin1、Agt7、LAMP1、Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表达;光镜观察肾脏病理变化。结果与Control组比较,Model组小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,囊腔变窄,间质炎性细胞浸润及纤维化(P自噬-溶酶体通路,促进自噬底物降解,抑制炎症因子产生,进而抑制细胞凋亡,从而减轻肾脏损伤。

关键词：糖尿病肾病恩格列净自噬-溶酶体通路炎症凋亡分子机制

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加减补阳还五汤通过激活自噬促进Nrf2核转移改善糖尿病肾病足细胞损伤

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中药药理与临床 2024年

作者：杨帆张晓云娄菲菲马赟黄家安刘利飞赵炳武王月华河北中医药大学河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室河北省人民医院河北省中医院

目的：探讨加减补阳还五汤是否通过激活自噬促进核因子E2相关因子2（Nrf2）核转移改善糖尿病肾病（DKD）小鼠足细胞损伤。方法：选取11-12周龄的db/db小鼠24只，经适应性喂养1周并检测尿蛋白均阳性后，随机分为模型对照组、加减补阳还五... 详细信息

目的：探讨加减补阳还五汤是否通过激活自噬促进核因子E2相关因子2（Nrf2）核转移改善糖尿病肾病（DKD）小鼠足细胞损伤。方法：选取11-12周龄的db/db小鼠24只，经适应性喂养1周并检测尿蛋白均阳性后，随机分为模型对照组、加减补阳还五汤16 g/kg组、雷帕霉素-海藻糖组，同时设立db/m组小鼠作为正常对照组，每组8只，连续给药8周。检测小鼠血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、肾损伤分子-1（KIM-1）、尿微量白蛋白（mALB）含量；HE染色观察肾脏的病理形态学；qRT-PCR法检测Wilms肿瘤基因（Wt1）、nephrin、podocin的mRNA表达；Western blot法检测小鼠肾组织P62/SQSTM1抗体、beclin1抗体、微管相关蛋白1轻链3-II抗体（LC3-II）、溶酶体相关膜蛋白1抗体（LAMP1）、Nrf2、Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）、醌氧化还原酶1（NQO-1）、血红素加氧酶-1（HO-1）的表达；免疫荧光观察Nrf2核转移变化。结果：与正常对照组比较，模型对照组小鼠肾组织出现病理损伤，血清FBG、TC、TG、MDA、BUN、Scr、KIM-1及mALB含量显著升高，SOD、GSH-PX活力显著降低（P＜0.01），肾组织P62表达升高，LC3-II、beclin1、LAMP1表达降低（P＜0.01），Wt1、nephrin、podocin的mRNA表达降低（P＜0.01），肾组织Nrf2-Keap1通路活化（P＜0.01）；与模型对照组比较，经加减补阳还五汤干预后，DKD小鼠肾脏病理损伤改善（P＜0.01），血清TC、TG、MDA、BUN、Scr、KIM-1及mALB含量显著降低，SOD、GSH-PX活力升高（P＜0.01），肾组织P62表达降低，LC3-II、beclin1、LAMP1表达升高（P＜0.01），Wt1、nephrin、podocin的mRNA表达恢复（P＜0.01），肾组织Nrf2-Keap1通路被活化（P＜0.01）。结论：加减补阳还五汤可能通过激活DKD小鼠肾脏细胞自噬，疏通自噬通路，促进Nrf2核转移，抑制氧化应激，保护足细胞，降低尿蛋白排泄，改善DKD肾脏损伤。

关键词：加减补阳还五汤糖尿病肾脏疾病自噬-溶酶体通路核因子E2相关因子2-Kelch样ECH关联蛋白1通路足细胞

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阿米洛利通过自噬途径保护PC12细胞的研究

阿米洛利通过自噬途径保护PC12细胞的研究

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作者：张润娉苏州大学

学位级别：硕士

目的: 1观察酸处理对PC12细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、凋亡率以及胞内游离钙离子浓度的影响,并观察阿米洛利(amiloride,Ami)对酸处理所致细胞损伤的拮抗作用;2观察MPP对PC12细胞存活率、LDH漏出率、凋亡率以及胞内游离钙离子浓... 详细信息

目的: 1观察酸处理对PC12细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、凋亡率以及胞内游离钙离子浓度的影响,并观察阿米洛利(amiloride,Ami)对酸处理所致细胞损伤的拮抗作用;2观察MPP对PC12细胞存活率、LDH漏出率、凋亡率以及胞内游离钙离子浓度的影响,并观察Ami对MPP所致细胞损伤的拮抗作用;3分析酸处理及MPP对PC12细胞自噬-溶酶体通路(autophagy-lysosome pathway, ALP)的影响,并观察Ami的拮抗作用。方法: 分别用酸性(pH6.0)培养基或MPP处理PC12细胞24 h,同时给予Ami进行干预:MTT法检测细胞存活率;LDH试剂盒检测上清液中的LDH活性;流式细胞技术检测细胞凋亡率和胞内钙离子浓度;Western blot分析LC-II、LAMP2a表达水平的变化。结果: 1酸性培养液(pH6.0)处理24h,细胞存活率显著降低(P自噬活性受抑制,同时分子伴侣自噬水平代偿性升高,Ami能有效增强大自噬的活性,拮抗分子伴侣自噬的异常激活。

