检索结果-南通市图书馆

作者：饶欢南昌大学

学位级别：硕士

心血管疾病是在全世界死亡率和发病率最高的一个疾病之一。在我国，肥胖和高血压人口达2亿6千万，每年有300万人死于心脑血管疾病，尤其是动脉粥样硬化。我国居民摄食油脂较高，远超过了营养学会推荐的水平。氢化油做为食品加工中常用... 详细信息

心血管疾病是在全世界死亡率和发病率最高的一个疾病之一。在我国，肥胖和高血压人口达2亿6千万，每年有300万人死于心脑血管疾病，尤其是动脉粥样硬化。我国居民摄食油脂较高，远超过了营养学会推荐的水平。氢化油做为食品加工中常用的油脂，其中反式脂肪酸的含量较高。研究表明，高TFAs摄入除了通过升高血清LDL和TG，引起血管内皮损伤外，还可提高可溶性细胞间黏附分子－1（SICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子－1（SVCAM-1）和E－选择素（E-selectin）的表达。虽然有很多研究都报道了TFAs与心血管疾病有关系，但TFAs对血管的影响机制尚不清楚。有学者发现广泛存在于中国日常膳食中的反油酸（9t18:1）和反亚油酸（9t12t18:2）能通过Caspase途径诱导血管内皮细胞凋亡、促进内膜炎性因子释放。流行病学研究已经证实这两种TFAs诱导动脉粥样硬化（AS）程度具有显著差异。近年来的研究表明，脂筏内富含脂类和一些与细胞信号转导有关的组分，这可能就为信号转导的有效进行和各种信号转导途径的“cross talk”提供平台。已有文章报道，多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等可以改变脂筏结构，DHA还可改变脂筏脂肪环境调节白细胞介素2受体信号通路。因此猜测TFAs对细胞的影响可能与脂筏结构有关，一方面可能通过改变脂筏脂肪酸和磷脂组成而影响细胞，一方面可能通过刺激脂筏上受体而诱导细胞凋亡。本研究将对比用脂筏破坏剂破坏细胞膜脂筏与否，TFAs对细胞信号的影响，探讨脂筏及其受体在TFAs引起细胞凋亡中的重要作用，为我国心血管疾病的病因及其防治提供科学依据。本研究首先建立脂筏破坏模型，确定脂筏破坏剂的合理作用时间，在不引起细胞形态及生理指标变化的情况下，采用MTT法观察9t18:1和9t12t18:2对内皮细胞活力的影响，通过流式细胞术检测TFAs对细胞凋亡和周期的影响，进一步通过Western-Blot分析TFAs对凋亡相关蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）和周期相关蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表达量的影响，探讨脂筏对TFAs诱导细胞凋亡及周期变化的影响。根据前期结果，通过Western-Blot分析脂筏上凋亡受体表达，再运用荧光显微镜观察脂筏上受体变化，最后通过高效气相色谱法分析TFAs对细胞脂肪酸组成的影响，得到反油酸诱导细胞凋亡的受体通路。与此同时，通过以上方法和指标对比了脂筏在不同饱和度TFAs诱导细胞生理变化中的介导作用。主要取得如下研究成果： 1.成功建立脂筏破坏模型。脂筏破坏剂MβCD在作用浓度为10mM时，其不引起人脐静脉内皮细胞活力发生显著变化的时间为60min以内，超过60min内皮细胞微观形态开始改变，甚至细胞死亡。在40min时细胞膜胆固醇含量有明显减低，在50min时脂筏的标志蛋白（小窝蛋白）表达量有显著下降，说明在40-60min时，MβCD即可去除脂筏又不会影响细胞的生理功能，因此确定脂筏破坏剂作用浓度为10mM，作用时间为50min。 2.脂筏参与TFAs诱导的细胞凋亡。TFAs可降低细胞活力，促使细胞凋亡。但TFA作用于去除脂筏的内皮细胞时，细胞活力下降减少，凋亡细胞数降低，凋亡相关蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）表达量下降，且同浓度（50μmol/L）的9t12t18:2对上述指标降低能力比9t18:1大，说明脂筏参与了TFAs诱导的细胞凋亡，且对9t12t18:2引起的凋亡能力更大。 3.脂筏参与TFAs诱导的细胞周期改变。当脂筏功能受干扰后，9t18:1和9t12t18:2均能促进内皮细胞由G0/G1期进入S期，使处于增殖期的细胞数量百分比明显增加;对周期相关蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表达量也有显著影响。 4.9t18:1和9t12t18:2均能增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等炎症因子表达量，同浓度下反亚油酸促炎效果更强;去除脂筏后，炎症因子表达显著降低，说明破坏脂筏对炎症有抑制作用。 5.9t18:1作用于内皮细胞，可使凋亡受体Fas聚集在细胞膜上，当去除脂筏后，凋亡受体及配体表达下降，其下游凋亡蛋白表达也降低，由此推测反油酸作用于细胞脂筏，刺激Fas受体与其FasL配体结合，并激活下游凋亡通路，引起细胞凋亡。

