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脱氧雪腐镰刀烯醇时间分辨免疫法的建立

食品科学 2009年第20期30卷 398-402页

作者：高雷黄飚李秋萍张莲芬金坚江南大学医药学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214063 江苏省原子医学研究所江苏无锡214063

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀烯醇多克隆抗体及其人工抗原,采用时间分辨免疫荧光技术建立间接竞争脱氧雪腐镰刀烯醇时间分辨免疫检测方法(DON-TRFIA)。方法:以DON人工抗原(DON-BSA)包被微孔板,与DON标准或样品中的DON共同竞争结合抗DON多克... 详细信息

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀烯醇多克隆抗体及其人工抗原,采用时间分辨免疫荧光技术建立间接竞争脱氧雪腐镰刀烯醇时间分辨免疫检测方法(DON-TRFIA)。方法:以DON人工抗原(DON-BSA)包被微孔板,与DON标准或样品中的DON共同竞争结合抗DON多克隆抗体,然后用稀土离子Eu3+标记羊抗兔抗体进行示踪检测,并对建立DON-TRFIA进行方法学的考核。结果:该方法的灵敏度为0.01ng/ml,检测范围为0.01～100ng/ml,IC50为4.84ng/ml,批内、批间变异率均小于10%。不同样品添加回收实验表明小麦、玉米、啤酒、面包回收率分别为89.41%～123.2%、115.6%～123.6%、80.35%～118%、87%～92.45%。玉米样品检测结果表明DON-TRFIA与商品化DON-ELISA试剂盒结果高度相关,具有较好的一致性。结论:DON-TRFIA是目前已见报道文献中最灵敏的DON免疫检测法,具有很好的应用前景。

关键词：脱氧雪腐镰刀烯醇时间分辨免疫分析生物毒素

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脱氧雪腐镰刀烯醇超微量免疫检测法的建立

脱氧雪腐镰刀烯醇超微量免疫检测法的建立

作者：高雷江南大学

学位级别：硕士

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）污染粮食作物的现象非常普遍,广泛存在于大麦、玉米、小麦等农作物。目前,世界范围内DON污染居各种生物毒素之首,属于严重污染。本研究主要目的采用时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved fluor... 详细信息

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）污染粮食作物的现象非常普遍,广泛存在于大麦、玉米、小麦等农作物。目前,世界范围内DON污染居各种生物毒素之首,属于严重污染。本研究主要目的采用时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）技术建立检测DON高灵敏的分析技术。论文的主体部包括以Eu3+为标记物建立DON-TRFIA免疫检测法及Eu3+/Sm3+为标记物建立DON/ZEN双标记TRFIA。首先建立DON-TRFIA免疫检测法并对其进行严格的考核。DON-TRFIA灵敏度为0.01ng/mL,检测范围为0.01~100ng/mL,批内、批间变异率均＜10%。不同样品的添加回收率符合免疫分析方法平均回收率在70%~130%之间。玉米样品检测结果表明DON-TRFIA与商品化DON-ELISA试剂盒结果高度相关。在DON-TRFIA工作的基础上,以Eu3+/Sm3+为标记物建立了快速、灵敏、可靠的DON/ZEN双标记TRFIA。双标记DON/ZEN-TRFIA的灵敏度为:DON为0.194ng/mL、ZEN为0.73ng/mL。测量范围为:DON 0.194~100ng/mL、ZEN 0.73~50ng/mL。最后初步建立了DON光激化学发光免疫检测法（DON-LICLIA）,并简要的考核DON-LICLIA的稳定性、样品添加回收率等。DON-LICLIA两步共30min的反应模式缩短了检测时间,批内批间变异率均＜5%。检测范围为0.007~100ng/mL,灵敏度为0.007ng/mL。研究表明,DON-TRFIA是目前已报道文献中最灵敏的DON免疫检测法,具有很好的应用前景。本论文对DON的TRFIA以及新兴的光激化学发光检测技术进行了比较全面的探讨,为我国这一领域以及相关领域的研究提供了有价值的参考资料。

