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脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中Bax/Bcl-2蛋白与细胞凋亡

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中国组织工程研究 2022年第31期26卷 4982-4987页

作者：张丽丽欧亚元小冬张萍淑开滦总医院神经内科河北省神经生物机能重点实验室河北省唐山市063000

背景:神经退行性疾病是一大类能够导致患者工作和生活能力丧失的重大神经系统疑难疾病,目前对于该病尚无有效的治疗方法,脂肪基质细胞能够在体外诱导分化为神经细胞,有望为该类疾病的治疗提供新的方法。目的:探究脂肪基质细胞诱导分化... 详细信息

背景:神经退行性疾病是一大类能够导致患者工作和生活能力丧失的重大神经系统疑难疾病,目前对于该病尚无有效的治疗方法,脂肪基质细胞能够在体外诱导分化为神经细胞,有望为该类疾病的治疗提供新的方法。目的:探究脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中Bax/Bcl-2蛋白的表达变化,进一步研究诱导过程中是否存在线粒体途径介导的细胞凋亡。方法:应用免疫细胞化学法和Western blot法检测脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞48 h及7,14,21 d时星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白,线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2,细胞色素C及Caspase-3的表达,应用透射电子显微镜观察诱导过程中细胞及线粒体的超微结构变化。结果与结论:①在诱导48 h及7,14,21 d时均有胶质纤维酸性蛋白的表达,诱导7 d时胶质纤维酸性蛋白的表达达到高峰期(P0.05);②随着诱导时间的延长,Bax、细胞色素C及caspase-3的表达水平逐渐升高,至诱导14 d时达到高峰(P脂肪基质细胞在诱导分化为星形胶质细胞的第7-14天时处于最佳的存活和分化状态。脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞的过程中,Bcl-2抑制凋亡的作用明显减弱,Bax的促凋亡作用逐渐增强,细胞色素C通过受损的线粒体释放到胞浆中,从而引发线粒体途径的细胞凋亡。

关键词：脂肪基质细胞诱导分化星形胶质细胞线粒体凋亡蛋白

脂肪基质细胞分泌的细胞因子对内皮细胞的作用

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临床心血管病杂志 2006年第10期22卷 624-627页

作者：李宾公曾秋棠王红祥邵诗颖占平云邹萍华中科技大学协和医院心内科华中科技大学同济医学院心血管病研究所武汉430022 华中科技大学协和医院血液科华中科技大学同济医学院血液病研究所

目的:分离培养脂肪基质细胞(ASCs),探讨其分泌的细胞因子及其生物活性作用。方法:人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化后培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表型,ELISA法测定其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因... 详细信息

目的:分离培养脂肪基质细胞(ASCs),探讨其分泌的细胞因子及其生物活性作用。方法:人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化后培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表型,ELISA法测定其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)等,RT-PCR测定相应mRNA表达。ASCs培养液培养人脐静脉内皮细胞,细胞计数测定内皮细胞的增殖,AnexinⅤ/PI双染色法测定内皮细胞的凋亡情况。结果:培养获得ASCs,表型为CD34+、CD105+、CD31-、CD45-,VEGF、HGF、SDF-1α的含量分别为(75±16)、(637±157)、(482±113)ng/L,能促进内皮细胞的增殖(P细胞因子,且对内皮细胞的增殖与凋亡有明显作用。

关键词：脂肪基质细胞细胞因子内皮细胞

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脂肪基质细胞体外分离培养及成软骨定向诱导

中国组织工程研究与临床康复 2010年第36期14卷 6681-6684页

作者：赵大庆李青马钰邓志宏乔莉卢连军邱建华解放军第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科陕西省西安市710032 解放军第四军医大学西京医院病理科陕西省西安市710032

背景:组织工程技术是解决软骨等组织缺损的理想途径,但其种子细胞的来源问题仍未很好地解决。目的:观察脂肪基质细胞体外分离培养及其在体外向成软骨细胞诱导分化的能力。方法:取新西兰白兔皮下脂肪组织,以胶原酶等消化分离获得脂肪基... 详细信息

