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斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌的PLGA微球和脂质体疫苗的制备及免疫原性研究

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斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌的PLGA微球和脂质体疫苗的制备及免...

作者：邓龙君四川农业大学

学位级别：硕士

本文研究了斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌的PLGA微球疫苗和脂质体疫苗对斑点叉尾鮰免疫机能和免疫保护效应的影响。主要结果如下: 1.本试验采用复乳挥发法制备了嗜麦芽寡养单胞菌的PLGA微球疫苗,并测定其粒径大小约为(2.2±0.5)μm。60... 详细信息

本文研究了斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌的PLGA微球疫苗和脂质体疫苗对斑点叉尾鮰免疫机能和免疫保护效应的影响。主要结果如下: 1.本试验采用复乳挥发法制备了嗜麦芽寡养单胞菌的PLGA微球疫苗,并测定其粒径大小约为(2.2±0.5)μm。600尾体重100±5g的斑点叉尾鮰分为15组,注射、口服、浸泡三种免疫途径各5组,每个免疫途径又包括低、中、高三种不同免疫剂量的PLGA微球疫苗组(Ⅰ组-Ⅲ组)、生理盐水对照组(Ⅳ组)和未包被嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗组(Ⅴ组),疫苗免疫每两周1次共计3次。定期采血后测定血液免疫指标的变化,并用细菌攻毒试验检测免疫保护效应。结果显示本实验制备的PLGA微球疫苗包封率为88.93%,各免疫途径的疫苗免疫组均较生理盐水对照组能明显增强白细胞的吞噬活性、杀菌活性、血清溶菌酶、补体C、血清蛋白含量和抗体IgM水平。腹腔注射活菌攻毒后,注射免疫途径剂量为200μg/尾和100μg/尾受免组鱼(73.33%,66.68%)相对成活率较嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗(64.17%)受免组鱼分别高出9.16%、2.51%,而50μg/尾的受免组鱼(49.17%)相比灭活苗组则低15%;口服免疫途径PLGA微球疫苗免疫组(Ⅰ组-Ⅲ组)的相对存活率分别为43.33%、65%和75%,而灭活苗口服组Ⅴ组仅有6.68%,表明PLGA微球疫苗对嗜麦芽寡养单胞菌病具有显著的免疫保护效应;而浸泡各免疫组的保护效应则不明显。 2.试验还采用反相蒸发法制备了脂质体疫苗,并用透射电镜测定其粒径大小约为(1±0.3)μm。将体重600±5g的斑点叉尾鮰分为15组,采用口服、注射和浸泡三种免疫方式各5组,每个免疫方式又包括低、中、高三种剂量的脂质体疫苗组(1组-3组)、生理盐水对照组(4组)和灭活苗组(5组),免疫每两周1次共3次。定期采血测定血液免疫指标的变化,并用细菌攻毒检测免疫保护效应。结果显示本实验制备的脂质体疫苗包封率为53.23%,各免疫途径的疫苗免疫组均能较对照组明显提高受免组鱼的血液免疫指标水平。腹腔注射活菌攻毒后,注射免疫剂量为200μg/尾、100μg/尾的受免组鱼相对成活率分别为80%、70.83%,较灭活苗受免组鱼分别高15.83%和6.66%,而50μg/尾的受免组鱼(53.33%)相比灭活苗组则低10.84%;口服途径脂质体疫苗免疫组(1组-3组)的相对存活率分别为39.18%、51.68%和58.33%,而灭活苗口服组5组仅有6.68%,表明脂质体疫苗能有效的保护抗原的免疫原性避免被破坏;浸泡免疫时可能受到水中阳离子和有机物的影响而导致免疫保护效应不理想。

关键词：斑点叉尾鲴嗜麦芽寡养单胞菌 PLGA微球疫苗脂质体疫苗免疫

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人用狂犬病毒脂质体疫苗的制备及性质

中国生物制品学杂志 2006年第6期19卷 589-591页

作者：郭秀侠福泉陈妍徐军夏滨姜媛丽胡晓明于洪涛盛军长春生物制品研究所病毒学研究室长春130062 内蒙古医学院附属医院检验科呼和浩特010050 吉林大学生命科学学院长春130012