关键词：脱氧雪腐镰刀烯醇时间分辨免疫分析生物毒素多标记免疫检测光激化学发光免疫检测玉米赤霉烯酮

贝莱斯芽孢杆菌降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇及抑制禾谷镰刀菌的研究

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河南工业大学学报（自然科学版） 2022年第3期43卷 74-80,88页

作者：曹荣耀谢岩黎刘晨程思忠河南工业大学粮油食品学院河南郑州450001

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由禾谷镰刀菌等真菌产生的一类真菌毒素,会严重污染玉米和小麦等农产品,利用微生物降解真菌毒素是一种高效且污染小的方法。从猪肠道中分离得到1株可高效降解DON的菌株,对该菌株进行形态学、... 详细信息

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由禾谷镰刀菌等真菌产生的一类真菌毒素,会严重污染玉米和小麦等农产品,利用微生物降解真菌毒素是一种高效且污染小的方法。从猪肠道中分离得到1株可高效降解DON的菌株,对该菌株进行形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列比对分析;将该菌株与DON共同孵育,检测不同孵育时间的降解效果;取该菌株上清液、菌体细胞、胞内提取物以及经蛋白酶k、加热处理的上清液分别对DON进行降解;将菌株与禾谷镰刀菌共同培养,观察禾谷镰刀菌的生长情况。结果表明:经16S rDNA序列比对分析确定筛选得到的菌株为贝莱斯芽孢杆菌,其发酵上清液能在72 h内降解76.7%的DON,上清液经蛋白酶k、加热处理后,降解效果变弱,初步判断其中存在能降解DON的胞外酶;该菌株能够抑制禾谷镰刀菌的生长,且其发酵上清液对禾谷镰刀菌也具有很好的拮抗效果。

关键词：贝莱斯芽孢杆菌脱氧雪腐镰刀烯醇微生物降解禾谷镰刀菌

纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法的建立

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食品工业科技 2010年第8期31卷 338-342页

作者：周彬高雷金坚陈蕴黄飚赵卫国江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏无锡214063 江南大学医药学院江苏无锡214063 博阳生物科技(上海)有限公司上海200000

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体,采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术(AlphaLISA)建立间接竞争DON定量检测方法。方法:DON-BSA包被发光微粒,生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测... 详细信息

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体,采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术(AlphaLISA)建立间接竞争DON定量检测方法。方法:DON-BSA包被发光微粒,生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测条件并评价检测性能。结果:该方法的灵敏度为0.007ng/mL,检测范围为0.007～100ng/mL,批内批间变异系数均<5%。不同样品添加回收实验:玉米、小麦、啤酒回收率分别为84%～110%、67%～100%、74%～100%。结论:DON-AlphaLISA是目前DON检测中最灵敏的方法之一,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景。

关键词：脱氧雪腐镰刀烯醇生物毒素纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)

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粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测研究进展综述

食品安全导刊 2017年第4X期 89-89页

作者：张建洲重庆市万州粮油质量监督检验站

本文在对粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测研究,首先了解脱氧雪腐镰刀烯醇制毒原理及研究现状,进而分析研究毒素最新研究成果及所存在的问题,最后提出针对性意见,希望可以加强对脱氧雪腐镰刀烯醇检测质量。

关键词：粮食脱氧雪腐镰刀烯醇检测

禾谷镰刀菌GDP-甘露糖转运蛋白的功能研究

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禾谷镰刀菌GDP-甘露糖转运蛋白的功能研究

作者：陈书会长江大学

学位级别：硕士

由禾谷镰刀菌(Fusarium graminerium)所导致的赤霉病,已经成为危害中国小麦高产稳产的主要病害,在天气条件适宜的情况下传播速度快,危害面积大,且不易防控。该病害不仅会导致小麦减产,同时病原菌在感染期间产生的DON毒素还会影响小麦质... 详细信息