背景:组织工程技术是解决软骨等组织缺损的理想途径,但其种子细胞的来源问题仍未很好地解决。目的:观察脂肪基质细胞体外分离培养及其在体外向成软骨细胞诱导分化的能力。方法:取新西兰白兔皮下脂肪组织,以胶原酶等消化分离获得脂肪基质细胞,以成软骨诱导培养液对其进行成软骨诱导分化,倒置显微镜下观察脂肪基质细胞体外培养传代情况;免疫组织化学、阿尔辛蓝染色、天狼猩红染色等方法观察脂肪基质细胞成软骨诱导可行性;MTT法观察脂肪基质细胞与诱导培养的脂肪基质细胞体外增殖情况。结果与结论:脂肪基质细胞可于体外分离培养,在成软骨诱导后,可定向分化为软骨样细胞,其可分泌软骨细胞特有的Ⅱ型胶原及酸性黏多糖。原代培养的脂肪基质细胞呈长梭形,胞核椭圆,第3天进入指数增长期,群体倍增时间为55h左右细胞在第4天进入平台期,体外传代培养9代后,细胞开始出现衰老征象;成软骨诱导细胞增殖速度显著增快,随诱导培养时间的延长,细胞体积明显增大,形态由长梭形变为宽大、多伪足的多角形,胞核亦变大,核仁明显,培养第2天进入指数增长期,群体倍增时间为30h左右,在第8天进入平台期,经体外传代培养15代后,细胞增殖速度减慢,开始出现衰老征象。提示脂肪基质细胞在一定条件下可定向分化为软骨细胞,可作为软骨组织工程种子细胞来源。

关键词：脂肪基质细胞软骨诱导体外种子细胞软骨组织工程

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脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞

中国组织工程研究 2013年第1期17卷 44-49页

作者：邓春颖刘斌张志勇张玉芹李燕伊红丽河北联合大学附属医院神经内一科河北省唐山市063000 河北联合大学附属医院神经外科河北省唐山市063000

背景:脂肪基质细胞具有多向分化潜能,在特定条件下,可分化为中胚层起源组织的细胞及内、外胚层起源组织的细胞,在一定条件下可分化为胆碱能神经元。目的:探讨脂肪基质细胞的体外培养及其向胆碱能神经元细胞分化的能力。方法:取2-4周龄... 详细信息

背景:脂肪基质细胞具有多向分化潜能,在特定条件下,可分化为中胚层起源组织的细胞及内、外胚层起源组织的细胞,在一定条件下可分化为胆碱能神经元。目的:探讨脂肪基质细胞的体外培养及其向胆碱能神经元细胞分化的能力。方法:取2-4周龄的SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫,体外分离培养并传代,神经诱导培养基诱导培养后,免疫细胞学检测CD29、CD31和CD44的表达,进行表型鉴定。结果与结论:脂肪基质细胞在体外培养过程中贴壁生长,增殖能力强,其表面标记物CD29、CD44表达阳性,CD31表达阴性。经神经诱导培养基诱导培养后,分化的细胞大部分呈典型的神经元样细胞形态,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2表达阳性。诱导分化后胆碱乙酰转移酶表达阳性。说明脂肪基质细胞可分化为神经元样细胞,分化后的细胞具有合成胆碱乙酰转移酶的功能。

关键词：干细胞脂肪干细胞胆碱能神经元脂肪基质细胞诱导分化大鼠省级基金干细胞图片文章

脂肪基质细胞构建组织工程骨修复下颌骨缺损的实验研究

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第6期15卷 1057-1060页

作者：李晓宇姚金凤刘政华蔡剑波深圳市宝安区人民医院口腔颌面外科广东省深圳市518101 深圳市第二人民医院口腔科广东省深圳市518035

背景:以往实验认为,只有经过成骨诱导后的脂肪基质细胞才能作为骨组织工程的种子细胞。然而成骨诱导周期过程复杂,延长了细胞体外培养时间和花费。目的:探讨未经过成骨诱导的犬脂肪基质细胞作为种子细胞,利用组织工程技术修复犬下颌骨... 详细信息

