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皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶的分离纯化及性质

水产学报 2022年第12期46卷 2432-2442页

作者：陈守峰杨汝晴陈玉磊孙乐常张凌晶刘光明曹敏杰集美大学海洋食品与生物工程学院海洋食品深加工协同创新中心

为探究脯氨酰内肽酶(PEP)在皱纹盘鲍性腺发育过程中的作用，实验采用荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析皱纹盘鲍不同组织中PEP的表达情况。通过硫酸铵分级沉淀和连续柱层析，从皱纹盘鲍性腺中分离纯化得到高纯度天然PEP。利用液相色谱串联... 详细信息

为探究脯氨酰内肽酶(PEP)在皱纹盘鲍性腺发育过程中的作用，实验采用荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析皱纹盘鲍不同组织中PEP的表达情况。通过硫酸铵分级沉淀和连续柱层析，从皱纹盘鲍性腺中分离纯化得到高纯度天然PEP。利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定肽片段序列，以Suc-Gly-Pro-MCA为底物分析PEP的酶学性质。利用圆二色谱分析温度对PEP结构的影响；采用免疫印迹(Western blot)和qRT-PCR分析鲍性腺在不同发育时期PEP的蛋白和基因表达水平。结果显示，皱纹盘鲍的性腺中，PEP基因表达量和酶活性最高。利用硫酸铵分级沉淀和连续柱层析，从性腺中分离纯化得到分子量约为82 ku，等电点约为5.5的PEP,LC-MS/MS分析得到502个氨基酸残基，与NCBI中皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶(KY214290)一致。PEP的最适温度和最适pH分别为25℃和6.0，在15～25℃和pH 5～8条件下能够保持较高的活性。随着温度升高，PEP的二级结构有明显的改变，拟合热变性温度为(51.4±0.2)℃。PEP在雄性和雌性性腺的各个生长期均能被检出，在雄性性腺的成熟中期和雌性性腺的成熟后期表达量最高。研究表明，PEP在鲍性腺不同发育时期表达量的差异表明其可能参与性腺发育的过程。

关键词：皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶纯化性质分析性腺发育

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脯氨酰内肽酶研究进展

生物化学与生物物理进展 2000年第2期27卷 171-174页

作者：李民陈常庆中国科学院上海生物工程研究中心上海200233

脯氨酰内肽酶 (prolylendopeptidase ,PEP) [EC3 4 2 1 2 6 ]是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶 ,能降解许多多肽类神经递质和激素 ,其活性的异常会引起精神、认知过程的障碍 .一些PEP的专一性抑制剂 (如JT... 详细信息

脯氨酰内肽酶 (prolylendopeptidase ,PEP) [EC3 4 2 1 2 6 ]是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶 ,能降解许多多肽类神经递质和激素 ,其活性的异常会引起精神、认知过程的障碍 .一些PEP的专一性抑制剂 (如JTP 4819)显示在莨菪胺引起的小鼠记忆障碍模型中有改善记忆的药理作用 .猪肌肉PEP晶体结构的解析推动了PEP的研究 .

关键词：脯氨酰内肽酶丝氨酸蛋白酶晶体结构作用机理

鲈鱼脯氨酰内肽酶的分离纯化、性质分析及分子克隆

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食品科学 2021年第14期42卷 78-85页

作者：杨汝晴陈守峰肖琳琳陈玉磊孙乐常张凌晶刘光明曹敏杰集美大学食品与生物工程学院福建厦门361021 海洋食品深加工协同创新中心辽宁大连116034

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)。通过液相色谱-串联质谱分析,得到43个与红鳍东方鲀的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP。以琥珀酰-甘... 详细信息

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)。通过液相色谱-串联质谱分析,得到43个与红鳍东方鲀的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP。以琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素为底物,确定PEP的最适pH 6.0和最适温度35℃。温度变化对PEP活力的影响较大,通过圆二色谱检测显示加热对PEP的二级结构有较为明显的影响,且热变性不可逆。通过分子克隆技术获得PEP全长cDNA开放阅读框含2226个核苷酸,编码741个氨基酸残基,预测分子质量为84.12 kDa。通过同源建模得到鲈鱼PEP的分子结构,PEP为典型的α/β水解酶折叠排列,其催化三联体(His-711、Asp-672、Ser-585)被β-折叠形成的螺旋桨区域的中心通道所覆盖。催化活性中心空间构象稳定对维持PEP活力至关重要,而其独特的分子结构是底物特异性的基础。

