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脂质纳米颗粒的制备及在基因治疗中的应用

化学通报 2022年第4期85卷 432-440页

作者：张庭瑜唐紫晴李庆覃勇莎苏玉支德福大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室大连116600

基因治疗已经成为人类治疗疾病的一种重要手段。然而,为了将基因药物用于临床,需要更加复杂的递送系统。脂质纳米颗粒(LNPs)系统是目前领先的非病毒递送系统,在治疗诊断学方面取得了许多令人鼓舞的进展,其具有实现基因药物临床治疗应用... 详细信息

基因治疗已经成为人类治疗疾病的一种重要手段。然而,为了将基因药物用于临床,需要更加复杂的递送系统。脂质纳米颗粒(LNPs)系统是目前领先的非病毒递送系统,在治疗诊断学方面取得了许多令人鼓舞的进展,其具有实现基因药物临床治疗应用的潜力。由于LNPs纳米尺寸的优势及类脂化合物的生物相容性和生物降解性,LNPs能够克服阻碍基因药物应用中的障碍,安全而有效地递送核酸进入细胞,已经被广泛地应用于药物递送中。通过改进LNPs的制备方法、合理设计类脂化合物结构或优化LNPs配方将增加LNPs在基因治疗肿瘤以及其他疾病中的应用潜力。本文主要介绍LNPs的制备方法及在基因治疗中应用的最新进展。

关键词：脂质纳米颗粒载体制备脂质药物基因治疗

预防用mRNA疫苗脂质纳米颗粒质量研究及质量控制药学评价的考虑

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中国新药杂志 2023年第24期32卷 2452-2456页

作者：杨丹赵欣李小静李敏国家药品监督管理局药品审评中心北京100038

随着预防用mRNA疫苗研究不断深入,发现了脂质纳米颗粒结构/形态等新问题。根据ICH Q6B理念,从药学评价角度对脂质纳米颗粒的结构特点、变化趋势等进行初步探讨,对其结构特征表征需要额外开展的研究工作也进行了一些探索与思考,以期为预... 详细信息

随着预防用mRNA疫苗研究不断深入,发现了脂质纳米颗粒结构/形态等新问题。根据ICH Q6B理念,从药学评价角度对脂质纳米颗粒的结构特点、变化趋势等进行初步探讨,对其结构特征表征需要额外开展的研究工作也进行了一些探索与思考,以期为预防用mRNA疫苗质量研究及质量控制提供参考。

关键词： mRNA疫苗脂质纳米颗粒粒径形态工艺控制质量研究

基于聚合物纳米颗粒和脂质纳米颗粒用于mRNA递送的研究

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基于聚合物纳米颗粒和脂质纳米颗粒用于mRNA递送的研究

作者：王文丽河北医科大学

学位级别：硕士

mRNA(Messenger RNA,信使RNA)是连接DNA与蛋白质之间的桥梁,更是调节机体中基因功能的重要分子。mRNA具有安全性高、可编码各种蛋白、生产难度低、速度快等优点,主要应用于蛋白质替代疗法、传染性疾病疫苗、肿瘤免疫疗法等。然而mRNA分... 详细信息