关键词：脂筏 9t18:1 9t12t18:2 人脐静脉内皮细胞受体信号通路

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脂筏及PI3K/Akt/SREBP1通路对CA16病毒复制影响的研究

脂筏及PI3K/Akt/SREBP1通路对CA16病毒复制影响的研究

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作者：李兴志黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16,CA16)是小核糖核酸病毒科人肠道病毒属的成员,是婴幼儿手足口病的主要病原体之一。近年来CA16在我国发生了多次流行性暴发,严重危害了我国婴幼儿的健康安全。脂筏是细胞膜上的一种富含胆固醇和... 详细信息

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16,CA16)是小核糖核酸病毒科人肠道病毒属的成员,是婴幼儿手足口病的主要病原体之一。近年来CA16在我国发生了多次流行性暴发,严重危害了我国婴幼儿的健康安全。脂筏是细胞膜上的一种富含胆固醇和鞘磷脂的动态微结构域,脂筏中富集着一些特定种类的蛋白,这些蛋白包括一些病毒的受体以及信号分子等,这使得脂筏可以参与病毒对宿主细胞的入侵以及信号转导反应的发生。所以本研究以CA16病毒为对象,探究脂筏和其相关的PI3K/Akt/SREBP1通路对病毒复制的影响。胆固醇是维持脂筏的稳定结构和生物学功能不可缺少的部分。所以本实验选用可以清除细胞膜胆固醇的甲基-β-环糊精(MβCD)来作为脂筏抑制剂,并通过MTT实验确定MβCD最大工作浓度。分别使用不同浓度的MβCD对细胞进行处理,并通过RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光实验检测病毒对细胞的感染情况。在病毒感染不同阶段分别使用MβCD处理细胞,检测病毒的感染情况确定MβCD抑制病毒感染的具体阶段。对MβCD处理过的细胞进行外源胆固醇的补充,以确认其对病毒的抑制作用的确是通过清除细胞膜的胆固醇而实现的。通过Western blot实验检测病毒感染早期不同时间点Akt的磷酸化以及MβCD的处理对PI3K/Akt通路的影响,并且检测了紫外灭活的CA16病毒感染后PI3K/Akt通路的变化。为了确定CA16病毒感染早期PI3K/Akt通路的作用,使用抑制剂wortmannin对PI3K/Akt通路进行抑制并检测CA16病毒的复制。通过Western blot实验检测CA16感染12 h和24 h时Akt的磷酸化。为了进一步研究CA16感染中晚期PI3K/Akt通路的功能,Westen blot实验检测了CA16病毒感染后SREBP1、INSIG-1蛋白质水平的表达,使用间接免疫荧光实验检测了CA16病毒感染对SREBP-1a和SREBP-1c亚细胞定位的影响,并通过Western blot实验检测了wortmannin处理后SREBP1的变化。为了确定SREBP1对CA16病毒复制的影响,对SREBP1进行了过表达并通过Western blot实验对CA16 VP1进行了检测。结果显示,MβCD可以抑制CA16病毒感染且在感染前处理的抑制效果最明显。外源胆固醇补充可以恢复病毒的感染。CA16病毒感染30 min时磷酸化Akt表达上升,MβCD处理抑制了Akt的磷酸化,而紫外灭活的CA16病毒同样可以引起PI3K/Akt通路的激活。在感染早期PI3K/Akt通路被抑制时,CA16病毒复制也受到了抑制。在CA16感染12 h和24 h时,磷酸化Akt表达上升,而MβCD的处理可以抑制感染12 h时Akt的磷酸化。并且在感染12小时开始SREBP1出现裂解,INSIG-1表达降低,SREBP-1a和SREBP-1c的亚细胞定位也从细胞质转为细胞核。Wortmannin处理后SREBP1没有发生裂解现象。过表达SREBP-1a和SREBP-1c均可以抑制CA16病毒复制。综上所述,脂筏在CA16病毒感染及感染早期和中期激活PI3K/Akt通路中是必需的,PI3K/Akt通路在感染早期调控病毒的复制,在感染中晚期促进了SREBP1的裂解及入核。