背景:以往实验认为,只有经过成骨诱导后的脂肪基质细胞才能作为骨组织工程的种子细胞。然而成骨诱导周期过程复杂,延长了细胞体外培养时间和花费。目的:探讨未经过成骨诱导的犬脂肪基质细胞作为种子细胞,利用组织工程技术修复犬下颌骨缺损的可行性。方法:取12个月龄犬背部皮下脂肪,经胶原酶消化法获得单个核细胞,将培养的第3代细胞与双相磷酸钙陶瓷形成支架复合物。在犬下颌骨两侧制备长20mm、高10mm的箱状缺损,拔除缺损区牙齿,分别植入细胞支架复合物和单纯双相磷酸钙陶瓷支架,不进行干预的区域作为空白对照。植入后4周及8周经组织学检测骨缺损修复情况。结果与结论:支架植入后4周,部分支架材料降解,缺损区形成新生骨,双相磷酸钙陶瓷组成骨量明显少于细胞支架复合物组,形成少量新骨及部分新生血管。8周时,两组形成更多的新骨,广泛分布于骨缺损区域,但双相磷酸钙陶瓷组仍明显少于细胞支架复合物组,差异有显著性意义(P脂肪基质细胞复合双相磷酸钙陶瓷可在体内成骨,不经过体外成骨诱导的脂肪基质细胞作为种子细胞,利用组织工程技术可修复下颌骨缺损。

关键词：脂肪基质细胞组织工程双相磷酸钙陶瓷颌骨缺损支架

软骨细胞与脂肪基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

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中华整形外科杂志 2012年第1期28卷 49-54页

作者：吕晓杰周广东刘霞刘凯刘虎仙陈俊男曹谊林中国人民解放军第二炮兵总医院烧伤整形科北京100088 上海交通大学医学院附属第九人民医院中国医学科学院整形外科医院

目的探讨软骨细胞与脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs）共培养体外构建软骨的可行性,并阐明软骨细胞提供的软骨微环境能否诱导ADSCs向软骨细胞分化并形成软骨组织.方法分别培养扩增人ADSCs与猪耳软骨细胞,将2种细胞... 详细信息

目的探讨软骨细胞与脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs）共培养体外构建软骨的可行性,并阐明软骨细胞提供的软骨微环境能否诱导ADSCs向软骨细胞分化并形成软骨组织.方法分别培养扩增人ADSCs与猪耳软骨细胞,将2种细胞按7：3（ADSCs：软骨细胞）比例混匀,以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA,直径8 mm,高2 mm）支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯ADSCs分别接种相同支架作为阳性对照组及阴性对照组,以30％上述浓度（1.5×107/ml）的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照组.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200μl.全部标本均于体外培养8周时取材,通过大体观察、组织学、免疫组化及湿重、蛋白多糖定量检测等方法对新生软骨进行初步评价.多样本t检验统计分析各组湿重及蛋白多糖含量差异.结果各组细胞均与材料粘附良好.共培养组及阳性对照组体外培养8周时基本保持了复合物初始大小和形状,大体观察2组均形成了较成熟软骨组织,组织学显示大量软骨基质和软骨陷窝形成,免疫组化显示软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原分泌.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重为（174±12） mg,平均蛋白多糖含量为（7.6±0.4） mg,两者分别达到阳性对照组的75％（P＜ 0.01）和79％（P＜ 0.01）.阴性对照组（单纯ADSCs组）明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝.低浓度软骨细胞组明显变薄,新生软骨平均湿重为（85 ±5） mg,是阳性对照组的37％（P＜ 0.01）,只在局部形成了不连续的软骨组织.结论软骨细胞与ADSCs共培养能够在体外构建较成熟的软骨组织,软骨细胞能够诱导ADSCs成软骨分化及体外形成软骨组织.