关键词：鲈鱼脯氨酰内肽酶纯化性质分析圆二色谱同源建模

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脯氨酰内肽酶水解啤酒蛋白的研究

食品与发酵工业 2008年第2期34卷 113-116页

作者：周丽娜张鹭路福平杨迪向先长齐齐哈尔大学生命科学与工程学院黑龙江齐齐哈尔161006 天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

将脯氨酰内肽酶(PEP)添加在啤酒后酵液中,通过冷混浊实验分析脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的影响。结果表明,添加5mg/L的脯氨酰内肽酶就能有效地提高啤酒的非生物稳定性;采用75%硫酸铵沉淀啤酒蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示,... 详细信息

将脯氨酰内肽酶(PEP)添加在啤酒后酵液中,通过冷混浊实验分析脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的影响。结果表明,添加5mg/L的脯氨酰内肽酶就能有效地提高啤酒的非生物稳定性;采用75%硫酸铵沉淀啤酒蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示,啤酒蛋白电泳图谱的分布主要表现为8～14.4 ku的窄带和35～45 ku的宽带,而经脯氨酰内肽酶处理的啤酒蛋白电泳图谱中8～14.4 ku的条带消失,说明此蛋白被脯氨酰内肽酶水解。

关键词：啤酒蛋白脯氨酰内肽酶冷混浊 SDS-PAGE电泳

丙戊酸钠抑制脯氨酰内肽酶活性对非酒精性脂肪性肝病进展的影响

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温州医科大学学报 2022年第8期52卷 657-662页

作者：李梦婷蒋黛西张建斌魏建东陈长喜李红亮宁波大学附属人民医院消化内科浙江宁波315000 上海交通大学医学院附属新华医院消化内科上海200092 上海市宝山区中西医结合医院急诊科上海201900

目的:探索丙戊酸钠对高脂高胆固醇饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠的影响。方法:随机选取42只7~8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组、模型组和干预组。对照组饲以标准饲料,模型组及干预组饲以高脂高胆固醇饲料,8周后干预组... 详细信息

目的:探索丙戊酸钠对高脂高胆固醇饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠的影响。方法:随机选取42只7~8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组、模型组和干预组。对照组饲以标准饲料,模型组及干预组饲以高脂高胆固醇饲料,8周后干预组给予丙戊酸钠(0.4%丙戊酸钠饮用水),对照组和模型组给予常规饮用水,继续干预8周后处死小鼠。观察小鼠体质量、肝指数、血清生化指标和肝组织病理学改变,并探究其与脯氨酰内肽酶(PREP)之间的关系。结果:与对照组比较,模型组小鼠的体质量、肝指数、脂睾指数均显著升高(P0.05)。模型组小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素均显著高于对照组(P0.05)。模型组小鼠肝脏出现明显的脂肪变性、炎症及气球样变,经丙戊酸钠干预后,脂肪变性和炎症明显改善,NAFLD活动度积分(NAS)显著下降(P0.05);干预组PREP蛋白活性为(397.41±9.63)pmol·mg^(-1)·min^(-1),较模型组低(P0.05)。结论:丙戊酸钠能通过抑制PREP活性改善NAFLD模型小鼠肝脏的脂肪变性和炎症。

关键词：丙戊酸钠非酒精性脂肪性肝病脯氨酰内肽酶小鼠

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的高效表达

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生物化学与生物物理学报 2000年第2期32卷 183-186页

作者：李民徐皓陈常庆中国科学院上海生物工程研究中心!上海200233

采用PCR分段克隆法将点状产气单胞菌点状亚种 (Aeromonaspuctatasubsp .puctata)脯氨酰内肽酶 ( pro lylendopeptidase ,apPEP)的编码区基因分成 3段扩增并拼接成编码 690个氨基酸的完整基因apPEP ,将其克隆在表达载体 pBL和 pKKH上 ,... 详细信息

采用PCR分段克隆法将点状产气单胞菌点状亚种 (Aeromonaspuctatasubsp .puctata)脯氨酰内肽酶 ( pro lylendopeptidase ,apPEP)的编码区基因分成 3段扩增并拼接成编码 690个氨基酸的完整基因apPEP ,将其克隆在表达载体 pBL和 pKKH上 ,构建成温度和IPTG诱导型高效表达apPEP的重组大肠杆菌BL2 1/ pBL PEP和BL2 1/pKKH PEP。诱导后 ,重组apPEP的表达量占菌体总蛋白质的 3 0 %左右 ,活力是野生菌的 10 0倍左右 ,表达产物为可溶性的胞内蛋白 ,非还原SDS PAGE显示为单体 ,分子量为 76kD ,与基因序列预测的分子量一致。采用阴离子HPLC纯化得到了纯度大于 90 %的重组apPEP ,酶比活力为 67u/mg。N端氨基酸序列测定的结果证实了表达的正确性。