关键词：柯萨奇病毒A组16型脂筏 PI3K/Akt通路

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脂筏介导副粘病毒入胞途径的初步探讨

脂筏介导副粘病毒入胞途径的初步探讨

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作者：隋文大连医科大学

学位级别：硕士

目的:近年来的研究发现,哺乳动物细胞质膜中存在着一些脂质组成特异、有序的局限性结构,这些膜异质性区域被称为“微区”(microdomain)或“脂筏”(lipid raft)。而小窝(caveolae)因为具有烧瓶底型凹陷的形态和特殊的标记蛋白小窝蛋白(ca... 详细信息

目的:近年来的研究发现,哺乳动物细胞质膜中存在着一些脂质组成特异、有序的局限性结构,这些膜异质性区域被称为“微区”(microdomain)或“脂筏”(lipid raft)。而小窝(caveolae)因为具有烧瓶底型凹陷的形态和特殊的标记蛋白小窝蛋白(caveolin)成为脂筏重要的一个亚类,与其它类型的脂筏相区别。研究表明,脂筏参与了许多细胞外信号跨膜传递的过程,为膜外分子与膜受体结合提供一个微环境。同时脂筏或小窝还介导了细菌、病毒甚至细菌毒素、朊病毒等感染细胞,成为近年来微生物领域研究的重点。要研究脂筏的作用,其前期工作就是分离提取纯化脂筏并对其进行鉴定。本课题组已在实验室成功分离脂筏,并经鉴定证实,为今后的研究工作奠定坚实的基础。此外,本课题组选用副粘病毒科成员副流感病毒-3(HPIV-3)和新城鸡瘟病毒(NDV)初步探讨了脂筏与病毒感染的关系,以期为今后找到不同病毒通过脂筏入胞的共性,寻找新的抗病毒药物靶点,深入了解细胞内吞的机制打下基础。方法: 1、脂筏的分离提纯与鉴定: 所有操作步骤均在0-4℃下进行。对照组用15mM甲基-β-环糊精预处理,其它操作步骤与实验组相同。两组细胞数均约为2×10个,离心收集细胞沉淀,在细胞团中加入裂解缓冲液,混匀后用Dounce匀浆器轻打10次,再放入冰盒上裂解30min后离心,离心后的上清为去核液约1ml,向去核液中加入2ml 60%的OptiPrep,使其终浓度为40%,将以上稀释物小心放入离心管底部,用细胞裂解缓冲液稀释OptiPrep,使其终浓度分别为30%、25%、5%。按从高到低的顺序逐层加入到离心管中,每个梯度均为2ml。4℃下超速离心,100 000g,5h。从上到下依次收集离心样品9份,每份约1ml,行免疫印迹分析。 2、脂筏介导HPIV-3和NDV入胞的初步探讨 (1)HPIV-3和NDV分别经鸡胚增殖后测定效价, HPIV-3为1:640,NDV为1: 1280。并测定两种病毒的TCID: HPIV-3的TCID为10/0.1ml;NDV的TCID50为10/0.1ml。 (2)以CPE为指标观察药物干预后病毒对细胞的感染性:分别以浓度5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L的甲基-β-环糊精37℃作用于MDCK细胞单层30min,之后以100TCID/0.1ml的HPIV-3或NDV 37℃吸附1.5h,于37℃,5%CO2孵箱培养4天。每日观察特征性细胞病变(CPE)。按统计学方法计算各组药物处理后病毒感染细胞的百分比。 (3)以蚀斑法测定药物干预后病毒对细胞的感染性:配制含0.75%琼脂的无酚红RPMI1640 50℃保温备用。分别用5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L甲基-β-环糊精处理MDCK细胞单层30min,之后感染10的HPIV-3和10NDV, 37℃吸附1.5h,加第一层琼脂,室温固化后置37℃5%CO孵箱培养3天,第4天铺第二层含中性红的琼脂培养基,避光培养数小时或过夜,倒置显微镜下计数蚀斑数,并进行统计学分析。 (4)小窝形态和NDV吸附细胞部位的电镜观察。结果: 1、经离心和免疫印迹实验,脂筏主要位于25-30%密度梯度离心界面中,存在于收集样品中的第5、6、7管。小窝蛋白-1的分子量约为24KD,而对照组第5、6、7管未发现小窝蛋白-1。 2、以CPE为指标观察药物干预后病毒对细胞的感染性:甲基-β-环糊精对两种病毒感染细胞均有一定抑制作用,且随着剂量的增加效果明显提高。 3、以病毒蚀斑为指标观察药物干预后病毒对细胞的感染性:经统计学分析, 10mmol/L甲基-β-环糊精和15mmol/L甲基-β-环糊精处理后病毒感染细胞的抑制效果均有统计学意义(p﹤0.01)。尽管从数据上看NDV似乎更依赖脂筏进入细胞,但两种病毒之间对通过脂筏感染细胞的区别没有统计学意义。 4、透射电镜下可见形态各异的凹陷状小窝。NDV感染30分钟,病毒吸附于细胞膜上一个小窝状的凹陷内,同一时间段也观察到一个病毒被一囊泡膜包裹在细胞质中。结论:本课题组采用密度梯度离心方法对哺乳动物细胞的脂筏成分进行了成功的分离纯化和鉴定,为今后进一步研究病毒特异性成分与脂筏的关系打下坚实的基础。同时我们也初步证实了NDV的感染是小窝介导的,HPIV-3感染细胞与脂筏相关。