mRNA(Messenger RNA,信使RNA)是连接DNA与蛋白质之间的桥梁,更是调节机体中基因功能的重要分子。mRNA具有安全性高、可编码各种蛋白、生产难度低、速度快等优点,主要应用于蛋白质替代疗法、传染性疾病疫苗、肿瘤免疫疗法等。然而mRNA分子量大,电负性强,而且容易被环境和体内的核酸酶所降解。因此构建合适的mRNA递送系统具有重要意义。目前一些递送系统面临降解困难、专利受限等难题。本文开发了基于聚合物纳米颗粒和脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles,LNPs)的mRNA递送系统,并在免疫细胞模型和肿瘤细胞模型中考察了递送效果。第一部分基于聚合物纳米颗粒用于mRNA递送的研究目的:设计合成一系列聚(β-氨基酯)[Poly(β-amino ester),PBAE]类聚合物材料,构建基于聚合物纳米颗粒的递送系统,并在细胞模型上筛选出转染效果最佳的递送体系。方法:利用迈克尔加成反应,调节亲疏水胺单体的种类和比例合成了九种PBAE聚合物,通过核磁共振氢谱(H-Nuclear Magnetic Resonance,H-NMR)和凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography,GPC)对材料进行了表征。自组装构建用于mRNA递送的聚合物纳米颗粒。接下来通过琼脂糖凝胶电泳实验考察聚合物材料与mRNA的最小复合质量比和体系保护mRNA免受核酸酶降解的能力。利用ONE-Glo?Luciferase Assay System试剂盒在两种细胞中筛选转染效果更好的聚合物材料,同时通过MTT考察了体系的细胞毒性。接下来为了增加体系的稳定性引入了PEG化脂质,并且通过透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)、动态光散射粒度仪(Dynamic Light Scattering,DLS)进行表征,然后通过激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)考察了体系的内涵体/溶酶体逃逸能力。结果:通过H-NMR证实了材料的成功合成,利用GPC测定了材料的分子量。通过琼脂糖凝胶电泳实验确定了各材料与mRNA的最小复合质量比,并且证明了体系可以保护mRNA免受核酸酶降解。DC2.4细胞和A549细胞的转染结果表明体系NC18-5@mRNA(50:1,w/w)在细胞水平上具有更优的转染能力。MTT实验表明其具有良好的细胞相容性。血清稳定性的考察表明引入PEG化脂质后可以在不影响转染能力的情况下提高体系的稳定性。最后通过CLSM证明了体系的内涵体/溶酶体逃逸能力。结论:筛选出的NC18-5@mRNA(50:1,w/w)不仅具有优良的保护mRNA免受核酸酶降解的能力及内涵体/溶酶体逃逸能力,而且具有良好的细胞相容性,并且在DC2.4细胞和A549细胞中展现出良好的转染效果。PEG化脂质的引入增加了体系的血清稳定性,这为后续材料的合成与优化提供了方法和借鉴,也为功能性mRNA递送体系的构建提供了指导。第二部分基于脂质纳米颗粒用于mRNA递送的研究目的:合成胆固醇基可电离脂质(CC-II),构建用于mRNA递送的三组分LNPs,并且在细胞模型上筛选出更具转染能力的递送体系。方法:通过H-NMR验证三种胆固醇基可电离脂质是否成功合成。使用微量注射泵,通过微流控技术制备不同组分比例的LNPs。通过正交实验设计在细胞水平初步优化LNPs三组分的摩尔比。通过琼脂糖凝胶电泳实验考察了其保护mRNA免受核酸酶降解的能力。利用ONE-Glo?Luciferase Assay System试剂盒在免疫细胞模型DC2.4和肿瘤细胞模型A549中比较转染效果。接下来通过MTT考察细胞毒性,然后通过CLSM考察CC-PI@mRNA LNPs的内涵体/溶酶体逃逸能力。结果:H-NMR结果证明了胆固醇基可电离脂质的成功合成。正交实验设计初步筛选出了具有较高转染能力的摩尔比例。琼脂糖凝胶电泳实验表明LNPs可以保护mRNA免受核酸酶降解。在DC2.4细胞和A549细胞上的转染结果表明CC-PI@mRNA LNPs(CC-PI:DOPE:DMG-PEG2000=15:20:0.075,摩尔比)具有更强的转染能力。MTT评价表明CC-PI@mRNA LNPs具有良好的细胞相容性。激光共聚焦显微镜观察到其可以成功实现内涵体/溶酶体逃逸。结论:CC-PI@mRNA LNPs(CC-PI:DOPE:DMG-PEG2000=15:20:0.075,摩尔比)不仅具有优良的保护mRNA免受核酸酶降解的能力及内涵体/溶酶体逃逸能力,而且具有良好的细胞相容性,并且在DC2.4细胞和A549细胞中展现出良好的转染效果。这为构建新型LNPs递送平台提供了思路和方法。

关键词： mRNA PBAE 聚合物纳米颗粒胆固醇基可电离脂质脂质纳米颗粒质子海绵效应转染能力

基于脂质纳米颗粒的VEGFA小干扰RNA递送促进软骨的再生重建及其机制研究

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基于脂质纳米颗粒的VEGFA小干扰RNA递送促进软骨的再生重建及其机...