关键词：阿米洛利 PC12细胞自噬-溶酶体通路帕金森病

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UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用及机制研究

UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用及机制研究

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作者：李渊华中师范大学

学位级别：硕士

微管相关蛋白tau的主要功能是促进微管的组装,维持微管的稳定性。神经元内出现tau蛋白异常聚集体是阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)的主要神经病理学特征之一,且异常聚集的tau蛋白可以引起神经元的退行性改变。细胞内的tau蛋白主... 详细信息

微管相关蛋白tau的主要功能是促进微管的组装,维持微管的稳定性。神经元内出现tau蛋白异常聚集体是阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)的主要神经病理学特征之一,且异常聚集的tau蛋白可以引起神经元的退行性改变。细胞内的tau蛋白主要经泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)和自噬-溶酶体通路(autophagy-lysosomal pathway,ALP)清除,这两大系统对底物的选择性降解都与底物的泛素化修饰直接相关。泛素C末端水解酶L1(Ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是去泛素化酶家族的成员之一,它在多聚泛素链的水解和泛素的循环利用过程中发挥重要作用,同时研究发现UCH-L1还具有泛素连接酶的活性,能够产生K63链接的泛素链,而K63链接的泛素链与底物蛋白的靶向结合将促进后者经自噬-溶酶体通路的降解,且该过程与K63和HDAC6的结合并激活HDAC6直接相关。本课题组前期研究也发现,细胞和小鼠海马脑片水平抑制UCH-L1的活性或表达,可引起tau蛋白磷酸化和泛素化修饰异常。但迄今尚无UCH-L1与tau蛋白聚集体清除之间的关系的直接报道。基于以上研究背景,我们拟以稳定转染人tau441异构体的人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293 cells stabling expressing human tau441,HEK293/tau441)为研究对象,探讨UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用,并以K63链接的泛素链和HDAC6为靶标,对其作用机制进行探讨。目的:探究UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用及其分子机制。方法:用蛋白酶体活性抑制剂MG132处理细胞24 hr,然后洗脱含有MG132的培养基加入新鲜的培养基继续培养细胞24 hr,最后在洗脱MG132的同时加入UCH-L1活性抑制剂LDN处理细胞24hr。上述处理结束后,利用免疫荧光技术、免疫印迹技术、免疫沉淀技术、以及HDAC6活性试剂盒检测相关的分子生化指标。结果:(1)MG132处理细胞24hr后,tau蛋白和聚集体形成标志蛋白vimentin向核周聚集形成明显的球状聚集体;洗脱MG132 12 hr后,tau蛋白和vimentin均呈现出分散表达的趋势,球状聚集体逐渐解体;洗脱MG132 24 hr后,核周的球状聚集体消失,tau蛋白和vimentin均匀分布在胞质;洗脱MG132加LDN处理细胞24 hr后,tau蛋白与vimentin在核周共定位,且在核周形成球状聚集体结构。(2)免疫印迹结果显示,与对照组相比,MG132处理组中K63含量增加(P自噬活性标记蛋白LC3-II的含量明显升高(P自噬活性降低,最终抑制tau蛋白聚集体的清除。

关键词：泛素-蛋白酶体系统自噬-溶酶体通路 tau蛋白聚集体 K63 HDAC6 UCH-L1

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阿米洛利通过自噬-溶酶体途径保护PC12细胞

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江苏大学学报（医学版） 2014年第4期24卷 359-362,368页

作者：张润娉李建平苏州高新区人民医院神经内科江苏苏州215129

目的:研究酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株的保护作用及其对自噬-溶酶体通路的影响。方法:在PC12细胞模型上,观察甲基苯基吡啶(methy-phenylpyridi,MPP+)处理对细胞存活率(MTT检测)、乳酸脱氢酶(LDH)漏... 详细信息

目的:研究酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株的保护作用及其对自噬-溶酶体通路的影响。方法:在PC12细胞模型上,观察甲基苯基吡啶(methy-phenylpyridi,MPP+)处理对细胞存活率(MTT检测)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞凋亡率的影响,并观察阿米洛利对MPP+所致细胞死亡的影响;蛋白质印迹法检测大自噬通路标志蛋白LC3和分子伴侣介导的自噬通路标志蛋白LAMP2a表达水平的变化。结果:MPP+导致细胞存活率明显降低,上清液中LDH漏出率明显升高,细胞凋亡率升高,抑制大自噬通路标志蛋白LC3-Ⅱ的表达,同时上调了分子伴侣介导的自噬通路标志性蛋白LAMP2a的表达水平;而阿米洛利可提高细胞存活率,减少上清液中LDH漏出率,降低细胞凋亡率,并能在激活大自噬通路的同时下调分子伴侣介导的自噬通路的活性。结论:阿米洛利可能通过抑制酸敏感离子通道的作用拮抗MPP+诱导的PC12细胞自噬性死亡。

关键词：阿米洛利 PC12细胞 MPP+ 自噬-溶酶体通路

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