关键词：组织工程软骨细胞脂肪基质细胞共同培养技术

脂肪基质细胞向软骨诱导分化及构建组织工程软骨的实验研究

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脂肪基质细胞向软骨诱导分化及构建组织工程软骨的实验研究

作者：马钰第四军医大学

学位级别：硕士

战时的复合型、多发性创伤以及平时各种外伤、骨关节病等均可造成全身各处软骨损伤、破坏,直接影响患者的外貌和功能,其稳定及便捷的修复对提高患者的生存质量至关重要。随着生活水平的提高,人们对美容的需求也日渐增长,应用软骨进行的... 详细信息

战时的复合型、多发性创伤以及平时各种外伤、骨关节病等均可造成全身各处软骨损伤、破坏,直接影响患者的外貌和功能,其稳定及便捷的修复对提高患者的生存质量至关重要。随着生活水平的提高,人们对美容的需求也日渐增长,应用软骨进行的临床整形美容治疗是整形修复外科研究的热点与难点。自体、同种异体软骨以及人工替代材料不断应用于临床,但它们存在来源受限、形态不匹配以及免疫排斥反应等问题。组织工程学是应用细胞生物学和工程学原理,研究和开发用于修复和改善人体各种组织、器官损伤后的功能和形态的一门科学,它可以避免传统治疗方法的缺陷,是解决组织缺损的一项理想途径。组织工程研究的两个关键因素是良好的种子细胞以及合适的支架材料。目前应用的种子细胞中,自体软骨细胞来源有限,会造成机体附加损伤;同种异体软骨细胞来源广泛,获取容易,但免疫排斥反应较强;胚胎干细胞和骨髓基质干细胞是种子细胞较佳的来源,但都受到伦理道德和取材数量的限制,使其在组织工程的应用上难以推广。支架材料方面,目前用于软骨组织工程支架材料主要有胶原海绵、纤维蛋白凝胶、聚丙交酯(polylactide, PLA )、聚乙交酯(polyglycolide, PGA )及其共聚物(Poly lactide-co-glycolide, PLGA )等,它们存在或亲水性差、细胞吸附力弱、降解慢,或免疫反应大,价格昂贵等诸多缺点。脂肪组织基质中存在着具有自我更新和一定的多能分化潜能、处于全能细胞和成熟细胞之间的成体干细胞,称为脂肪基质细胞(adipose tissue-derived stromal cells, ADSCs )。ADSCs具有多向分化的潜能,能向骨细胞、软骨细胞、上皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞及神经等细胞等定向诱导分化,从而参与组织的损伤修复。其容易获取、采集效率高,对机体损伤小,是一种新型的组织工程种子细胞。