作者：陈怡南开大学

学位级别：硕士

目的:整形修复科的软骨重建大多通过外科手术植入支撑物实现,比如鼻整形术和小耳畸形的自体软骨植入或人工合成假体植入,但存在自体软骨来源受限、假体排斥外露等问题。近年来,基于间充质干细胞(MSCs,mesenchymal stem cells)的组织工... 详细信息

目的:整形修复科的软骨重建大多通过外科手术植入支撑物实现,比如鼻整形术和小耳畸形的自体软骨植入或人工合成假体植入,但存在自体软骨来源受限、假体排斥外露等问题。近年来,基于间充质干细胞(MSCs,mesenchymal stem cells)的组织工程治疗策略,为软骨再生来了新的希望。然而体内的免疫和血管环境可能不利于软骨组织的再生和重建。血管内皮生长因子A(VEGFA,vascular endothelial growth factor A)是血管生成最关键的因子之一,通过阻断VEGFA来抑制微血管浸润,是目前软骨组织工程的一个极有前途的研究方向。本研究构建了具有抗血管策略的组织工程软骨,对软骨再生具有重要的指导意义。方法:通过微流控技术制备包裹VEGFA小干扰RNA(si RNA,small interfering RNA)的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNPs),并通过形态表征、细胞毒性试验,对所制备脂质纳米颗粒进行初步评价。接着对脂质纳米颗粒进行转染效率测定、血管抑制功能、核酸保护功能和免疫逃逸功能检测,以全方面地探究脂质纳米颗粒的功能。然后将脂质纳米颗粒加入到甲基丙烯酸酰化明胶(gelatin methacrylate,Gel MA)水凝胶中,探究其缓释动力学。依据国内外组织工程软骨支架研究的最新进展,构建一个水凝胶-细胞-VEGFA si RNA-LNPs新型组织工程软骨支架。最后,我们将抗血管仿生支架植入裸鼠皮下,8周后对血管浸润及软骨再生情况进行大体修复效果评估、组织学评估和分子生物学评估,进一步探索仿生支架的软骨再生机制原理。结果:脂质纳米颗粒被成功制备,这是一种无毒、安全、高效的递送载体,表现出良好的转染和内体逃逸能力。VEGFA si RNA-LNPs在体外能成功下调VEGFA的表达。将水凝胶-细胞-VEGFA si RNA-LNPs支架植入裸鼠皮下的结果表明,我们在皮下环境中成功实现了软骨的再生。新生的软骨组织更优,不仅有更多的软骨细胞外基质,并且软骨相关标志SOX9以及COL-II、Aggrecan等显著上调。这归因于VEGFA si RNA抑制血管形成,营造了一个局部缺氧和缺乏营养供应的环境,通过上调细胞中的HIF-1α和FOXO来帮助软骨的再生。结论:本研究通过VEGFA si RNA-LNPs抑制微血管浸润,实现了卓越的软骨再生,有望突破临床小耳畸形、鼻整形的材料瓶颈,在软骨再生修复领域具有巨大的潜力,是未来可以选择的一种非常有前景的整形修复研究方向。

关键词：软骨组织工程血管内皮生长因子脂质纳米颗粒小干扰RNA

核壳纳米纤维递送miR29a脂质纳米颗粒以促进肌腱愈合 ——通过交叉调控免疫反应和基质重塑

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核壳纳米纤维递送miR29a脂质纳米颗粒以促进肌腱愈合 ——通过交...

