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日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的生物信息学鉴定与分析

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南方医科大学学报 2007年第3期27卷 272-275页

作者：杨忠胡薇苏谨马骊李亦学冯正魏东芝华东理工大学生物反应器国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所上海200025 南方医科大学分子免疫学研究所广东广州510515 上海生物信息技术研究中心上海200235

目的鉴定日本血吸虫中存在的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,分析其蛋白结构特征。方法采用双向同源比对、结构域搜索和系统发育分析等生物信息学手段,在已有转录组和蛋白质组数据基础上鉴定日本血吸虫的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,并采用同源建模方... 详细信息

目的鉴定日本血吸虫中存在的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,分析其蛋白结构特征。方法采用双向同源比对、结构域搜索和系统发育分析等生物信息学手段,在已有转录组和蛋白质组数据基础上鉴定日本血吸虫的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,并采用同源建模方法获得日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的结构特征。结果获得了2条腺嘌呤磷酸核糖转移酶的同源蛋白序列;分析了这2条序列的EST丰度、理化性质及蛋白三维结构等信息。结论日本血吸虫至少存在2个腺嘌呤磷酸核糖转移酶的异构体。

关键词：日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶生物信息学

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶两种同工酶的相关研究

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日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶两种同工酶的相关研究

作者：孔娟华东理工大学

学位级别：硕士

曰本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶(SjAPRT)是血吸虫嘌呤补救途径中的关键酶,它催化腺嘌呤生成腺苷一磷酸(AMP)。已有文献报道在日本血吸虫鉴定出两条编码APRT的基因序列SjAPRT1和SjAPRT2 (GenBank Accesion: AAW24796,AAW25340)。本研究... 详细信息

曰本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶(SjAPRT)是血吸虫嘌呤补救途径中的关键酶,它催化腺嘌呤生成腺苷一磷酸(AMP)。已有文献报道在日本血吸虫鉴定出两条编码APRT的基因序列SjAPRT1和SjAPRT2 (GenBank Accesion: AAW24796,AAW25340)。本研究在已有序列的基础上通过RT-PCR获得了日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶两条基因(SjAPRTs)并利用Real time PCR及Western blotting技术分析其在日本血吸虫各虫期转录水平和蛋白水平差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21菌株进行诱导表达,纯化的蛋白免疫小鼠Western blotting分析其免疫反应性,并进行动物实验了解其保护性效果。以纯化的rSjAPRTs作为包被抗原通过ELISA方法评估其免疫诊断价值。RT-PCR扩增结果显示在虫卵、尾蚴、童虫和成虫均检测到SjAPRT1及SjAPRT2基因转录本,Real time PCR结果显示SjAPRTs在各虫期的转录水平存在一定差异,在成虫及虫卵期的表达量均为童虫期的2倍左右。Western blotting分析结果表明在虫卵、童虫和成虫中检测到rSjAPRTl多抗兔血清特异性识别条带,尾蚴中未检测到特异性条带;而在尾蚴和童虫中检测到rSjAPRT2多抗兔血清特异性识别条带,成虫中识别条带较弱。这一结果暗示SjAPRTs的两种同工酶可能在血吸虫不同发育阶段发挥作用,而SjAPRT 1在成虫中发挥主要作用。此外纯化的重组蛋白rSjAPRTs可被日本血吸虫感染兔血清识别,表明其具有一定的免疫反应性。以rSjAPRTl, rSjAPRT2作为包被抗原检测日本血吸虫病人血清的间接ELISA方法结果显示检测疫区病人血清的敏感性分别为60%,63.3%,非疫区正常人血清特异性分别为96.6%,93.3%。动物保护性实验结果显示rSjAPRT1免疫小鼠后可诱导产生13.6%的减虫率和14.4%的肝脏减卵率。

关键词：日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶同工酶转录表达

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及各虫期转录和表达情况的研究

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日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及各虫期转录和...

腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷患儿骨与电解质代谢的改变

全国寄生虫学与热带医学学术研讨会

作者：孔娟冯正徐斌邓王平鞠川胡薇中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室华东理工大学生物工程学院

目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在各虫期转录和蛋白表达情况。方法根据文献报道的SjAPRT1序列(GenBank Accesion:AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各虫期转录本差... 详细信息

目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在各虫期转录和蛋白表达情况。方法根据文献报道的SjAPRT1序列(GenBank Accesion:AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各虫期转录本差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。纯化的蛋白免疫小鼠和家兔,Western blotting分析其免疫反应性及在各虫期蛋白表达差异。结果 RT-PCR扩增结果显示在虫卵、尾蚴、童虫和成虫均检测到SjAPRT1基因转录本(561bp),SjAPRT1基因亚克隆入pET28a并得到表达。Western blotting分析结果表明纯化的重组蛋白SjAPRT1可被日本血吸虫感染兔血清识别,各虫期中只有成虫蛋白可被SjAPRT1多抗兔血清识别,在Mr25 000处有特异性条带出现。结论日本血吸虫SjAPRT1基因在体外获得表达,并在日本血吸虫虫卵、尾蚴、童虫和成虫中均发现SjAPRT1基因转录本,但只在日本血吸虫成虫中检测到目的蛋白。其表达蛋白具有一定的抗原性,它有可能成为日本血吸虫疫苗的候选抗原和具有良好的免疫诊断价值。

关键词：日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶转录本抗原性

来源： cnki会议评论

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中国社区医师 2016年第23期32卷 134-134,136页

作者：吴志良欧军贺利湘南华大学附属南华医院脊柱外科 421000 安仁县人民医院儿科 423600

目的:观察腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)缺陷患者骨与电解质代谢的改变。方法:收治APRT缺陷患儿(患病组)5例,检测其骨密度(BMD)、血清甲状旁腺激素(PTH)、血清碱性磷酸酶(ALP)、血清钙(Ca)及血清磷(P)的水平,并且与正常儿童(对照组)进行... 详细信息

目的:观察腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)缺陷患者骨与电解质代谢的改变。方法:收治APRT缺陷患儿(患病组)5例,检测其骨密度(BMD)、血清甲状旁腺激素(PTH)、血清碱性磷酸酶(ALP)、血清钙(Ca)及血清磷(P)的水平,并且与正常儿童(对照组)进行比较。结果:APRT缺陷患儿BMD及血清Ca明显低于正常儿童(P<0.05),血清PTH、ALP及P明显高于正常儿童(P<0.05)。结论:APRT缺陷患儿骨与电解质代谢明显紊乱,呈高代谢性骨病样改变。因此在治疗时,不仅要保护肾功能,同时应纠正电解质紊乱,调节骨转换率,纠正骨质疏松。

关键词：腺嘌呤磷酸核糖转移酶骨代谢电解质甲状旁腺激素

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寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶研究进展

广东农业科学 2023年第8期50卷 163-172页

作者：余志会方肆云孙铭飞戚南山刘文俊李娟胡俊菁廖申权广东省农业科学院动物卫生研究所/农业农村部禽流感等家禽重大疫病防控重点实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510225 温氏食品集团股份有限公司广东云浮527400

寄生原虫是一类单细胞寄生性原虫,包括利什曼原虫(Leishmania spp.)、锥虫(Trypanosoma spp.)、疟原虫(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)等,可引起严重危害人类与动物健康以及对养殖业造成巨大经济损失的原虫病。寄生虫入侵宿主后的发育和繁殖需要大量的嘌呤核苷酸,相应的嘌呤碱基在嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下生成对应的嘌呤核苷酸。嘌呤磷酸核糖转移酶是一类参与嘌呤核苷酸补救合成的重要代谢酶,广泛存在于寄生原虫中。寄生原虫的嘌呤磷酸核糖转移酶主要包括腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶,两者在寄生原虫中分别催化腺嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和黄嘌呤核苷酸合成,从而参与寄生原虫的多个生化代谢过程,不仅为寄生原虫核酸生物合成等提供前体物质,还为虫体提供通用能量载体。由于寄生原虫的嘌呤补救途径明显区别于宿主的从头合成途径,且嘌呤磷酸核糖转移酶是寄生原虫嘌呤补救途径的关键酶,因而近年来寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶成为抗原虫药物候选靶标的研究热点,以寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶为潜在靶标,特异性筛选、设计抑制剂,并开发抗寄生原虫药物取得重要进展。以利什曼原虫、锥虫、疟原虫和弓形虫的嘌呤磷酸核糖转移酶为重点,综述寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶的基本特征、生物学功能、抑制剂筛选与应用的研究进展,以期为抗寄生原虫药物靶标研究与新型抑制剂筛选提供参考。

关键词：寄生原虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶嘌呤核苷酸药物靶标抑制剂

APRT缺陷型CHO细胞系的建立及其重组蛋白表达能力评价

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生物工程学报 2022年第9期38卷 3453-3465页

