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破囊壶菌中WS/DGAT双功能酰基转移酶TrWSD4和TrWSD5生化特性研究并应用于微生物合成蜡酯

破囊壶菌中WS/DGAT双功能酰基转移酶TrWSD4和TrWSD5生化特性研究...

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作者：张南南湖北大学

学位级别：硕士

蜡酯以及甘油三酯是一类中性油脂,是由长链的脂肪醇与长链脂肪酸经过酯化作用形成的一类氧酯,通常为长碳链或超长碳链的结构。蜡酯的自然来源较为广泛,在植物,动物以及微生物等都有着极为重要的生理功能。蜡酯在工业,食品业以及医疗业... 详细信息

蜡酯以及甘油三酯是一类中性油脂,是由长链的脂肪醇与长链脂肪酸经过酯化作用形成的一类氧酯,通常为长碳链或超长碳链的结构。蜡酯的自然来源较为广泛,在植物,动物以及微生物等都有着极为重要的生理功能。蜡酯在工业,食品业以及医疗业等都有着广泛的应用。随着自然资源的锐减,导致了蜡酯的产量低,价格普遍较为昂贵。因此,通过基因工程的手段利用微生物中合成品质高,产量高,易获得的蜡酯以代替传统来源的蜡酯十分必要。蜡酯合成/二酰甘油酰基转移酶(WS/DGAT)是催化蜡酯以及甘油三酯的合成终步骤的限速酶,在植物以及细菌中都有非常重要的作用。本研究对未被报道过的海洋真核微生物破囊壶菌的WS/DGAT基因进行相关研究。本文从破囊壶菌中克隆得到两个WS/DGAT基因TrWSD4,TrWSD5,通过对该两个基因进行功能验证以及酶学性质的初步探究。获得以下实验结果:通过对TrWSD4,TrWSD5生物信息学分析,结果表明TrWSD4,TrWSD5的序列中确实存在该WS/DDGAT家族的催化保守位点与结构域。系统发育树构建结果表明TrWSD4,TrWSD5两个蛋白质序列在进化关系上与WS/DGAT家族属于同一分支。推测TrWSD4,TrWSD5两个基因具有WS/DGAT的功能。通过将这两个基因TrWSD4,TrWSD5在大肠杆菌的中诱导表达与纯化,通过体外的酶活力测定结果表明两种酶的都表现出了较高的蜡酯合成酶WS活性,和较低的二脂酰甘油酰基转移酶DGAT活性。通过对两种酶的底物偏好性分析,结果表明TrWSD4,TrWSD5两种酶表现出较为广泛的底物特异性,对短链以及中长碳链的脂肪酰基辅酶a,都表现出不同程度的偏好性。其中TrWSD4对C12:0-CoA最有亲和力;TrWSD5对C10:0-CoA具有最亲和力;对TrWSD4与TrWSD5进行酶学性质的研究结果表明。两种酶的最适反应盐浓度,结果表明当反应体系中盐浓度增加,TrWSD4的酶活力降低。TrWSD5酶反应的最适盐浓度为800 mM。测得两种酶的最适反应温度测定,结果表明当反应温度为37℃,TrWSD5的酶活力最高。反应温度为47℃时,TrWSD4的酶活力最高。通过将两基因TrWSD4,TrWSD5转化到酿酒酵母H1246缺陷株中,在体内验证两个基因的功能。实验结果表明转化了TrWSD4与TrWSD5的重组酵母能够重新合成蜡酯,但并未形成可见的甘油三酯。研究结果表明蜡酯合成活性是TrWSD4,TrWSD5基因的主要功能,酵母胞内所产蜡酯以中短链脂肪酸棕榈醇酯为主。本研究结果表明破囊壶菌来源的WS/DGAT酶TrWSD4以及TrWSD5具有广泛的底物偏好性以及对酶反应条件的广泛适应性。在酵母胞内合成蜡酯为今后利用微生物生产蜡酯以及甘油三酯等奠定了理论基础。

关键词：破囊壶菌蜡酯 WS/DGAT 脂肪酰基辅酶a 酿酒酵母

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