作者：陈威南开大学

学位级别：硕士

目的:肌腱是承受载荷的组织,这种特性依赖于肌腱ECM中胶原的合成和排列。肌腱损伤和断裂后,其固有的胶原结构被破坏。在随后的炎性病理环境中,免疫细胞、成纤维细胞和腱细胞均参与重建。但新生ECM成分复杂,排列紊乱,难以达到满意的承重... 详细信息

目的:肌腱是承受载荷的组织,这种特性依赖于肌腱ECM中胶原的合成和排列。肌腱损伤和断裂后,其固有的胶原结构被破坏。在随后的炎性病理环境中,免疫细胞、成纤维细胞和腱细胞均参与重建。但新生ECM成分复杂,排列紊乱,难以达到满意的承重能力。肌腱的次级愈合和腱周粘连是跟腱损伤后主要的临床问题,有导致跟腱的运动功能受损和增加再断裂的风险。因此,如何减轻乃至逆转这种炎性病理状态,如何加速优质ECM的再生,是相当有价值的。方法:本研究我们利用微流控技术制备了LNPs-miR29a复合体。它们被负载于核壳纳米纤维膜,从而实现在肌腱损伤区域的局部递送,纳米纤维由抗粘连材料PELA组成。细胞实验用于探究该膜对肌腱细胞和巨噬细胞的影响。采用大鼠跟腱损伤模型进行体内试验,由纳米纤维膜包绕损伤肌腱部位,以评估膜对肌腱愈合和腱周粘连的影响。结果:在本研究中,我们发现miR29a是肌腱损伤的潜在治疗靶点,能够实现免疫反应和基质重塑的交叉调控。体外实验表明miR29a能够通过调节胶原合成和NF-κB活化来减轻肌腱细胞的炎性损害,并通过抑制炎症小体来减少巨噬细胞的炎性极化。大鼠跟腱损伤模型中,组织学和功能学分析表明PELA+LNPsmiR29a膜处理组的肌腱修复效果最好,表现为更好的胶原构成和排列、更高的力学强度和更满意的功能恢复。结论:我们开发了功能化的纳米纤维膜,促进ECM重塑和改善再生免疫微环境,用以解决肌腱愈合不良和腱周粘连的临床问题。

关键词：脂质纳米颗粒 MicroRNA-29a 同轴静电纺丝肌腱免疫反应基质重塑

mRNA脂质纳米颗粒生产质量控制关键考虑要点分析及探究

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中国食品药品监管 2022年第12期 16-23页

作者：佟乐孙巍杨亚莉王佑春杨振中国食品药品检定研究院

脂质纳米颗粒(LNP)递送技术的突破,推动了RNA疗法的发展,受到了广泛关注。mRNALNP制备是mRNA疫苗从纯化mRNA(原液)到成品(制剂)的生产过程的关键步骤,涉及脂质制备或筛选、mRNA包封/装载、纯化等工序,目前最常用的方法是将水相和脂质成... 详细信息

脂质纳米颗粒(LNP)递送技术的突破,推动了RNA疗法的发展,受到了广泛关注。mRNALNP制备是mRNA疫苗从纯化mRNA(原液)到成品(制剂)的生产过程的关键步骤,涉及脂质制备或筛选、mRNA包封/装载、纯化等工序,目前最常用的方法是将水相和脂质成分快速混合的微流控法。基于LNP自组装的特点,本文梳理了微流控条件下mRNA-LNP制备的考虑要点。首先,在制备过程中,各脂质成分比例、脂质和水相的流体动力学、pH值控制、缓冲液的选择与LNP颗粒大小、形态、封装效率和表面电荷等关键质量属性息息相关,需要不断探索mRNA-LNP制备的关键工艺参数和最佳操作范围。其次,还应关注mRNA在被包封到LNP过程中的降解问题,以及生产过程中mRNA原液的任何变化对LNP的影响。此外,本文还提出了针对含有多种mRNA分子的疫苗(如自我扩增型mRNA疫苗和多价疫苗)中LNP制备的考虑要点,以期为国内相关企业在mRNA疫苗制剂生产质量控制方面提供有益参考。

