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中国兽医科学 2018年第9期48卷 1124-1130页

作者：杜吉革薛麒朱真李启红印春生彭小兵姚文生康凯陈小云中国兽医药品监察所

本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素（CSa）的重组突变体，并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计，同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨... 详细信息

本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素（CSa）的重组突变体，并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计，同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变，经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体pET-30（＋）中进行表达与纯化，获得重组蛋白rcsam4。利用Western—blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性，并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后，将rcsam4与Montanide ISA206佐剂以1：1（v／V）的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔，按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素，来检测rCSam4对家兔的免疫保护效果。结果表明。rcsam4主要以包涵体的形式存在，且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示，9．85μg／mL的蛋白仍无细胞毒性：小鼠安全性试验显示，5．5×10^3μg／kg的剂量对小鼠无致死性；免疫rcsam4后，每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；1个家免MLD的腐败梭菌毒素攻毒后，对照组家兔全部死亡，免疫组家免得到了100％（4／4）的保护。以上结果表明，rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。

关键词：腐败梭菌α毒素突变重组表达毒性抗原性

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腐败梭菌α毒素单抗、多抗的制备及DAS-ELISA方法的初步建立

腐败梭菌α毒素单抗、多抗的制备及DAS-ELISA方法的初步建立

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作者：林静山东农业大学

学位级别：硕士

腐败梭菌(Clostridium septicum)在土壤等自然界环境中分布十分广泛,是造成动物和人类恶性水肿病的主要病原体。该细菌感染羊后主要引发羊快疫,发病羊在2-3天内迅速死亡,给我国畜牧行业带来重大损失。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫... 详细信息

腐败梭菌(Clostridium septicum)在土壤等自然界环境中分布十分广泛,是造成动物和人类恶性水肿病的主要病原体。该细菌感染羊后主要引发羊快疫,发病羊在2-3天内迅速死亡,给我国畜牧行业带来重大损失。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的早期诊断方法,以做到对临床可疑发病样品的快速筛查。腐败梭菌最主要毒力因子为α毒素,该毒素具有溶血、致死和坏死等多种生物学活性,因此本研究以α毒素为主要研究对象,通过制备α毒素单克隆抗体及多克隆抗体,完成对双抗体夹心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法的初步探索,为羊快疫等腐败梭菌病的早期临床诊断提供技术支持。研究内容可分为以下三个部分:1、腐败梭菌天然α毒素与重组毒素蛋白的制备将腐败梭菌参考株(ATCC 12464)进行菌种复苏和增菌培养后,粗提腐败梭菌天然蛋白,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对提纯后的蛋白进行验证,获得大小为46 kDa的天然α毒素。根据NCBI上公布的腐败梭菌α毒素的CDs区序列,扩增α毒素基因,构建腐败梭菌α毒素原核表达系统,并在最佳诱导条件下(菌液OD为0.4-0.6时,向菌液中加入浓度为0.5 mmol/mL的IPTG,37℃条件下诱导表达5 h)大量表达可溶性重组蛋白并纯化,最终测得目的蛋白浓度为4.28 mg/mL。通过Western blot分析表明该蛋白具有良好的免疫原性,证明腐败梭菌α毒素原核表达系统构建成功。2、单克隆抗体及多克隆抗体的制备使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫新西兰大白兔,将获得的阳性血清利用抗原亲和层析方法进行纯化,获得纯化后的多克隆抗体浓度为0.98 mg/mL,多克隆抗体对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,通过SDS-PAGE及Western-blot检测结果发现该多克隆抗体纯度高,特异性良好。使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠血清转阳后制备脾细胞并进行细胞融合,通过杂交瘤细胞筛选及亚克隆实验,最终确定8株强阳性细胞株。通过稳定性检测发现有6株细胞可以稳定分泌单克隆抗体,其中3E8、6B12和6F10细胞株对天然α毒素的识别能力较强。选取其中的两株细胞3E8和6B12,分别腹腔注射免疫BALB/c小鼠,收集腹水并纯化后,通过间接ELISA测得两株单抗对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,两株单抗浓度分别为2.27mg/mL和1.96 mg/mL,通过SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定单抗纯度及特异性,结果发现制备的两株单克隆抗体纯度高,特异性良好。3、针对腐败梭菌α毒素DAS-ELISA的初步建立为建立高效、灵敏的DAS-ELISA方法,探索最佳配对抗体及抗体工作浓度,本研究将多克隆抗体作为捕获抗体,将单抗3E8和6B12分别作为检测抗体,通过方阵滴定实验,确定作为捕获抗体的多克隆抗体的最佳工作浓度为1.25μg/mL,作为检测抗体的单抗3E8的最佳工作浓度为0.5μg/mL。在优化条件下验证该方法的特异性,结果表明该方法仅对腐败梭菌重组α毒素和天然α毒素具有识别作用,与其他蛋白无交叉反应,特异性良好。本研究成功构建了腐败梭菌α毒素重组蛋白的原核表达系统,在最佳诱导条件下大量诱导表达可溶性的目的蛋白,并以α毒素重组蛋白为基础,成功制备出针对腐败梭菌α毒素的特异性强,稳定性好的单克隆抗体及多克隆抗体。初步摸索出DAS-ELISA的最佳配对抗体及最佳抗体工作浓度,并验证了优化后的DAS-ELISA的特异性。为家畜腐败梭菌病的临床诊断提供了技术方法,也为腐败梭菌病疫苗和相关药物的研发提供了技术支撑。