关键词：脂筏小窝副流感病毒-3 新城鸡瘟病毒

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液质联用蛋白组学技术分析脑组织脂筏样品的属性

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天津医药 2013年第9期41卷 881-883页

作者：聂坤张雪竹赵岚贾玉洁韩景献天津中医药大学第一附属医院 300193

目的验证蔗糖密度梯度超速离心法提取脑组织脂筏的有效性。方法用蔗糖密度梯度超速离心法提取小鼠脑组织脂筏,采用免疫印迹法、双酶胆固醇检测法结合光散射度分析样品的脂筏属性,采用液质联用蛋白组学技术和生物信息学手段,对脂筏中的... 详细信息

目的验证蔗糖密度梯度超速离心法提取脑组织脂筏的有效性。方法用蔗糖密度梯度超速离心法提取小鼠脑组织脂筏,采用免疫印迹法、双酶胆固醇检测法结合光散射度分析样品的脂筏属性,采用液质联用蛋白组学技术和生物信息学手段,对脂筏中的蛋白质细胞定位进行分析。结果超速离心法提取的脑组织脂筏具有典型的高散色度、高胆固醇和高表达Flotillin-1的脂筏特性;液质联用蛋白组学分析从脂筏样本中鉴定出647种蛋白质,这些蛋白质细胞定位大多是细胞膜、内质网、细胞骨架和细胞浆等常见的脂筏蛋白来源,这种脂筏样品是含有杂质的混合物,鉴定出的647种总蛋白中,有21%是细胞核、线粒体和核糖体等非脂筏来源蛋白。结论超速离心法是提取脑组织脂筏的有效方法,但应用中要考虑杂蛋白的影响。

关键词：膜脂质类计算生物学超速离心法下丘脑蛋白质类基因组脂筏

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多巴胺受体和脂筏对高血压患者细胞NADPH氧化酶的作用

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安徽医科大学学报 2013年第3期48卷 211-215页

