检索结果-南通市图书馆

畜牧兽医学报 2013年第9期44卷 1487-1493页

作者：贺生芳付向晶刘阳坤慕国辉刘海金王兴龙杜恩岐杨增岐西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

为实现纳米抗体的简单、高效、低成本表达,在已有的商品化原核表达载体的基础上,对其进行改造,在靶蛋白N端分别融合3种不同串联融合标签His-intein、His-Sumo-intein和His-Trx-intein,以本实验室筛选的抗猪圆环病毒2(PCV2)Cap蛋白的纳... 详细信息

为实现纳米抗体的简单、高效、低成本表达,在已有的商品化原核表达载体的基础上,对其进行改造,在靶蛋白N端分别融合3种不同串联融合标签His-intein、His-Sumo-intein和His-Trx-intein,以本实验室筛选的抗猪圆环病毒2(PCV2)Cap蛋白的纳米抗体基因为靶蛋白,构建了pHSIE-Nb(His-Sumo-intein)、pHSIE-intein-Nb(His-intein)和pET32a-intein-Nb(His-Trx-intein)3种表达载体。分别转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,在不同表达条件下比较,选取可溶性表达最好的载体大量表达,用Ni-NTA金属螯合层析柱进行纯化,并利用intein自剪切去除标签,纯化纳米抗体。且用制备的纳米抗体作为包被抗体,做双抗体夹心ELISA检测其反应原性。结果显示3种不同融合标签的纳米抗体都可成功表达,而融合His-Trx-intein标签的载体可溶性表达量最高。融合蛋白经pH7、25℃剪切24h后可以得到不含融合标签的纳米抗体。双抗体夹心ELISA检测,统计学分析,制备的抗PCV2Cap纳米抗体蛋白包被的样品组与阳性对照组差异不显著(P>0.05),因此制备的纳米抗体是有活性的。本研究成功建立一种高效表达、纯化纳米抗体的方法,可以增加蛋白表达量、可溶性和简化蛋白纯化过程,获得具有活性的无标签的纳米抗体。为其进一步的纳米抗体理论研究和生产应用提供技术支持。

关键词：纳米抗体融合标签自剪切intein 表达纯化双抗夹心ELISA

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intein介导的纳米抗体在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

Intein介导的纳米抗体在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

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作者：贺生芳西北农林科技大学

学位级别：硕士

基因工程方法克隆骆驼重链抗体可变区(variable domain of heavychain ofheavy-chainantibody，VHH）发展出的单域抗体(Single-domain antibodies,sdAbs)，是目前世界上发现的最小的抗体。被形象地称为纳米抗体（Nanobody，Nb），具有较高的抗原结合活性，在抗病毒以及抗肿瘤治疗领域得到广泛关注。传统的大肠杆菌表达系统体外表达外源基因，往往以包涵体形式存在，蛋白需要纯化后复性，步骤多、操作复杂，且容易造成表达产物降解。通过融入可溶性表达标签，可以实现表达产物的可溶性表达，并且可以减少表达产物纯化工作。去除融合标签可以使用蛋白酶，但是蛋白酶价格高，操作技术要求高，增加了生产成本并且引入了额外的纯化步骤，限制了其在蛋白表达中的推广应用。大部分intein均具有双功能：蛋白质剪切活性和自导引核酸内切酶活性。它可与靶蛋白融合，intein的C端及N端可组装成蛋白质剪切的功能性结构域，通过温度和pH的改变使靶蛋白末端的氨基酸介导或抑制intein切割的活性。为实现利用大肠杆菌原核表达系统制备大量可溶性纳米抗体以及简化其纯化步骤，本实验通过与可溶性高的标签融合来提高靶蛋白的表达量且改善它的溶解性，同时通过构建利用自我剪切intein介导的表达系统来温和地去除融合标签。本研究主要内容和结果如下： 1.含有不同融合标签的抗猪圆环病毒2（PCV2）型Cap蛋白纳米抗体表达载体构建以本实验室构建重组质粒pMD-19T-VHH15-33为模版，利用PCR方法扩增PCV2Cap蛋白纳米抗体基因VHH15-33;在猪圆环病毒纳米抗体基因的N端分别融合3种不同串联融合标签His-intein、His-Sumo-intein和His-Trx-intein，构建了PHSIE-VHH（His-Sumo-intein）， PHSIE-intein-VHH （His-intein）和pET32a-intein-VHH（His-Trx-intein）三种表达载体。 2.三种不同融合标签His、Trx、Sumo之间可溶性比较将上一步骤构建的三种表达载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG（0.4mmol/L）分别诱导表达6h（30℃）和4h（37℃），比较三种载体的可溶性表达效果和表达量，12%SDS-PAGE电泳分析纳米抗体表达情况，分析表明Trx标签的促融效果更明显，其可溶性效果Trx＞Sumo＞His。 3. intein介导的猪圆环病毒2（PCV2）型Cap蛋白的纳米抗体蛋白的纯化以含有融合标签Trx的表达载体大量表达纳米抗体，含纳米抗体的菌体裂解上清，经Ni-NTA金属螯合层析柱吸附后（按照全式金ProteinIso Ni-NTA Resin说明书）进行重组蛋白纯化，洗脱杂蛋白，再不同条件下进行intein自裂解，结果显示在pH7温度为25℃经24h切割后VHH从融合标签intein C端处断裂下来的效率最好。纳米抗体蛋白纯度最高，能达到90%以上，浓度达到20μg/ml。 4.猪圆环病毒2（PCV2）型Cap蛋白的纳米抗体蛋白的活性检测利用双抗体夹心ELISA方法对表达纯化的VHH进行活性检测，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释制备的纳米抗体VHH15-33，包被96孔酶标板，（阳性对照组包被PCV2阳性血清）;封闭酶标板，加入倍比稀释的PCV2病毒裂解液，加入本实验制备的针对PCV2不同表位的带His标签纳米抗体VHH6-14，加入1:2000稀释的HRP标记的抗His标签的鼠源单克隆抗体;最后加入TMB显色液进行显色;2mol/L硫酸终止反应，读取OD450的值。ELISA结果可知：不同稀释度包被VHH的反应活性随着病毒裂解液的稀释均呈现递减趋势，在相同的病毒稀释度时，VHH的反应活性随其不同浓度的稀释也呈现递减趋势，在VHH稀释度在1:100而病毒稀释度在1:400时候反应最强，与阳性结果相比（P＞0.05）差异不显著。另外在VHH稀释度在1:500和1:1000而病毒稀释度在1:400时，二者反应值较为接近，P＞0.05，差异不显著，说明此时加入的病毒量全部用来和VHH反应。因此本实验建立表达纳米抗体的新方法表达制备的纳米抗体存在活性。

关键词：纳米抗体融合标签自剪切intein 表达纯化双抗体夹心ELISA

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