羟丙甲基纤维素(Hydroxypropyl methyl cellulose , HPMC)是一种无细胞毒,与机体相容性好,不诱发免疫排斥反应的热敏性水凝胶,其降解速度与组织生长速度相匹配,其可注射性及温度敏感性为创伤修复治疗和重建手术提供了方便、可塑性、微创的生物材料,是一种理想的组织工程生物支架材料。脂肪基质细胞(ADSCs)和羟丙甲基纤维素(HPMC)的联合应用为组织工程修复软骨缺损提供了一个新的途径与方法。材料与方法 1.人脂肪基质细胞(ADSCs)的分离和培养取第四军医大学唐都医院整形科超声乳化后的脂肪组织溶液,经消化、过滤、分离、培养得到ADSCs,加入培养基培养,观察原代及传代后细胞形态,并用MTT法绘制生长曲线。 2.流式细胞仪检测细胞表面标志物取6代细胞,流式细胞仪检测CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD105以及CD106等表面标志。 3.人脂肪基质细胞(ADSCs)向软骨细胞诱导分化ADSCs消化传代,用成软骨培养基重悬培养细胞,接种于新培养瓶中,隔日换液。观察细胞形态变化,细胞爬片行免疫组化和AB/PAS染色以及天狼猩红染色。 4.成软骨诱导细胞在裸鼠体内构建工程化软骨配制合适浓度的羟丙甲基纤维素(HPMC)与诱导细胞混和,分别注入3只裸鼠前后肢背部皮下,每只裸鼠有3个注射点为实验组,1个注射点作为对照,注射不含细胞的凝胶。裸鼠分别于饲养3w、5w和7w处死取材,进行组织和形态的观察。结果 1.细胞形态与生长曲线原代培养的ADSCs 7d左右即达70%0%融合,细胞呈漩涡状排列。经体外培养10代以后,细胞的增殖速度减慢。成软骨诱导细胞增殖速度显著快于未诱导细胞。用MTT法分别做ADSCs及成软骨诱导细胞的生长曲线。ADSCs第3d进入指数增长期,群体倍增时间为55 h左右,细胞在第4d进入平台期;成软骨诱导细胞第2d进入指数增长期,群体倍增时间为30 h左右,细胞增殖迅速,在第8d进入平台期。 2.流式细胞仪检测结果 ADSCs对CD31,CD34以及CD45,CD106表达很低,同时也可观察到CD14,CD56和CD105均呈较低表达,而其对CD49d却有较强的表达,CD49d为ADSCs特异性表达的标志物,而造血系统来源细胞并不表达此标记物。以上均说明实验中所获取的是ADSCs。 3.成软骨诱导细胞的免疫组化和AB/PAS染色、天狼猩红染色结果免疫组化显示ADSCs在成软骨诱导后表达II型胶原;AB/PAS染色的细胞分泌有中性及酸性粘多糖成分,其中有较多的软骨细胞所特有的酸性糖蛋白基质;天狼猩红染色细胞爬片在偏振光下可见具有双折光性的红色和黄色纤维,也可见少量呈网状分布的多彩纤维,分别为诱导细胞分泌出的Ⅰ型和Ⅱ型胶原物质。 4.裸鼠体内构建工程化软骨的结果裸鼠各个注射点皮肤色泽正常,注射混和凝胶