目的制备人用狂犬病毒脂质体疫苗,并考察其制剂学及毒理学性质。方法以氢化大豆磷脂、胆固醇、十八胺为原料,采用反相蒸发法(REV)制备脂质体,加入纯化狂犬病毒抗原,以冻干重建法(DRV)制备狂犬病毒脂质体疫苗。在电镜下观察其形态,测定... 详细信息

目的制备人用狂犬病毒脂质体疫苗,并考察其制剂学及毒理学性质。方法以氢化大豆磷脂、胆固醇、十八胺为原料,采用反相蒸发法(REV)制备脂质体,加入纯化狂犬病毒抗原,以冻干重建法(DRV)制备狂犬病毒脂质体疫苗。在电镜下观察其形态,测定其包封率和体外释放率,用激光衍射粒度分析仪测定其粒径分布及平均粒径,并进行局部刺激性、过敏反应及异常毒性试验。结果所制备的狂犬病毒脂质体疫苗形态呈圆形或椭圆形,粒径分布均匀,平均粒径为12.25μm左右,包封率在60%以上。无刺激性,无异常毒性,过敏反应检测合格。结论所制备的狂犬病毒脂质体疫苗性质稳定,可作进一步研究。

关键词：狂犬病毒脂质体疫苗性质

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脂质体作为疫苗佐剂的研究进展

中国民族民间医药 2014年第1期23卷 27-29页

作者：王礼燕郭亚东鲁卫东昆明医科大学药学院云南昆明650500

总结近年来的有关文献,对疫苗免疫佐剂的研究现状及主要的免疫佐剂脂质体的理化性质与免疫原性、脂质体疫苗的特点进行了归纳、分析和综述,对脂质体作为疫苗免疫佐剂存在问题及研究方向提出建议。

关键词：免疫佐剂脂质体脂质体疫苗研究进展

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脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗的制备及其免疫效果研究

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脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗的制备及其免疫效果研究

作者：马藤菲山东农业大学

学位级别：硕士

2010年3月,我国东南地区出现以种鸭、产蛋鸭严重产蛋下降为主要特征的急性传染病。随后,该病迅速蔓延至山东、安徽、福建、河南、河北等地,给我国的水禽养殖业带来巨大的经济损失。2010年10月,经过我国多个水禽岗位体系专家团队的共同努... 详细信息