关键词：脯氨酰内肽酶大肠杆菌高效表达纯化

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因克隆与序列测定

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生物化学与生物物理学报 1999年第5期31卷 567-571页

作者：沈国祥史济平上海医科大学药学院生物合成教研室!上海200032

点状产气单胞菌点状亚种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｐｕｎｃｔａｔａｓｕｂｓｐ．ｐｕｎｃｔａｔａ）具有脯氨酰内肽酶（ｐｒｏｌｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰＥＰ）活性。将其染色体ＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ部分酶切后回... 详细信息

点状产气单胞菌点状亚种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｐｕｎｃｔａｔａｓｕｂｓｐ．ｐｕｎｃｔａｔａ）具有脯氨酰内肽酶（ｐｒｏｌｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＰＥＰ）活性。将其染色体ＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ部分酶切后回收８～１６ｋｂ的ＤＮＡ片断，与ＥｃｏＲＩ消化载体ｐＵＣ１９连接后转化Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５α，用该酶的专一性底物Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏβｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ从质粒库中筛选到一株阳性克隆，该重组质粒上的１２ｋｂＥｃｏＲＩ片断经亚克隆后获得３．５ｋｂＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｃＩＩ的活性片断。构建该片断的限制性内切酶谱并进行核苷酸序列的测定，获得长度为２０７３ｂｐ的脯氨酰内肽酶基因完整的ＯＲＦ，编码由６９０个氨基酸组成的酶，计算得分子量为７６４６７。其氨基酸一级结构与已克隆的嗜水气单胞菌、脑膜炎脓毒黄杆菌、猪脑、人淋巴细胞和狂怒火球菌的ＰＥＰ分别具有９２．３％、５３．２％、３３．５％、３３．２％和２０．５％的同源性：同源性比较显示该酶含有由Ｓｅｒ５３８、Ａｓｐ６２２和Ｈｉｓ６５７组成的催化三联体。

关键词：脯氨酰内肽酶丝氨酸蛋白酶基因克隆核苷酸序列

脯氨酰内肽酶在小鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用初探

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脯氨酰内肽酶在小鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用初探

作者：李梦婷上海交通大学

学位级别：硕士

背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现,其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关的肝硬化和肝细胞癌。在我国,该病已成为最主要的慢性肝脏疾病之一,约占我国肝脏疾病比例的49.3%... 详细信息