关键词：腐败梭菌α毒素原核表达系统单克隆抗体多克隆抗体 DAS-ELISA

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重组腐败梭菌α毒素对兔的免疫效力分析

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畜牧兽医学报 2018年第8期49卷 1727-1734页

作者：陈小云刘莹薛麒朱真李启红印春生姚文生康凯杜吉革中国兽医药品监察所北京100081

本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western b... 详细信息

本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western blot方法检测纯化的rCSA与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用犬肾细胞系(MDCK)和小鼠来检测rCSA的毒力。以甲醛脱毒后的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA为可溶性表达,比例可达50%,且能与腐败梭菌抗血清反应。MDCK细胞毒性试验显示,0.15ng·mL^(-1)的rCSA即可引起明显的细胞病变;小鼠安全性试验显示,rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×10~6 ng·kg^(-1);每毫升的一免抗血清可中和100~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免抗血清可中和360~480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了4/4的保护。以上结果表明,rCSA具有良好的免疫原性,可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

关键词：腐败梭菌α毒素重组表达毒力抗原性

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含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌的高密度发酵和免疫效果

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江苏农业科学 2019年第17期47卷 186-189页

作者：彭小兵杜吉革彭国瑞李旭妮董令赢冯丽芳蒋玉文中国兽医药品监察所北京100081 北京中海生物科技有限公司北京100081

为确定含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的生产效率并评价其作为抗原的免疫效果,用生物反应器对重组大肠杆菌DE3-pET-AE进行高密度发酵,并将其制苗后以不同抗原剂量分别接种家兔和绵羊,间隔21d进行二免,分别测定一免、二... 详细信息

为确定含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的生产效率并评价其作为抗原的免疫效果,用生物反应器对重组大肠杆菌DE3-pET-AE进行高密度发酵,并将其制苗后以不同抗原剂量分别接种家兔和绵羊,间隔21d进行二免,分别测定一免、二免动物混合血清的中和效价。发酵结果显示,培养物菌体密度D600nm达20.3,相对表达量为27.6%,D600nm与相对表达量的乘积为摇瓶培养的6.5倍,菌体湿质量为37.2g/L;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,目的蛋白以可溶形式表达。动物免疫效果评价结果显示,在家兔和绵羊上,抗原含量与免疫效果在一定的范围内均呈正相关,当接种量为300μg/只时,免疫效果均最好;对腐败梭菌毒素与D型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价,在家兔上一免、二免分别达4与30、15与200,在绵羊上一免、二免分别达2与30、12与250。结果表明,DE3-pET-AE菌高密度发酵可获得高产量蛋白抗原,且抗原的免疫效果明显优于《中华人民共和国兽药典》合格标准。

关键词：腐败梭菌α毒素产气荚膜梭菌ε毒素大肠杆菌高密度发酵免疫效果抗原含量家兔绵羊

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羊快疫LAMP快速检测方法的建立

羊快疫LAMP快速检测方法的建立

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2017年全国养羊生产与学术研讨会暨养羊学分会第七次全国会员代表大会

作者：丁轲王玉琴余祖华李元晓河南科技大学动物疫病与公共卫生实验室河南省肉羊繁育工程技术研究中心

引言/目的羊快疫是羊的一种最重要的传染性疫病之一,主要发生于绵羊,是由腐败梭菌引起的一种急性传染病。羊突然发病,病程极短,一旦发生,传染很快,往往来不及治疗,羊场损失极大,所以临床快速诊断是防治该病最有效的措施之一。材料与方... 详细信息

引言/目的羊快疫是羊的一种最重要的传染性疫病之一,主要发生于绵羊,是由腐败梭菌引起的一种急性传染病。羊突然发病,病程极短,一旦发生,传染很快,往往来不及治疗,羊场损失极大,所以临床快速诊断是防治该病最有效的措施之一。材料与方法根据LAMP引物要求,以腐败梭菌CN913的α毒素序列的6个不同特定区域为模板,

关键词：羊羊快疫 LAMP检测腐败梭菌α毒素

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