关键词：脂肪基质细胞羟丙甲基纤维素软骨诱导组织工程

脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系

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脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关...

作者：张丽丽河北联合大学

学位级别：硕士

目的探讨在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系，从而为进一步增加获得的ADSCs源性星形胶质细胞数量并延长其存活时间具有重要的科学意义。方法1参照叶长青等的实验方法，将成人脂肪组织体外分离、培养为ADSCs... 详细信息

目的探讨在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系，从而为进一步增加获得的ADSCs源性星形胶质细胞数量并延长其存活时间具有重要的科学意义。方法1参照叶长青等的实验方法，将成人脂肪组织体外分离、培养为ADSCs，倒置相差显微镜下每日观察ADSCs的形态学变化。2将传至第3代的成人ADSCs，应用以含IBMX为主要成分的诱导剂诱导其向星形胶质细胞分化，按照诱导时间的不同分为诱导48h、7d、14d、21d组，并在倒置相差显微镜下观察诱导后细胞形态学的变化。3应用免疫细胞化学法和Western-blotting分别检测未诱导的ADSCs及诱导分化48h、7d、14d、21d的星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(Glial fbrillary acidic protein, GFAP)，Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax及细胞色素C(Cytochrome C)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Cysteine aspartate specificprotease-3)及微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated protein light chain3,LC3)的表达。4流式细胞术Annexin/PI双染法检测未诱导的ADSCs及诱导后48h、7d、14d、21d时细胞的生存状态。5透射电子显微镜下观察诱导后14d的星形胶质细胞线粒体超微结构、凋亡及自噬现象。6MTT法检测ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中细胞的生长状态。7统计学方法：所得实验数据应用Excel2003数据库整理，采用统计软件包SPSS17.0进行分析，数据均以(x s)表示，不同时间点间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1提取的原代ADSCs于24h时已贴壁，倒置相差显微镜下可见细胞呈三角形、短梭形。培养至70d时可见大量呈漩涡状排列的长梭形细胞。2诱导反应48h时，细胞折光性增强，部分细胞的胞体周围伸出细长突起，并有多个分支。诱导反应7d时，细胞胞体折光性显著增强，部分细胞呈现典型的星形胶质细胞形态，并交织成网状。诱导14d时，细胞胞体折光性较7d时更加增强，但细胞形态与7d时无明显变化。诱导21d时，细胞数量减少，细胞的突起较诱导14d时变短、变少。3免疫细胞化学结果显示GFAP在未诱导的ADSCs中无阳性表达，而在诱导后各时间点均可见阳性表达细胞，且在细胞体和突起部位的细胞质均呈阳性表达，GFAP的细胞阳性表达率仅7d与14d无统计学差异(P＞0.05)，至诱导7d时GFAP的阳性表达率达到高峰(P＜0.05)。Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3和LC3在未诱导的ADSCs和诱导反应的各时间点均可见阳性表达，而且阳性表达部位主要位于细胞核周围的细胞浆，而突起部位没有见到明显的阳性表达。Bcl-2的阳性表达率随着诱导时间的延长逐渐降低(P＜0.05)，在未诱导的ADSCs和诱导后各时间点仅7d与14d无统计学差异(P＞0.05)。Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的阳性表达率在未诱导的ADSCs和诱导后48h、7d、14d、21d之间均有明显统计学差异(P均＜0.01)，至诱导14d时Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的阳性表达率均达到高峰(P均＜0.05)。4Western-blotting结果显示，GFAP在未诱导组的ADSCs中无表达，随诱导时间的延长其表达量增加，至7d时达到高峰(P＜0.05)。Bcl-2的表达水平随着诱导时间的延长逐渐降低(P＜0.05)。LC3Ⅰ的表达随诱导时间的延长，逐渐降低(P＜0.05)。Bax、Cyt-c、Caspase-3及LC3Ⅱ的表达水平均逐渐增加，至诱导14d达到高峰(P均＜0.05)。5透射电子显微镜下可见到线粒体的超微结构，凋亡小体结构及自噬现象。6流式细胞术的检测结果显示，诱导反应过程中的细胞存活率随着诱导时间的延长逐渐下降，早期凋亡率、晚期凋亡或坏死率随着诱导时间的延长逐渐升高。7MTT的结果显示，随着诱导时间的延长，细胞的存活数量逐渐下降。结论1ADSCs在应用以IBMX为主要成分的诱导剂诱导分化为星形胶质细胞的第74d时处于最佳的存活和分化状态，此时可以终止反应，并对于所得的细胞进行筛选分离和保存，以便于进行相关的应用和研究。2在正常ADSCs中，经线粒体信号传导途径产生的凋亡和自噬反应较弱。3在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞的过程中，线粒体凋亡和细胞自噬反应明显增强，但自噬反应不足以清除全部受损的线粒体，从而引发线粒体途径介导的细胞凋亡。

关键词：脂肪基质细胞诱导分化星形胶质细胞线粒体凋亡自噬

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脂肪基质细胞源性神经元的突触内吞功能研究

脂肪基质细胞源性神经元的突触内吞功能研究

作者：乔思佳华北理工大学

学位级别：硕士

目的研究脂肪基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)源性神经元是否具有正常神经元的突触内吞功能。方法1应用针吸法获取成人皮下脂肪组织,提取ADSC培养及传代。2选取第三代ADSC,采用β巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)诱导... 详细信息