关键词：脂质纳米颗粒 mRNA疫苗制剂质量控制

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基于环状RNA开发核酸药物研究进展

生物工程学报 2024年第5期40卷 1421-1430页

作者：郭士琳李常昆吕得玚陈骐福建师范大学南方生物医学研究中心福建福州350117 福建省天然免疫生物学重点实验室福建福州350117

核酸药物是继化学药物和蛋白质药物之后的第三代药物,其中mRNA疫苗在抗击新型冠状病毒中发挥了重要作用。mRNA疫苗因其开发周期短,制备工艺成熟,在应对病毒变异、支持全球供应上具有显著优势。相比mRNA,环状RNA(circular RNA, circRNA)... 详细信息

核酸药物是继化学药物和蛋白质药物之后的第三代药物,其中mRNA疫苗在抗击新型冠状病毒中发挥了重要作用。mRNA疫苗因其开发周期短,制备工艺成熟,在应对病毒变异、支持全球供应上具有显著优势。相比mRNA,环状RNA(circular RNA, circRNA)是一类具有更稳定的结构、更长的半衰期、更弱免疫原性等优点的分子,并且已被证实可以高效表达蛋白产物,由此可见环状RNA药物的开发前景更为广阔。虽然环状RNA的生物学功能有大量研究,但基于环状RNA开发核酸药物的研究还很少。本文概述了环状RNA的基本信息,总结了环状RNA的合成路径及作用机制,并讨论了该领域的发展方向,希望为环状RNA药物的研发提供一些启示和帮助。

关键词：环状RNA 核酸药物内部核糖体进入位点脂质纳米颗粒外泌体

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mRNA技术在疫苗领域的探索与实践

中国药科大学学报 2024年第1期55卷 127-136页

作者：刘健康希诺生物(上海)有限公司上海201306

mRNA疫苗是将编码抗原的mRNA递送到人体细胞内,在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生有效的免疫反应。与传统疫苗相比,mRNA疫苗安全性好、研发周期短、免疫效力高,可以同时刺激细胞免疫反应和体液免疫反应。随着核苷酸修... 详细信息

mRNA疫苗是将编码抗原的mRNA递送到人体细胞内,在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生有效的免疫反应。与传统疫苗相比,mRNA疫苗安全性好、研发周期短、免疫效力高,可以同时刺激细胞免疫反应和体液免疫反应。随着核苷酸修饰技术和递送技术的发展,mRNA疫苗也迎来了广阔的应用前景。本文对mRNA技术及其在疫苗领域的应用进行综述,以期为正在或即将开展mRNA疫苗研发工作的学者提供理论和实践指导。

关键词：疫苗信使核糖核酸修饰核苷核酸递送脂质纳米颗粒

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猴痘病毒mRNA疫苗的研发进展

科学通报 2024年

作者：刘欣悦胡泊樊渝川翁郁华黄渊余杨明辉北京理工大学医学技术学院前沿交叉科学研究院生命学院

猴痘病毒(monkeypox virus, MPXV)属于正痘病毒科正痘病毒属,是一种双链DNA病毒. 2022年7月,猴痘病毒的全球流行使得世界卫生组织将其定义为国际关注的突发公共卫生事件(public health emergency of international concern, PHEIC).猴... 详细信息

猴痘病毒(monkeypox virus, MPXV)属于正痘病毒科正痘病毒属,是一种双链DNA病毒. 2022年7月,猴痘病毒的全球流行使得世界卫生组织将其定义为国际关注的突发公共卫生事件(public health emergency of international concern, PHEIC).猴痘病毒与天花病毒具有高度的同源性和较强的传染性,然而目前并没有针对猴痘病毒的疫苗被批准应用. mRNA疫苗技术是一种新型的疫苗形式,其相关修饰技术于2023年荣获诺贝尔生理学或医学奖,相较于传统疫苗其具有更好的免疫保护效果.本文概述了猴痘病毒mRNA疫苗的研发进展并讨论了猴痘mRNA疫苗的潜在挑战和未来发展方向,以期为进一步推动这一研究领域的发展提供参考.

关键词：猴痘病毒 mRNA疫苗 PHEICs 脂质纳米颗粒痘苗病毒