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生物技术通报 2015年第12期31卷 50-55页

作者：王世山陈艳可杨俊中国科学院武汉物理与数学研究所武汉磁共振中心波谱与原子分子物理国家重点实验室武汉430071

膜蛋白的结构与功能研究是当前的热点之一。目前获取膜蛋白的最主要途径是通过原核系统进行表达。但是膜蛋白在原核系统中表达水平相对较低,通过对基因序列进行优化促使膜蛋白正确高效表达是一项非常重要的技术手段。归纳了近些年来膜... 详细信息

膜蛋白的结构与功能研究是当前的热点之一。目前获取膜蛋白的最主要途径是通过原核系统进行表达。但是膜蛋白在原核系统中表达水平相对较低,通过对基因序列进行优化促使膜蛋白正确高效表达是一项非常重要的技术手段。归纳了近些年来膜蛋白原核表达技术在基因序列优化研究上的最新进展,并从稀有密码子的优化、m RNA的稳定性与翻译起始、m RNA与核糖体行为、翻译的效率与膜蛋白的折叠4个方面对基因序列上影响膜蛋白表达的因素进行了总结,旨在为膜蛋白的原核表达提供一定的思路和参考。

关键词：膜蛋白超量表达基因序列优化密码子优化 mRNA稳定性翻译速率膜蛋白折叠

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伴侣素GroEL-GroES在细菌视紫红质折叠和插膜中的作用研究

伴侣素GroEL-GroES在细菌视紫红质折叠和插膜中的作用研究

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作者：魏俊婷中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

细胞蛋白内稳态对于细胞甚至整个生命体的生存至关重要,这需要蛋白折叠、降解和转运整个过程维持动态平衡,而这种蛋白稳态受到一种被称为分子伴侣的蛋白质家族的调控。分子伴侣作为蛋白动态平衡过程中的调控因子,能够在生理和刺激条件下... 详细信息

细胞蛋白内稳态对于细胞甚至整个生命体的生存至关重要,这需要蛋白折叠、降解和转运整个过程维持动态平衡,而这种蛋白稳态受到一种被称为分子伴侣的蛋白质家族的调控。分子伴侣作为蛋白动态平衡过程中的调控因子,能够在生理和刺激条件下,阻止蛋白聚集,促进蛋白正确折叠,以及调控适当的蛋白降解,然而这些研究绝大部分都是针对水溶性蛋白的,分子伴侣体系辅助膜蛋白折叠的机制目前研究甚少。本论文中,我们利用七次跨膜蛋白细菌视紫红质（BR）作为模型蛋白,研究了BR在表面活性剂DDM胶束中折叠时伴侣素GroEL-GroES的作用机制。同时,还对伴侣素GroEL-GroES介导的BR插膜及折叠过程进行了初步研究。在第二章的研究中,对模型蛋白BR进行了表达纯化,成功制备了大量的BR,为其后续的折叠研究奠定了物质基础;还制备了伴侣素GroEL及其辅分子伴侣GroES、GroEL单环突变体SR1等蛋白,为后续实验做了准备,这是本文进行研究的实验基础。在第三章中,以BR作为底物膜蛋白,基于视黄醛UV-Vis吸收光谱,研究了GroEL、GroES、ATP不同组合对变性BR折叠动力学的影响,并与GroEL单环变体SR1作用进行对比;基于UV-Vis吸收光谱,还研究了GroEL、GroES与ATP不同组合对折叠态BR结构的影响;基于吸收光谱或荧光光谱,研究了GroEL（SR1）、GroES、ATP对模型水溶性蛋白-增强绿色荧光蛋白（EGFP）-折叠动力学的影响;基于BR的本征荧光、利用快速停留技术（stop-flow）,研究了GroEL、GroES、ATP对BR折叠动力学的影响。通过相关实验数据结果及分析,我们发现变性态BR与分子伴侣GroEL结合的亲和力高于天然态BR。单独GroEL对BR再折叠会产生显著的影响,但ATP的存在,对于同时提高GroEL介导BR折叠的速率和产率是必需的,相反,GroES存在对其折叠产量会产生不利的影响。最后,在第四章中,我们制备了大肠杆菌内膜反向囊泡,基于BR中视黄醛UV-Vis吸收光谱,研究了GroEL、GroES、ATP不同组合对变性BR插膜过程动力学的影响,并与GroEL突变体SR1的作用进行对比。我们发现GroEL-GroES还可以介导BR的插膜作用,然而,ATP和GroES之间的协同作用被证明不仅对于从GroEL上释放具有高亲和力的变性态BR所必需,而且还能够对错误折叠的蛋白进行解折叠,以迅速拯救陷入动力学陷阱的BR折叠中间体。这与观察到的使用完整的GroEL-GroES体系时BR插膜速率增强以及折叠速率最大化的结果一致。我们获得的结果支持以前针对可溶性蛋白质提出的GroEL-GroES作用的反复退火机制,其中GroEL可以进行BR的反复解折叠和释放,从而为BR再次及时正确折叠或插膜提供了机会。