由禾谷镰刀菌(Fusarium graminerium)所导致的赤霉病,已经成为危害中国小麦高产稳产的主要病害,在天气条件适宜的情况下传播速度快,危害面积大,且不易防控。该病害不仅会导致小麦减产,同时病原菌在感染期间产生的DON毒素还会影响小麦质量,给我国食品安全构成了严重的威胁。前人研究发现,鸟苷二磷酸(GDP)-甘露糖转运蛋白与某些重要病原真菌的致病力和毒力相关,GDP-甘露糖转运蛋白(GMT)在甘露糖基化之前将GDP-甘露糖从细胞质转移到高尔基体腔,然后甘露糖附着在被修饰的蛋白质上。在禾谷镰刀菌中GDP-甘露糖转运蛋白是由Fg Gmt A和Fg Gmt B基因编码,但目前尚未开展系统的功能研究。因此明确这两个基因在禾谷镰刀菌中的生物学功能及对毒素合成和致病力的调控作用,对小麦赤霉病的致病机制研究和田间防控具有重要指导意义。在本研究中,通过反向遗传学思路,利用Split-marker和PEG介导的原生质体转化方法,获得了Fg Gmt A、Fg Gmt B和Fg Gmt A&B基因敲除突变体以及互补菌株。通过研究各缺失突变体的相关表型变化,阐明Fg Gmt A和Fg Gmt B基因在禾谷镰刀菌中的功能。主要结果总结如下:(1)与野生型菌株PH-1相比,ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体生长速度减慢,气生菌丝高度显著降低,互补菌株基本恢复到野生型菌株水平。(2)ΔFg Gmt B突变体的分生孢子产量明显增加,ΔFg Gmt A&B突变体分生孢子产量基本正常,但两个突变体的孢子形态均正常;ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体有性生殖被阻断,无法产生子囊壳。(3)致病力测定结果表明,ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体对小麦穗、胚芽鞘、小麦叶片和玉米须的致病力都明显弱于野生型菌株PH-1,互补菌株基本恢复到野生型菌株水平。DON毒素产量测定结果表明,ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体产生DON毒素的能力明显减弱,毒素合成相关基因的表达量降低。(4)几丁质合成酶基因Fg CHS7的表达量显著降低,通过对细胞壁损伤剂表型测定,发现ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体的细胞壁敏感性增强,表明Fg Gmt B参与细胞壁合成。(5)ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体渗透压抗性减弱,甘油含量测定发现,不论是否添加Na Cl处理,ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体中的甘油含量均下降。同时ΔFg Gmt B和ΔFg Gmt A&B突变体对异菌脲和咯菌腈的敏感性减弱。(6)Fg Gmt A能够回补酿酒酵母Scvrg4突变体菌株的表型,但是在禾谷镰刀菌株中,Fg Gmt A的缺失在生长发育、致病性以及毒素等方面并未观察到差异表型。综上所述,Fg Gmt B在禾谷镰刀菌的生长发育、致病性、应激反应以及毒素合成等方面都起了关键性作用,并可能成为针对毒力决定因素的新型抗真菌药物的潜在靶点。

关键词：禾谷镰刀菌 GDP-甘露糖转运蛋白致病力营养生长应激反应脱氧雪腐镰刀烯醇

组蛋白甲基化修饰酶MLL1对呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞损伤的调控作用及机制研究

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组蛋白甲基化修饰酶MLL1对呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞损伤的调控...

作者：石东风扬州大学

学位级别：硕士

脱氧学腐镰刀烯醇(Deoxynivalenol,DON),俗称呕吐毒素,是由镰刀菌属产生的一种次级代谢产物,近年来在饲料及饲料原料中的检出率和污染率很高,严重危害动物健康养殖和人类食品安全。在畜禽中,猪对呕吐毒素异常敏感,且小肠是主要靶器官,DO... 详细信息