作者：鹿敏刘晓颖韩卫星安徽医科大学第一附属医院心血管内科合肥230022 安徽医科大学生命科学院生物学教研室合肥230032

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶即Nox)亚单位在高血压患者肾脏近曲小管细胞中的表达及其活性变化,以及多巴胺受体和脂筏在其中的调节作用。方法细胞分为正常组和高血压组,未经任何药物刺激的两组细胞分别作... 详细信息

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶即Nox)亚单位在高血压患者肾脏近曲小管细胞中的表达及其活性变化,以及多巴胺受体和脂筏在其中的调节作用。方法细胞分为正常组和高血压组,未经任何药物刺激的两组细胞分别作为正常对照组和高血压对照组,采用葡萄糖浓度梯度超速离心法提取细胞膜的脂筏和非脂筏区蛋白,经Western blot检测Nox亚单位蛋白的表达,光泽精化学发光法动态测定细胞膜Nox的活性。结果多巴胺受体激动剂fenoldopam明显减少gp91phox在正常对照组[(17±3.3)%]和高血压对照组[(20±3.4)%,P脂筏区域的表达,降低正常对照组p22phox[(15±2.0)%,P脂筏区的表达,但不能减少高血压对照组p22phox、p67phox、rac1蛋白的表达;胆固醇耗竭剂β-CD减少正常对照组gp91phox、p22phox在脂筏区的表达,不能减少高血压对照组Nox亚单位的表达;高血压对照组Nox的基础活性是正常对照组的5倍。结论高血压患者肾脏近曲小管细胞具有较高的Nox亚单位的活性,多巴胺受体和脂筏对Nox亚单位的抑制作用减弱。

关键词： NADPH氧化酶多巴胺受体脂筏高血压

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脂筏依赖性内吞途径对轮状病毒感染细胞表面NHE3蛋白的调控作用

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医学研究生学报 2021年第2期34卷 131-134页

作者：王鹏秦红霞田一博李萌萌焦佳伟孙艺文王世广郑州工业应用技术学院医学院郑州451100 郑州大学第一附属医院口腔预防科郑州450052 郑州大学医学院检验系郑州450052 郑州大学护理与健康学院基础教研室郑州450001

目的轮状病毒(RV)可引起儿童急性腹泻症状,但机制均尚不明确。研究表达NHE3的Caco-2细胞经轮状病毒感染后表面NHE3蛋白的改变及其机制。方法表达HA-NHE3的单层极化Caco-2细胞分别加入等体积无血清培养液、RV病毒液(1×104 TCID50/mL)、... 详细信息

目的轮状病毒(RV)可引起儿童急性腹泻症状,但机制均尚不明确。研究表达NHE3的Caco-2细胞经轮状病毒感染后表面NHE3蛋白的改变及其机制。方法表达HA-NHE3的单层极化Caco-2细胞分别加入等体积无血清培养液、RV病毒液(1×104 TCID50/mL)、脂筏破坏剂MβCD(10 mmol/L)和MβCD+RV液,分别为对照组、RV组、脂筏破坏剂甲基-β-环糊精(MβCD)组和MβCD+RV组,分别采用生物素化法,BCECF-AM法和Western Blot法测定细胞表面NHE3蛋白量,Na+-H+交换活性和Cdc42蛋白水平。结果与对照组相比,RV组细胞NHE3的生物活性(0.107±0.016)显著降低(P脂筏依赖性内吞途径有关。

关键词：轮状病毒钠-氢交换蛋白3 脂筏内吞途径

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脂筏调控GABAB受体转激活IGF-1受体的机制研究

脂筏调控GABAB受体转激活IGF-1受体的机制研究

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作者：刘洁华中科技大学

学位级别：硕士

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)作为重要的跨膜蛋白，其结构和功能受与之相互作用的蛋白质和脂质分子调控。脂筏是细胞膜上富含特殊脂质与蛋白质的微结构域，能够作为平台组织特异的GPCRs信号复合体，并调控其信号... 详细信息