关键词：分子伴侣 GroEL-GroES体系细菌视紫红质膜蛋白折叠插膜动力学

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单螺旋跨膜多肽在生物膜中取向的分子动力学模拟研究

单螺旋跨膜多肽在生物膜中取向的分子动力学模拟研究

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作者：孙明彬中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

膜蛋白在呼吸作用、神经信号传导、免疫反应等各种生命活动中具有极其重要的作用。正确的取向是跨膜蛋白具有生物活性的前提条件,但目前对于影响膜蛋白取向的因素还没有确切的答案,因此需要人们对跨膜蛋白的插膜机理及其取向进行系统的... 详细信息

膜蛋白在呼吸作用、神经信号传导、免疫反应等各种生命活动中具有极其重要的作用。正确的取向是跨膜蛋白具有生物活性的前提条件,但目前对于影响膜蛋白取向的因素还没有确切的答案,因此需要人们对跨膜蛋白的插膜机理及其取向进行系统的研究。本论文采用分子动力学模拟的方法,通过构建不同的模拟体系,系统地研究单螺旋跨膜多肽与生物膜的相互作用,且对影响其生物膜取向的因素进行了探讨,建立了一套通过研究肽链模型同磷脂双分子层膜模型相互作用过程确定肽链进膜选择性取向的方法。首先,我们将单螺旋跨膜多肽放置在生物膜的表面,通过长时间的自由分子动力学模拟,研究其自发插膜过程。研究发现跨膜肽链两端在长时间(1μs)的自发模拟过程中没有明显的进膜现象。我们推测在膜-水界面间存在一定的能垒,阻碍肽链自发进入膜内。通过改变同一初始构型的随机种子数,对肽链锚定膜的概率进行统计分析。统计结果显示,对于GPCRs家族CXCR4的第一条跨膜螺旋而言,其C端首先锚定在膜上的概率(75%)远大于N端锚定概率(8.3%),初步说明其C端相对于N端可能更容易首先进入膜内。由于自由分子动力学模拟无法获得完整的多肽插膜过程,我们在多肽的两端分别施加一定的外界拉力,使得多肽能够快速进入膜内。通过记录并比较拉动过程中拉力的大小,发现第一条肽链模型的C端拉力明显较N端要小,说明C端更容易克服水相-膜界面间能垒进入膜内。然而,在拉动肽链模拟过程中,肽链及磷脂双分子层膜的结构破坏严重。为保证在肽链及磷脂分子的构型完整的前提下,实现肽链自发进入膜内。我们将肽链两端分别不同深度地插入到膜内,并比较肽链两端后期自发进膜的临界进膜深度。发现第一条肽链模型的C端临界进膜深度相对于N端较大,即前者进入膜内较浅的一段距离后,即可实现自发插膜过程。最后,为了从热力学角度解释跨膜多肽的插膜机理和生物膜取向,我们测定了跨膜肽链在进入膜过程中的平均力势变化。通过分析自由能势能线的变化趋势,从能量角度说明C端相较于N端更容易进入膜内;并根据各个模拟体系模拟结果提出一种跨膜肽链进入过程的模型,从分子角度对模型中个各个部分进行了分析。