脱氧学腐镰刀烯醇(Deoxynivalenol,DON),俗称呕吐毒素,是由镰刀菌属产生的一种次级代谢产物,近年来在饲料及饲料原料中的检出率和污染率很高,严重危害动物健康养殖和人类食品安全。在畜禽中,猪对呕吐毒素异常敏感,且小肠是主要靶器官,DON污染可以引起肠道屏障受损、免疫系统紊乱,造成采食量下降,生长受阻。目前通过化学、物理和生物等方法可以对DON进行脱毒,但是这些方法会在一定程度影响饲料品质及营养成分的吸收。因此,亟需进一步阐明猪抵御DON诱导肠道损伤的调控机制,为今后通过分子设计的手段达到抗病育种提供思路,也为从本质上实现猪对DON的抵抗能力奠定基础。组蛋白甲基化修饰属于表观遗传修饰的一种,其主要发生在组蛋白H3/H4的N末端尾巴上,组蛋白甲基化修饰可以调控基因的转录激活和转录抑制。MLL(Mixed Lineage Leukemia)家族是特异性针对组蛋白H3K4me3修饰的甲基化转移酶。MLL1可以调控白血病发生和基因表达,在细胞分化、细胞周期、胚胎发育、神经形成和端粒修饰等生物过程中发挥重要作用,但在DON的研究中关于MLL1和H3K4me3修饰鲜有报道。因此,本研究通过构建DON诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)损伤模型,明确DON导致猪肠道细胞中MLL1的表达和H3K4me3修饰水平显著变化;此外,通过敲降MLL1进行转录组测序,利用流式细胞术、双荧光素酶报告、ChIP-qPCR等试验结合基因表达验证探究MLL1介导H3K4me3修饰水平调控DON诱导IPEC-J2细胞损伤的分子机制,试图从组蛋白甲基化修饰的角度探讨DON诱导猪肠道细胞损伤的调控作用。主要试验结果如下:1.MLL1在DON诱导IPEC-J2细胞损伤机制中的功能研究为探究MLL1在DON诱导IPEC-J2细胞损伤中的功能,我们测定间接免疫荧光、细胞凋亡、活性氧等指标,检测凋亡相关基因、抗氧化酶相关基因及细胞因子等基因的表达,发现DON处理IPEC-J2细胞后,细胞形态发生皱缩、拉丝,细胞骨架蛋白(α-tubulin)分布显著减少;细胞凋亡水平显著增加(p2和padj<0.05为标准,发现差异基因中上调的有2591个,下调的有2760个;GO富集分析发现,生物过程部分主要富集到DNA复制和DNA代谢过程;细胞组分主要富集到细胞核和胞内细胞器;分子功能主要富集到RNA结合;KEGG富集分析发现,差异基因主要被富集到细胞周期、p53、细胞凋亡、TNF、DNA复制和细胞衰老等信号通路。挑选10个差异表达基因(TNFRSF1A、PCNA、HNMT等)进行qPCR验证,其表达趋势和测序结果一致。通过韦恩分析筛选出凋亡和TNF-α信号通路20个共同表达基因,查阅文献并利用qPCR检测基因表达,结果表明相较于对照组,MLL1敲降导致TNFRSF1A表达水平显著上调(p<0.01),因此确定TNFRSF1A作为MLL1调控DON诱导IPEC-J2细胞损伤的潜在靶基因。3.TNFRSF1A在DON诱导的细胞损伤过程中的机制研究为进一步明确MLL1介导TNFRSF1A对DON诱导IPEC-J2细胞损伤的调控作用,本试验利用在线软件预测出TNFRSF1A基因有4个核心启动子区,设计截断型引物扩增不同目的片段序列连接到pGL3-basic线性载体,双荧光素酶报告试验验证基因核心启动子区位于上游391-441位

关键词：脱氧雪腐镰刀烯醇猪小肠上皮细胞 H3K4me3修饰 MLL1

免疫亲和柱的制备及在真菌毒素检测中应用的研究进展

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食品工业科技 2013年第24期34卷 396-400页

作者：袁艺陆廷瑾沈腾腾秦学磊刘莹焦志培廖惊殊张东升江苏省苏微微生物研究有限公司江苏无锡214013 河南省粮油饲料产品质量监督检验中心河南郑州450003 湖南中储粮质量检测中心湖南宁乡410600

真菌毒素是真菌的次生代谢产物,是引起谷物和饲料污染的重要元凶,其检测手段日趋完善。目前免疫亲和柱在真菌毒素检测分析方面已经被广泛使用,本文综述了免疫亲和柱的原理及其制备方式,及其在几种常见真菌毒素检测方面的应用。