目的研究脂肪基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)源性神经元是否具有正常神经元的突触内吞功能。方法1应用针吸法获取成人皮下脂肪组织,提取ADSC培养及传代。2选取第三代ADSC,采用β巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)诱导分化为神经元,将细胞分为ADSC组、1h、3h、5h、8h组。3扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)下观察分化各组细胞的三维形态学特征。4 ADSC源性神经元特异性标志物检测:免疫细胞化学法及Western-blotting法检测各组细胞神经元的特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)及微管相关蛋-2(Microtubule associated protein 2,MAP-2)的表达情况。5 ADSC源性神经元突触内吞功能核心标志物检测:免疫细胞化学法、免疫荧光双标法以及Western-blotting法定性、定位和定量检测各组细胞中神经元内吞作用核心蛋白衔接蛋白-2(AP-2)、网格蛋白(Clathrin)、吞蛋白(Endophilin)、动力蛋白(Dynamin)、热休克同源蛋白(Hsc70)的表达情况。6透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)下观察各组分化细胞的超微结构特征。7 ADSC源性神经元突触的内吞功能实验:应用FM1-43神经元突触内吞功能实验和硒化镉量子点(Cadmium selenide quantum dots,Cd Se QDs)神经元突触内吞功能实验检测分化细胞是否具有内吞功能。8统计学分析方法:本实验所获得的实验数据经Excel 2007建立数据库,采用SPSS 17.0软件包进行数据统计分析,数据以sx±表示,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较,LSD检验、Tamhane's T2检验进行两两比较,以P细胞呈梭形生长,诱导分化1h时细胞两端梭形部位变细边长,诱导分化3h时细胞伸出一根较长且末端略膨大的突起,同时可见多根较短突起且两侧伸出类树枝样细小分支,诱导分化5h时细胞突起分支延伸数量增多,其中伸出一根较细长的突起,较长突起末端膨大并且伸出大量微绒毛,诱导分化8h时细胞突起分支减少、断裂,细胞形态退化。3 ADSC源性神经元特异性标志物检测结果:ADSC组未见NSE和MAP-2阳性表达细胞,在诱导分化各组均可见NSE及MAP-2阳性表达细胞。本实验中各组细胞NSE和MAP-2表达水平均于诱导分化5h时达高峰(P均细胞,在诱导分化各组细胞均可见AP-2、Clathrin、Endophilin、Dynamin及Hsc70的阳性表达细胞。随着诱导分化时间延长,AP-2、Clathrin、Dynamin及Hsc70的阳性表达水平均于5h时达高峰(P均0.05)。5透射电子显微镜下观察ADSC组细胞胞质丰富,核饱满,内含少量细胞器,诱导分化1h时细胞逐渐形成短小突起,胞质出现少量溶酶体等细胞器,诱导分化3h时细胞短小突起延长,末端可见较多数量囊泡,可见含有大量线粒体及囊泡的类突触前膜结构及电子致密度较高的类突触后膜结构,诱导分化5h时可见细胞表面大量突起及微绒毛,突起处可见大量形态各异的囊泡结构,胞质内细胞器含量丰富并且富含尼氏体这种神经元的特异性细胞器结构,诱导分化8h时细胞突起及微绒毛数量减少,细胞器肿胀,并且含大量次级溶酶体。6 ADSC源性神经元突触的内吞功能实验结果:FM1-43神经元突触内吞功能实验结果显示ADSC组FM1-43阳性表达细胞外溶液及细胞膜,诱导分化各组细胞可见突起处囊泡呈周围FM1-43阳性表达且中间阴性表达的环状类圆形膜样结构,FM1-43阳性表达强度于诱导5h时达到高峰,Cd Se QDs神经元突触内吞功能实验结果显示ADSC组Cd Se QDs于细胞质中呈云片状阳性表达,诱导分化各组细胞突起处可见呈Cd Se QDs阳性表达颗粒样结构,Cd Se QDs阳性表达强度于诱

关键词：脂肪基质细胞诱导分化反应神经元突触囊泡内吞功能