背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现,其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关的肝硬化和肝细胞癌。在我国,该病已成为最主要的慢性肝脏疾病之一,约占我国肝脏疾病比例的49.3%。虽然目前已经认识到饮食习惯改变、环境和遗传因素等共同导致的胰岛素抵抗、肥胖和肠道菌群改变等是NAFLD的发病基础,但NAFLD特别是NASH的发病机制仍有待深入阐明。脯氨酰内肽酶(PREP)是一种由约700个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶,能特异性水解含不多于300个氨基酸的肽链中的脯氨酸残基。有研究表明,PREP与胰岛素释放、摄食行为、器官炎症性疾病、炎症细胞因子代谢和肝再生等密切相关。前期体外研究发现PREP可抑制游离脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变,然而,目前尚未见PREP参与NAFLD发病的体内研究报道。为此,本研究采用高脂高胆固醇饮食建立小鼠NAFLD模型,结合PREP特异性抑制剂KYP-2047,观察PREP在NAFLD进展中的动态变化和对疾病发展的影响。方法:雄性野生型C57BL/6J小鼠分成两部分实验。第一部分将小鼠随机分成对照组和模型组,分别给予高脂高胆固醇饲料和标准饲料饲养4w、8w、12w和16w。第二部分将小鼠随机分为对照组、模型组和干预组。对照组饲以标准饲料,模型组和干预组持续饲以高脂高胆固醇饲料,饲养10周后,干预组予以皮下植入胶囊渗透泵持续稳定注射PREP特异性抑制剂KYP-2047,剂量为5mg/kg(体质量)/d,对照组和模型组相应注射等量生理盐水,持续干预6周。实验结束后处死小鼠,收集血清和肝组织等保存待检测。采用自动生化仪测定血清生化指标;采用酶联免疫吸附测定法测定血清空腹胰岛素水平;采用Suc-Gly-Pro-AMC底物法检测肝组织和血清中PREP活性;采用苏木素-伊红染色及Masson染色观察肝脏病理学改变,并计算NAFLD活动度积分(NAS);采用荧光定量PCR法、Western blot法或免疫组织化学法分别检测肝组织PREP、基质金属蛋白酶-8/9、胸腺素β4、金属蛋白酶Meprin-α以及炎症、脂质代谢相关基因和蛋白的表达。结果:高脂高胆固醇饮食处理满4w时小鼠可形成轻度脂肪变性,满8w可达早期NASH,此后NASH呈进行性发展,满16w模型组小鼠出现显著代谢紊乱;肝组织PREP蛋白水平在对照组和模型组之间无统计学差异,但从8w开始模型组血清中PREP活性随造模时间的延长呈动态升高,至造模16周,肝内和血清中活性均显著高于对照组(p均<0.05)。在造模12w末和16w末,模型组肝组织内PREP m RNA、基质金属蛋白酶8/9 m RNA相对表达量和基质金属蛋白酶8/9蛋白水平均显著高于对照组(p均<0.05),而胸腺素β4、Meprin-α蛋白水平均低于对照组(p均<0.05)。抑制剂干预研究发现,模型组肝组织内炎症因子及成脂相关基因表达增加,经过6周PREP特异性抑制剂KYP-2047干预后,肝组织内升高的PREP活性被显著抑制,干预组小鼠肝脏炎症和脂肪变明显减轻,肝酶、胰岛素抵抗指数、炎症和脂质代谢相关因子均显著改善。结论:小鼠肝组织PREP活性在NASH阶段显著升高,可能参与小鼠NASH的进展;应用PREP特异性抑制剂能显著改善高脂饮食诱导的小鼠NASH阶段肝脏炎症和脂肪变,这一作用伴随肝内炎症因子表达下调、脂代谢相关因子和胰岛素抵抗改善。

关键词：非酒精性脂肪性肝炎脯氨酰内肽酶抑制剂炎症小鼠

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脯氨酰内肽酶的分子改造研究

脯氨酰内肽酶的分子改造研究

作者：李晓琳华东师范大学

学位级别：硕士

脯氨酰内肽酶(PEPs)是重要的蛋白酶,可将蛋白质水解为C端是脯氨酸的生物活性肽,该活性肽可用于治疗乳糜泻病。因此,对脯氨酰内肽酶催化性能进行研究,具有重要意义。大量研究表明脯氨酰内肽酶催化效率提升具有很大潜力,然而,目前很少有... 详细信息

脯氨酰内肽酶(PEPs)是重要的蛋白酶,可将蛋白质水解为C端是脯氨酸的生物活性肽,该活性肽可用于治疗乳糜泻病。因此,对脯氨酰内肽酶催化性能进行研究,具有重要意义。大量研究表明脯氨酰内肽酶催化效率提升具有很大潜力,然而,目前很少有研究通过理论计算来改造脯氨酰内肽酶的催化效率,进而加强其在食品工业加工和治疗方面的研究与应用。本研究选择性质优异的来源于嗜热链球菌Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶进行异源表达、纯化,并对其酶学性质进行了探究,结果表示该酶的最适pH为6.6,最适温度为63°C,其对九肽底物SEKTTMPLW的比酶活为11.99 U/mg,酶促反应动力学参数K值为7.48 mM,k值为164.47 min,k/K值为22 min·mM。此外,本课题开发了一种基于完美构象的全新计算机理性设计方法,从脯氨酰内肽酶的催化机理入手,以催化位点Ser的O原子与底物Pro的C原子之间的距离作为增加脯氨酰内肽酶对底物的催化活性的“近进攻态”构象的标准。首先通过同源建模、分子对接、MD模拟等获得酶-底物的稳定复合物结构,通过约束分子动力学(MD)模拟迅速获得了“近进攻态”构象,能量最小化获得了575个酶与底物的结合自由能,然后快速虚拟筛选出9个定点突变。实验结果表明I462W和Q560Y两个突变体的k/K值相比于野生型分别增加了32.7%和6.3%。上述结果表明本课题开发的全新理性设计方法可有效提高脯氨酰内肽酶的催化活性。

关键词：酶催化理论计算脯氨酰内肽酶理性设计定向合成