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)作为重要的跨膜蛋白，其结构和功能受与之相互作用的蛋白质和脂质分子调控。脂筏是细胞膜上富含特殊脂质与蛋白质的微结构域，能够作为平台组织特异的GPCRs信号复合体，并调控其信号转导的效率与特异性。大部分GPCRs通过棕榈酰化修饰定位在脂筏中，并受棕榈酰转移酶与硫酯酶的可逆性双重调控，与受体活性及生理状态密切相关。GPCRs棕榈酰化修饰动力学过程对其胞内转运及膜上侧向分选的影响是当前的研究热点。 GABAR是C族GPCRs的重要成员之一，通过GB1与GB2两个亚基形成的异源二聚体来行使功能。研究发现在小脑颗粒神经元中，GABAR通过转激活IGF-1R介导神经保护功能。基于活性的小分子光敏探针(ABPP)垂钓发现GABAR转激活IGF-1R所诱导的不同信号蛋白的磷酸化需要形成一个大的蛋白质复合物，复合物中不同蛋白的时空变化如G蛋白的释放和受体酪氨酸激酶IGF-1R的结合对GABAR诱导的相关生理学效应至关重要。另一方面，研究证实GABAR在静息状态下定位在脂筏中，激活后则转运出脂筏。脂筏在GABAR转激活IGF-1R过程中扮演什么角色，GABAR信号复合体的时空变化与脂筏有何相关性，GABAR在脂筏中的定位机制及调控因素是什么，迄今为止还没有相关研究。本文以过表达的HEK293细胞和原代培养的小鼠小脑颗粒神经元细胞作为模式细胞，首先通过MCD破坏脂筏结构的完整性，发现GABA或Baclofen诱导的IGF-1R的磷酸化水平显著下降。进一步通过酰基生物素交换(ABE)实验发现GB2亚基C末端第874位的半胱氨酸发生棕榈酰化修饰，GB2-C874A突变体在脂筏中的定位显著下降。在保持脂筏完整性的前提下，通过突变棕榈酰化修饰破坏GABAR在脂筏中的定位导致GABA诱导的IGF-1R磷酸化水平-处理时间曲线发生显著迁移。随后通过抗去垢剂抽提的蔗糖密度梯度离心技术检测GABAR激活后信号复合体的主要组分在脂筏及非脂筏区域的定位变化，发现野生型GABAR与GB2-C874A突变体在激活后在脂筏内外的运动趋势存在显著差异。最后，通过生物素标记的ABPP垂钓发现脂筏对于GABAR信号复合体成员的时空变化有重要影响，用MCD破坏脂筏会阻滞G蛋白的释放，并破坏IGF-1R的结合。上述研究表明脂筏是GABAR转激活IGF-1R信号复合体在膜上的反应平台，完整的脂筏结构以及GABAR在脂筏区域的正常定位是该信号复合体行使正常功能所必须的;在转激活过程中，GABAR信号复合体的主要成员发生在脂筏中富集-出脂筏的侧向分选变化;脂筏对信号复合体成员的时空变化如G蛋白的释放及IGF-1R的结合有显著影响。从而为研究GABAR信号转导效率的调控机制奠定了一定基础。分析GABAR在膜上的侧向分选与胞内循环之间的相关性将是下一步工作的重点。

关键词：信号复合体 GABABR IGF-1R 脂筏棕榈酰化修饰

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脂筏及其相关蛋白β-adducin在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移...

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作者：杨晨东北师范大学

学位级别：硕士

在炎症反应的早期承担重要职责的中性粒细胞在人体外周血中含量多。当细菌等病原体对机体发动进攻时,中性粒细胞是第一批被招募到感染部位的白细胞,充当了机体抵御外源刺激的第一道防线,而中性粒细胞之所以具有这种防御机制则主要以中... 详细信息