作者：冯莹莹肖梦珂路江涛王小引柴玉荣王天云贾岩龙新乡医学院药学院河南新乡453003 新乡医学院重组药物蛋白表达系统国际联合实验室/河南省生物创新药物工程技术研究中心河南新乡453003 新乡医学院基础医学院河南新乡453003 郑州大学基础医学院组织学与胚胎学系河南郑州450001

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基... 详细信息

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因,验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性;构建两种真核表达载体:对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP),分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池;重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度,并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明,CHO细胞aprt基因成功敲除;获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明,与野生型CHO细胞相比,转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%;特别是长期传代培养时,转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P<0.05);构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。

关键词：中国仓鼠卵巢细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因敲除重组蛋白表达

异源表达德氏乳杆菌保加利亚亚种TCS1调控酸适应基因提高乳酸乳球菌NZ9000耐酸性

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微生物学报 2020年第11期60卷 2521-2537页

作者：王超崔艳华曲晓军哈尔滨工业大学化工与化学学院黑龙江哈尔滨150090 黑龙江省科学院微生物研究所黑龙江哈尔滨150010

【目的】在乳酸乳球菌NZ9000中异源表达德氏乳杆菌保加利亚亚种中由双组分系统TCS1(JN675228/JN675229)调控的与酸适应相关基因,进而探究德氏乳杆菌保加利亚亚种应对酸胁迫的机制。【方法】通过逆转录聚合酶链式反应和十二烷基硫酸钠-... 详细信息

【目的】在乳酸乳球菌NZ9000中异源表达德氏乳杆菌保加利亚亚种中由双组分系统TCS1(JN675228/JN675229)调控的与酸适应相关基因,进而探究德氏乳杆菌保加利亚亚种应对酸胁迫的机制。【方法】通过逆转录聚合酶链式反应和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证由德氏乳杆菌保加利亚亚种TCS1调控的与酸适应相关基因中腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)、D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶(ddl)、寡肽ABC转运蛋白(oppDII)和延伸因子Ts(tsf)在乳酸乳球菌NZ9000中的表达情况。酸处理实验验证基因表达对宿主菌酸胁迫耐受能力的影响。并采用酵母双杂交验证双组分系统TCS1与表达的酸适应相关基因之间的互作关系及具体的互作部位。【结果】结果表明,乳酸乳球菌NZ9000中成功表达了aprt、ddl、oppDII和tsf。aprt、ddl基因使重组菌对酸胁迫的抗性分别提高了75倍和114倍。oppDII和tsf基因的表达对重组菌株的耐酸能力没有明显影响。酵母双杂交实验表明TCS1中的组氨酸蛋白激酶HPK1与Ddl之间存在相互作用,且HPK1-C结构域是二者相互作用的关键区域。【结论】aprt和ddl过表达菌株酸刺激的适应能力显著高于对照菌株,该研究结果可为德氏乳杆菌保加利亚亚种及类似菌株耐酸性特性的获得策略提供参考。

关键词：德氏乳杆菌保加利亚亚种腺嘌呤磷酸核糖转移酶 D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶耐酸性酵母双杂交

嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响

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中国实验诊断学 2010年第2期14卷 162-164页

作者：李昆何海涛李鸿梅刘剑凯洪敏吉林大学白求恩医学院生物化学教研室吉林长春130021 吉林大学护理学院

目的探讨外源性补偿嘌呤核苷酸对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢酶的影响。方法将50只雄性Wis-tar大鼠随机分为对照组、海洛因组、海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组。采用real-timePCR的方法检测大鼠脑皮质中腺苷脱氨酶(ADA... 详细信息

目的探讨外源性补偿嘌呤核苷酸对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢酶的影响。方法将50只雄性Wis-tar大鼠随机分为对照组、海洛因组、海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组。采用real-timePCR的方法检测大鼠脑皮质中腺苷脱氨酶(ADA)、黄嘌呤氧化酶(XO)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)mRNA的表达水平。结果海洛因组ADA、XO的mRNA比对照组明显升高(P嘌呤核苷酸的分解代谢,降低合成代谢,而补偿嘌呤核苷酸可以抑制或拮抗海洛因的上述作用。

关键词：嘌呤核苷酸海洛因腺苷脱氨酶黄嘌呤氧化酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶腺嘌呤磷酸核糖转移酶腺苷激酶