关键词：跨膜多肽膜蛋白折叠生物膜取向分子动力学模拟平均力势

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GroEL-GroES辅助细菌视紫红质折叠的研究

GroEL-GroES辅助细菌视紫红质折叠的研究

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作者：陆欣伟中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

蛋白质广泛参与到生物体的各项生命活动中,但是新生肽链必须折叠成特定的结构才能发挥其功能,蛋白质的错误折叠是导致许多疾病的重要原因。在许多蛋白质折叠的过程中,分子伴侣常常发挥重要的作用。来源于大肠杆菌的伴侣素GroEL及其辅因... 详细信息

蛋白质广泛参与到生物体的各项生命活动中,但是新生肽链必须折叠成特定的结构才能发挥其功能,蛋白质的错误折叠是导致许多疾病的重要原因。在许多蛋白质折叠的过程中,分子伴侣常常发挥重要的作用。来源于大肠杆菌的伴侣素GroEL及其辅因子GroES,是一类非常关键的分子伴侣,许多研究已经证明分子伴侣GroEL-GroES能够辅助多种水溶性蛋白的折叠。近期,本课题组的研究表明,分子伴侣GroEL-GroES也能辅助膜蛋白的折叠,对于膜蛋白的产量及活性都有着明显的促进作用,这一发现对于膜蛋白的合成具有重要的意义。目前对于GroEL-GroES如何辅助膜蛋白的折叠还不清楚,因此难以对这一折叠过程进行进一步的调控。本论文以具有七次跨膜α-螺旋结构的细菌视紫红质为模型,研究GroEL-GroES辅助膜蛋白折叠的过程,期望在阐明这一折叠过程的同时,为调控膜蛋白的折叠提供实验基础。本论文中,我们利用单分子荧光技术,考察了GroEL-GroES在细菌视紫红质折叠中的作用机制,包括其对细菌视紫红质折叠/去折叠中分子构象动态变化的影响。第2章,我们在实验室前期的工作基础上,成功制备了细菌视紫红质BR(0CV130C)、脱辅基细菌视紫红质BO(0C-249C)两个双定点突变体,利用荧光染料AF488和AF647对突变体蛋白进行荧光双标记,对标记后的蛋白样品表征的结果表明双标记成功。还成功制备了GroEL、GroES等蛋白,为下一步利用单分子荧光共振能量转移(sm-FRET)、荧光相关光谱(FCS)等技术研究GroEL-GroES对细菌视紫红质折叠的影响奠定了基础。第3章,我们探索了GroEL/GroES/ATP的不同组合与变性态BR(0C-V130C)和天然态BR(0C-V130C)相结合的动力学和热力学情况,发现ATP作为激活剂,能大大促进GroEL与变性态底物蛋白BR的疏水结合,从而促进对变性态蛋白的重折叠。同时,我们认为ATP、GroES和ATP-GroES能够分别对GroEL的结构产生不同的影响,导致GroEL对特定底物亲和性的变化。热力学实验表明,变性态BR与分子伴侣GroEL结合的亲和力高于天然态BR。第4章,我们利用荧光相关光谱法研究了BR分子自发复性、在GroEL辅助下复性以及GroEL-GroES介导下的BR复性。发现变性态BR分子自发复性时很容易发生聚集,这不利于其折叠成正确的天然状态。分子伴侣GroEL能与容易聚集的变性态BR结合,并且疏散聚集态BR分子。而GroEL-GroES同时存在时,对聚集态的BR分子疏散作用更为明显。GroEL-GroES通过结合BR折叠中间体,减少非天然态BR聚集,从而更有利于底物蛋白折叠成其天然状态。同时,利用单分子荧光共振能量转移技术对BO突变体折叠/去折叠中分子构象的动态变化进行表征,发现BO分子去折叠过程中存在多个不同的集合。BO分子自发复性过程缓慢且复性产率低。GroEL介导BO复性过程中,复性速率有所提高,但是复性产率很低。辅因子GroES和激活剂ATP的合作可以更大化地疏散聚集的BO,从而最大程度地提高变性态BO的折叠速率和折叠效率,并可以再生GroEL活性,促进变性态BO重折叠。

关键词：伴侣素细菌视紫红质单分子荧光共振能量转移荧光相关光谱膜蛋白折叠构象转变

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