在炎症反应的早期承担重要职责的中性粒细胞在人体外周血中含量多。当细菌等病原体对机体发动进攻时,中性粒细胞是第一批被招募到感染部位的白细胞,充当了机体抵御外源刺激的第一道防线,而中性粒细胞之所以具有这种防御机制则主要以中性粒细胞的迁移和趋化能力为基础。但是由于中性粒细胞在病理条件下向组织的大规模浸润会引发过度的炎症反应常常会给机体造成严重的无法逆转的损伤,比如急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤等相关炎症疾病。故深入地探讨中性粒细胞迁移过程的分子机制、分析干扰中性粒细胞迁移作用的分子靶点具有极为重要的生理意义与病理意义。脂筏是细胞膜上的一种微区结构,富含鞘磷脂、胆固醇,它的功能是富集大量的蛋白质和脂类分子,从而为其上的分子和分子之间相互作用提供有利条件。脂筏的功能体现在细胞信号转导、蛋白质的转运、细胞的极化、黏附、迁移等重要过程中。细胞皮质骨架是定位在质膜下方的细胞骨架成分,作为桥梁起到了连接质膜和细胞骨架的重要作用。在众多的细胞皮质骨架蛋白家族成员中,有一种蛋白称为β-adducin。实验室前期工作表明,β-adducin在白细胞滚动的过程中发挥重要的作用。而在中性粒细胞迁移过程当中,细胞膜不断地伸出丝状和片状伪足的过程也不断地需要细胞膜脱离细胞骨架的束缚,需要细胞骨架在膜下的快速地簇集以推动细胞的运动。所以我们推断脂筏相关的膜骨架蛋白β-adducin可能在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中也具有重要作用。本文主要探讨了脂筏相关蛋白β-adducin在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中的作用和机制。本文运用Transwell迁移模型,从体外层面评价了脂筏结构在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中的作用。利用活细胞显微成像分析系统实时观测脂筏结构的完整性对中性粒细胞迁移的影响。采用免疫荧光标记、共聚焦显微镜观察、病毒侵染、免疫沉淀、免疫印迹、蔗糖密度梯度离心等实验技术和方法对脂筏相关蛋白β-adducin在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中的作用和机制进行了探讨。本论文的研究发现,脂筏结构及脂筏相关蛋白β-adducin在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中起到重要的的作用。当脂筏结构完整性遭到损毁时,中性粒细胞迁移活动被显著地抑制。利用病毒侵染实验部分干涉掉内源的β-adducin后发现,β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程受到严重的抑制。利用脂筏成分的分离(蔗糖密度梯度离心)、免疫荧光双标记等实验结果表明,β-adducin在趋化因子fMLP刺激细胞迁移后,在脂筏成分和非脂筏成分间有重新定位。通过免疫沉淀、免疫印迹等实验发现,β-adducin与脂筏结构的共定位是通过β-adducin分子上的酪氨酸残基磷酸化调控的。我们的研究揭示了脂筏及其相关蛋白在β2整联蛋白介导的中性粒细胞迁移过程中的作用和机制。此研究对于深入剖析中性粒细胞迁移的分子机制,寻找干扰中性粒细胞迁移的分子靶点并借此阻断中性粒细胞在病理条件下向组织的大规模募集而引发过度炎症反应具有重要的意义。

关键词：中性粒细胞脂筏 β2整联蛋白细胞迁移 β-adducin

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脂筏调控Erk1/2信号通路对肝癌细胞耐药的影响研究

脂筏调控Erk1/2信号通路对肝癌细胞耐药的影响研究

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作者：任潇潇厦门大学

学位级别：硕士

目的:ADM诱导建立稳定的肝癌耐药细胞模型,破坏耐药细胞脂筏结构,明确脂筏是否及如何调节Erk1/2信号通路活性及肝癌耐药细胞耐药性。方法:1.采用ADM大剂量间歇冲击诱导肝癌耐药细胞。MTS法检测不同浓度ADM作用下细胞增殖抑制率,SPSS软... 详细信息