2010年3月,我国东南地区出现以种鸭、产蛋鸭严重产蛋下降为主要特征的急性传染病。随后,该病迅速蔓延至山东、安徽、福建、河南、河北等地,给我国的水禽养殖业带来巨大的经济损失。2010年10月,经过我国多个水禽岗位体系专家团队的共同努力,最终确定导致该病的病原为鸭坦布苏病毒。鸭群在感染鸭坦布苏病毒后主要临床症状为:精神沉郁,食欲下降,神经症状明显,死亡率达10-30%。主要剖解变化为:卵巢、脑膜、胰腺、气管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、等多个器官组织出血,尤其是卵泡出血、变性和破裂明显。免疫预防是控制坦布苏病毒感染的重要措施。由于TMUV分离株之间没有明显的变异,亦仅有一种血清型,因此,研制出有效、安全的疫苗进行该病的预防势在必行。本研究旨在通过制备脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗,并对其免疫效果进行研究,为我国的水禽养殖业提供一种切实有效的预防鸭坦布苏病毒的疫苗。首先,通过体外构建pet28a-E重组质粒,并将其转入Rosetta(DE3)菌株,使用终浓度为1m M的IPTG于37°C诱导表达5h得到重组E蛋白,并使用镍柱对表达的蛋白进行纯化,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)方法对表达的蛋白进行验证。E蛋白浓缩后浓度为2.2mg·m L-1。随后,使用逆相蒸发法将纯化的蛋白制备成脂质体疫苗,并使用鱼精蛋白法测定疫苗的包封率,以及对疫苗的生物安全性进行评价等。在制备脂质体疫苗时,卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1,加入一定量的维生素E可抗脂质氧化,之后对制备的疫苗进行安全性评价。脂质体疫苗包封率检测结果为52%,内毒素检测结果为2.3EU·mg-1,脂质过氧化性检测结果为0.12,以上指标均符合《中华药典》对疫苗的要求。最后,通过动物试验对疫苗的免疫效果进行评价,选用弗氏佐剂与脂质体佐剂进行比较。选用84只1日龄樱桃谷雏鸭进行免疫,分为7组:0组(对照组)、1组(脂质体1日龄免疫一次)、2组(脂质体1、7日龄免疫两次)、3组(脂质体7日龄免疫1次)、4组(弗氏佐剂1日龄免疫一次)、5组(弗氏佐剂1、7日龄免疫两次)、6组(弗氏佐剂7日龄免疫1次)。每7d采集一次血液检测血清中抗体水平,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)方法进行抗体检测,结果显示:2组(脂质体1、7日龄免疫两次)比其他组产生的抗体量更高,且抗体持续时间更久,抗体在第四周达到最高值,一直到实验结束后依然保持在阳性值以上。在疫苗免疫三周后对樱桃谷鸭进行攻毒实验,接种剂量为每只鸭1m L 102.4 TCID50,接毒后,每组随机挑选6只每天无菌采集一次血浆,用于病毒血症的检测,无菌采集雏鸭泄殖腔棉拭子及口咽棉拭子,检测病毒排放情况。病毒血症及病毒排毒量检测情况看,脂质体疫苗免疫两次组无病毒阳性检出,其他组均有不同程度的病毒阳性检出。通过抗体水平及病毒排放情况看,脂质体疫苗免疫两次组的免疫保护效果优于其他组。本研究为脂质体包被鸭坦布苏病毒E蛋白疫苗应用于临床预防鸭坦布苏病毒病提供了切实有力的实验依据,对我国将来实现鸭坦布苏病毒的净化具有重要的意义。

关键词：鸭坦布苏病毒 E蛋白脂质体疫苗抗体排毒情况病毒血症

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫原性研究

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免疫学杂志 2008年第4期24卷 392-395,399页

作者：李成文王栩高燕孙万邦余妍冯胜军泸州医学院免疫学教研室四川泸州646000 遵义医学院珠海校区免疫学教研室广东珠海519041

目的探索用脂质体包裹空肠弯曲菌（Camffylobaeter jejuni，CJ）Mr28000～31000外膜蛋白制备安全、稳定、有效的cJ亚单位脂质体佐剂疫苗及其免疫原性、免疫剂量和途径。方法采用薄膜一超声一冻融法制备阴离子脂质体（AL）、阳离子脂质体... 详细信息

目的探索用脂质体包裹空肠弯曲菌（Camffylobaeter jejuni，CJ）Mr28000～31000外膜蛋白制备安全、稳定、有效的cJ亚单位脂质体佐剂疫苗及其免疫原性、免疫剂量和途径。方法采用薄膜一超声一冻融法制备阴离子脂质体（AL）、阳离子脂质体（CL）GJ疫苗后对其进行质量鉴定；用ELISA（间接法）检测经GJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体水平。结果①疫苗无菌试验及热原质试验均合格，均无明显不良反应；②阴、阳离子脂质体疫苗冻融前包裹率分别为32．1％、22．5％，冻融后分别是38．3％、28．4％；③CJ阴离子组比GJ阳离子组血清IgG的OD值显著增高（P〈0.01），与GJ弗氏组无统计学差别（P〉0.1）；CJ阴、阳离子组0．50mg／kg的免疫剂量血清IgG的0D值最大；CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgG的0D值无统计学差别（P〉0．1）；特异性IgG抗体经6个月动态观察，5个月后抗体效价下降。结论①采用薄膜-超声-冻融法制备GJ亚单位佐剂疫苗安全、稳定，冻融法可以提高脂质体疫苗包裹率；②同一剂量的阴离子脂质体疫苗血清抗体水平明显高于阳离子脂质体疫苗；③脂质体疫苗最佳接种剂量为0．50mg／kg，肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异；④较高水平的特异性抗体维持5个月，6个月后应加强免疫。