关键词：免疫亲和柱黄曲霉毒素赭曲霉毒素伏马毒素玉米赤霉烯酮脱氧雪腐镰刀烯醇

禾谷镰刀菌致病相关基因的鉴定及其毒素DON特异亲和肽段的淘选

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禾谷镰刀菌致病相关基因的鉴定及其毒素DON特异亲和肽段的淘选

作者：邢锦城南京农业大学

学位级别：硕士

由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的赤霉病((Fusarium Head Blight)是世界性流行病害,危害小麦、大麦、玉米的生产。该病害的流行不仅造成作物的严重减产、品质降低,而且导致受侵染籽粒中含有真菌毒素,危害食品安全和人畜健康。... 详细信息

由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的赤霉病((Fusarium Head Blight)是世界性流行病害,危害小麦、大麦、玉米的生产。该病害的流行不仅造成作物的严重减产、品质降低,而且导致受侵染籽粒中含有真菌毒素,危害食品安全和人畜健康。禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是单端孢霉烯族化合物中的一种,主要污染小麦、玉米等谷物及其制品。DON毒素对的谷物污染严重,在收割季节如雨量偏多则DON的污染更为严重。DON毒素不仅具有生殖毒性、免疫毒性和致动物呕吐等急性毒性,而且与人的癌症的诱发相关。本研究围绕禾谷镰刀菌展开,共分两部分,第一部分旨在鉴定同禾谷镰刀菌致病性相关的基因,进一步探明禾谷镰刀菌的致病机制;第二部分旨在通过淘选同毒禾谷镰刀菌素DON特异亲和的肽段,达到简化DON毒素检测方法的目的。本研究以突变体库中经初次鉴定为致病力变异菌株的10个突变体菌株和野生型菌株为材料,围绕致病相关基因的鉴定,首先通过人工接种方法在抗赤性不同的小麦品种中淘选出具有显著致病力变异的突变体菌株,进而利用绿色荧光蛋白标记比较致病力变异菌株同野生型菌株在致病进程上的差异,观察突变基因对菌株致病力的影响方式,最后利用TAIL-PCR技术鉴定出菌株中发生插入突变的基因。结果表明,突变菌株G12在三个小麦品种中的致病力明显增强,且同初次鉴定结果相符。通过绿色荧光蛋白标记观察致病进程表明,突变体G12对穗轴的侵染更早,在穗轴中的荧光信号更强。TAIL-PCR对突变体插入位点侧翼序列进行扩增结果表明,突变体G12的转座子插入位点位于一个未知基因FGSG4134.3的编码区内,蛋白结构域分析表明该蛋白含有一个C2H2型锌指结构,同源性分析表明,该基因编码的氨基酸序列同烟曲霉和稻瘟病菌的con7p转录因子同源性达53%。推测突变基因可能是同禾谷镰刀菌致病性相关的转录因子,并以负调控的方式影响致病相关基因的表达。该基因的具体功能有待进一步研究。为了建立针对DON毒素的更加简便的检测方法,本研究在制备DON人工抗原的基础上,从噬菌体随机七肽库中淘选DON的特异亲合肽段,并通过竞争性ELISA对淘选到的肽段加以验证。人工抗原合成结果表明：采用丁基硼酸封闭法制备的DON人工抗原的适合噬菌体的淘选要求,TLC检测表明人工抗原合成成功;亲和肽段淘选结果表明：经过四轮淘选,噬菌体出现富集现象,ELISA检测阳性克隆并测序,结果表明,淘选到得阳性噬菌体氨基酸序列为MAPGWVP.竞争性ELISA检测表明,该肽段同DON毒素分子具有特异亲和性,结合率随竞争的线性区间在0.01-0.1μg/ml。表明以该短肽替代常规ELISA检测中的DON免疫抗体,可以用于检测浓度范围为0.01-0.1μg/ml的DON样品,这种方法绕过制备免疫抗体的过程,使DON毒素的免疫检测过程大大简化。

关键词：禾谷镰刀菌 TAIL-PCR 脱氧雪腐镰刀烯醇噬菌体随机肽库绿色荧光蛋白