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枯草芽孢杆菌利用阿拉伯糖合成丰原素的理性代谢优化

枯草芽孢杆菌利用阿拉伯糖合成丰原素的理性代谢优化

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作者：靳佳琦天津大学

学位级别：硕士

丰原素是芽孢杆菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤及抗生物黏附等多种活性的两亲性环脂肽。本文主要通过氮源优化与理性代谢改造等策略,构建了能够利用阿拉伯糖高效生产丰原素的枯草芽孢杆菌优势工程菌株。为筛选阿拉伯糖作为发酵碳源时最适... 详细信息

丰原素是芽孢杆菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤及抗生物黏附等多种活性的两亲性环脂肽。本文主要通过氮源优化与理性代谢改造等策略,构建了能够利用阿拉伯糖高效生产丰原素的枯草芽孢杆菌优势工程菌株。为筛选阿拉伯糖作为发酵碳源时最适合生产丰原素的氮源,以实验室保藏的引入4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因sfp和多效调控因子基因deg Q的BSJ00作为初始菌株,探究了氮源对丰原素产量的影响。实验结果表明水溶性黄豆饼粉是最适合生产丰原素的氮源,所产生的丰原素是质荷比(m/z)为1463.8、1464.8、1477.8、1489.8、1491.8、1505.8、1506.8左右的混合物,最高丰原素的产量达到了121.20 mg/L。对丰原素生物合成基因簇的启动子进行替换改善了丰原素的生物合成。采用CRISPR-Cas9技术分别以P、P及P启动子替换BSJ00丰原素生物合成基因簇原有的启动子。结果表明P和P的替换均不利于丰原素的合成,而以P启动子替换的菌株BSJ02的丰原素产量比BSJ00增加了13.07%,达到137.05mg/L。进一步的相对荧光强度分析揭示了P启动子在枯草芽孢杆菌中时期依赖性的表达特点。脂肪酸作为丰原素合成的重要前体之一,通过脂肪酸通路的理性优化改善了丰原素的合成。在确定脂肪酸通路的单一改造对丰原素的合成具有正向作用后,探究了脂肪酸通路的组合改造对丰原素产量的影响。即以BSJ02作为出发菌株,通过敲除3-羟基酰基Co A脱水酶基因fad B、以P启动子过表达脂肪酸酰基Co A连接酶基因yhf L来强化脂酰Co A的供应,同时导入以P启动子过表达生物素羧化酶Ⅱ基因yng H、外源硫酯酶基因tes A的游离质粒表达盒来增强脂肪酸的合成。所构建的菌株BSJ023的最高丰原素产量达到了258.41 mg/L,丰原素的最终得率为0.013 g/g阿拉伯糖,是BSJ00的2倍。最后,qRT-PCR的结果表明BSJ023中编码丰原素生物合成基因簇与关键调控因子的相关基因相比于BSJ00显著上调了2.58～14.77倍。对立枯丝核菌和灰葡萄孢霉菌的抗真菌活性的分析揭示了BSJ023产生的丰原素具有稳定的理化性质和显著的抗真菌活性。

关键词：枯草芽孢杆菌168 丰原素启动子替换脂肪酸通路改造抗真菌活性

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