关键词：空肠弯曲菌外膜蛋白脂质体疫苗免疫原性

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鸡新城疫基因工程亚单位疫苗的研究

鸡新城疫基因工程亚单位疫苗的研究

作者：刘长梅山东师范大学

学位级别：硕士

新城疫（Newcastle Disease，ND）是一种由新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）引起的具有高度传染性的病毒性传染病，能感染鸡、鸽、鸭和野生鹦鹉等多种鸟类，往往给养禽业造成极大的危害。目前用于防制该病的疫苗为传统的常规... 详细信息

新城疫（Newcastle Disease，ND）是一种由新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）引起的具有高度传染性的病毒性传染病，能感染鸡、鸽、鸭和野生鹦鹉等多种鸟类，往往给养禽业造成极大的危害。目前用于防制该病的疫苗为传统的常规疫苗，其研制都是以大量培养病原微生物为基础的，这不仅给疫苗的制造带来局限性，同时存在潜在的不安全因素，如病原微生物灭活不彻底，导致强毒散播;致弱的疫苗存在毒力返强问题等。自70年代发展起来的分子生物学技术为解决传统疫苗的缺陷、研制高效优质的新型疫苗带来了希望。随着分子生物学的快速发展，以分子操作为基础的基因工程疫苗研究方兴未艾，由于基因工程疫苗具有原料来源简单、安全性高、便于区分感染动物和免疫动物、易于制作多价疫苗等优点，使基因工程疫苗具有巨大的发展潜力和市场前景。脂质体可将蛋白质抗原以细胞膜抗原的形式提呈给宿主免疫系统，既可诱发体液免疫，又可诱导细胞免疫，并且对所包被的物质具有缓释作用，为近十几年发展起来的新型抗原载体。本课题将鸡新城疫病毒的重要保护抗原基因-血凝素-神经氨酸苷酶基因克隆到杆状病毒表达载体，并使其在昆虫细胞得到成功表达，利用表达的蛋白质抗原，对鸡新城疫脂质体-基因工程亚单位疫苗进行了系统的研究，取得了如下结果：1．利用血凝试验及血凝抑制试验对重组病毒进行了鉴定，证明重组杆状病毒特异性地表达了鸡新城疫病毒的血凝素-神经氨酸苷酶蛋白（Hemagglutinin-neuraminidase protein，HNP）。2．通过反复的摸索及实践，发现在该脂质体疫苗的制备中，卵磷脂与胆固醇的最佳质量比为2:1，病毒液的最适pH值为7.2-7.6，成功地建立了脂质体-鸡新城疫基因工程亚单位疫苗制备技术。山东帅他人学攸I：毕业论义鸡新城疫林H丁程亚平位疫苗的研九3．利用电子显微镜、紫外分光光度计、无菌检验、安全性检验等对脂质体疫苗进行了质量检测，结果表明研制的脂质体疫苗符合常规疫苗的质量要求。4．对脂质体疫苗进行了免疫剂量筛选试验和免疫效力检测，结果表明脂质体疫苗免疫后的血凝抑制抗体效价可达 51 OgZ，攻毒保护率为60％，免疫后IL－2（lute，1。。巾i n 2，IL－2）的表达量增加。通过本研究，成功建立了脂质体－鸡新城疫基因工程亚单位疫苗制备技术，为脂质体－重组蛋白疫苗的研制提供了有重要参考价值的‘欠验十物学数折Z，为脂质休疫十穴’1;，。”中’文际应用打卜了良灯的尽川比。

关键词：鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗脂质体疫苗重组杆状病毒血凝素─神经氮酸苷酶昆虫细胞血凝实验血凝抑制实验白细胞介素-2 γ-干扰素细胞免疫体液免疫反转录聚合酶链反应鸡骨髓单核细胞生长因