APRT缺陷型CHO细胞系的建立及对重组蛋白表达的影响

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APRT缺陷型CHO细胞系的建立及对重组蛋白表达的影响

作者：冯莹莹新乡医学院

学位级别：硕士

背景在生物制药工业中,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重组药物蛋白生产应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞克隆之间转基因表达水平的差异,导致重组蛋白表达的不稳定性(异质性)成为突出的问题。腺嘌呤磷酸核... 详细信息

背景在生物制药工业中,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重组药物蛋白生产应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞克隆之间转基因表达水平的差异,导致重组蛋白表达的不稳定性(异质性)成为突出的问题。腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)作为生物体内ATP合成中嘌呤补救途径的关键酶,不仅参与生物体嘌呤的合成代谢,还对基因沉默引起的基因表达具有重要的影响。因此,本研究通过基因编辑并筛选获得aprt基因敲除的CHO细胞系及研究其对重组蛋白表达的影响,以期最终建立一个基于APRT缺陷型细胞系的高效表达目的蛋白的基因扩增系统。目的采用CRISPR/Cas9基因编辑(gene editing)技术,敲除CHO细胞的aprt基因并筛选获得APRT缺陷型CHO细胞系,研究缺陷型细胞对重组蛋白表达的影响。方法(1)Aprt基因敲除及验证:根据CHO细胞aprt基因组序列设计并合成sg RNA,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除aprt基因,利用PCR扩增、测序和实时荧光定量PCR等方法鉴定基因敲除是否成功。(2)APRT缺陷型CHO细胞生物学特性验证:通过观察细胞形态和生长状态,进行生物学特性验证缺陷型CHO细胞系能否进行正常的生长和传代。即分别采用CCK-8法和倍增时间计算,检测缺陷型细胞的增殖情况;流式细胞术检测缺陷型细胞的凋亡情况。(3)重组蛋白真核表达载体的构建:以本实验室构建的表达报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,e GFP)真核表达载体为基础载体,在e GFP表达盒上游插入含有SV40启动子弱化或(和)aprt基因起始密码子突变的APRT表达盒,分别命名为弱化表达载体和突变表达载体;相应的目的蛋白真核表达载体是将e GFP分别替换为人玻连蛋白(human vitronectin,VN)或阿达木单抗(adalimumab,ADM)基因序列。将构建好的上述真核表达载体分别转染野生型和APRT缺陷型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池(cell pool)。(4)重组蛋白表达分析:转染筛选获得重组CHO-e GFP细胞池传代培养60代并用流式细胞术检测e GFP表达的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI),比较不同实验组e GFP的表达稳定性。转染筛选获得重组CHO-VN、CHO-ADM细胞池,并通过Western Blot比较不同实验组重组蛋白的表达量。结果(1)PCR扩增、测序和实时荧光定量PCR等检测结果表明,aprt基因DNA片段缺失141 bp,成功敲除CHO细胞aprt基因。(2)与野生型CHO细胞,获得的APRT缺陷型CHO细胞系,在细胞形态、细胞增殖和凋亡以及细胞的倍增时间无显著区别(野生型:17.69±0.3 h,APRT缺陷型:17.99±0.2 h)(P>0.05)。这些结果表明,aprt基因的敲除对CHO细胞的生物学特性无明显影响。(3)瞬时转染和稳定转染的细胞池检测结果表明,与重组野生型CHO细胞相比,e GFP在重组APRT缺陷型CHO细胞系中的表达显著提高(P<0.05)。(4)长期传代培养结果表明,在杀稻瘟菌素加压或不加压的情况下,转染弱化载体或突变载体的缺陷型细胞能够显著提高e GFP蛋白的表达量(P<0.05)。其中,转染突变载体的缺陷型细胞的e GFP表达量最高,其MFI是转染对照载体的野生型细胞的2.02倍。转染突变载体的两组重组CHO细胞表达e GFP较为稳定,e GFP蛋白的长期表达维持率均高于70%。(5)重组目的蛋白VN和ADM在缺陷型CHO细胞中的表达量均高于对照野生型CHO细胞。结论(1)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了APRT缺陷型CHO细胞系,缺陷型细胞系与野生型CHO细胞在生物学特性方面无显著差异。(2)获得的APRT缺陷型CHO细胞系能够显著提高重组蛋白表达水平和表达稳定性,为最终建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的基因工程策略。

关键词：中国仓鼠卵巢细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因敲除重组蛋白表达