目的:ADM诱导建立稳定的肝癌耐药细胞模型,破坏耐药细胞脂筏结构,明确脂筏是否及如何调节Erk1/2信号通路活性及肝癌耐药细胞耐药性。方法:1.采用ADM大剂量间歇冲击诱导肝癌耐药细胞。MTS法检测不同浓度ADM作用下细胞增殖抑制率,SPSS软件进行Probit分析并计算半数抑制浓度(IC50)获得耐药指数。2.甲基-β-环糊精(MβCD)消耗胆固醇破坏脂筏结构,用AlexaFluor488-CtxB标记脂筏,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光的多少判断脂筏含量,验证MβCD破坏效果。3.Western Blot检测脂筏破坏前后和PD98059作用后Erkl/2信号通路相关蛋白表达及磷酸化水平,ImageJ gray scale scanning software进行定量分析。4.MTS检测脂筏破坏前后及PD98059作用后肝癌耐药细胞株在不同浓度ADM作用下的细胞增殖抑制率并计算耐药逆转倍数。5.流式细胞仪检测脂筏破坏前后和PD98059作用后ADM(1 mg/L)诱导24小时后的细胞凋亡率。6.流式细胞仪检测脂筏破坏前后5μg/ml罗丹明123孵育细胞45min后细胞内罗丹明123的荧光强度,Western Blot检测脂筏破坏前后p-gp的蛋白表达。结果:1.诱导得到耐药细胞株:SMMC7721/ADM、BEL7402/ADM。与亲本细胞相比,耐药细胞在0.25,1,4,16 and 64 μg/mlADM作用下对阿霉素的敏感性明显下降,细胞增殖抑制率降低,IC50显著升高,SMMC7721/ADM、BEL7402/ADM的耐药指数分别为17.07、14.28。耐药细胞株与亲本株相比,Erk1/2,MEK,c-Raf总表达及磷酸化表达p-Erk1/2,p-MEK,p-c-Raf均明显增加。2.MβCD作用于耐药细胞后,激光共聚焦显微镜下绿色荧光明显减弱,即脂筏含量明显降低,说明MβCD破坏脂筏效果明显。3.MβCD破坏脂筏后,p-Erk1/2,p-MEK,p-c-Raf蛋白表达明显增强,而Erk1/2,MEK,c-Raf总蛋白表达基本没变;P-EGFR表达明显增强。用PD98059作用后Erk1/2磷酸化水平明显降低。4.MβCD 破坏脂筏后,SMMC7721/ADM 和 BEL7402/ADM 细胞对 ADM 的IC50 分别降到 1.71±0.142μg/ml、1.467±0.17μg/ml,逆转倍数为 2.79、1.77。PD98059作用后,SMMC7721/ADM和BEL7402/ADM细胞对ADM的IC50分别降到3.324±0.184μg/ml、1.879±0.174μg/ml,逆转倍数为 1.43、1.38。MβCD、PD98059联合作用后,肝癌耐药细胞对ADM的IC50分别降到1.552±0.037μg/ml、1.334±0.079μg/ml,逆转倍数为3.07、1.95,逆转倍数高于单独使用。5.MβCD破坏脂筏后,细胞株对ADM的敏感性增加,1mg/LADM诱导后细胞凋亡增加。PD98059作用后,细胞凋亡增加。MβCD、PD98059联合作用后,细胞凋亡增加高于单独使用。6.MβCD作用后,流式细胞仪检测细胞内罗丹明123蓄积增加,外排减少,P-gp活性减弱;P-gp蛋白表达没有明显改变。结论:1.Erk1/2信号通路高表达与肝癌细胞耐药性正相关。2.MβCD破坏脂筏,Erk1/2信号通路活性增加。3.MβCD破坏脂筏,肝癌耐药细胞p-gp活性降低,耐药性降低。4.MβCD破坏脂筏后PD98059抑制Erk1/2通路活性,肝癌细胞耐药性降低,证实了脂筏破坏后Erk1/2信号通路仍然参与耐药性的调节。

关键词：脂筏肝癌耐药细胞 Erk1/2 多药耐药

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脂筏、非脂筏质膜微域内层磷脂结构的分析

脂筏、非脂筏质膜微域内层磷脂结构的分析

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作者：赵玉峰大连医科大学

学位级别：硕士

目的:脂筏(lipid rafts)是质膜双层中富含鞘脂、胆固醇及特殊蛋白质的微区。脂筏的生物学功能涉及到生命科学的多个领域。尤其在细胞信号转导方面,近年来,脂筏作为细胞膜上的信号跨膜转导平台(signaling platform)引起了人们的广泛关注... 详细信息

目的:脂筏(lipid rafts)是质膜双层中富含鞘脂、胆固醇及特殊蛋白质的微区。脂筏的生物学功能涉及到生命科学的多个领域。尤其在细胞信号转导方面,近年来,脂筏作为细胞膜上的信号跨膜转导平台(signaling platform)引起了人们的广泛关注。脂筏参与细胞信号跨膜传导分子机制的研究是膜分子生物学及细胞信号转导领域的前沿课题。对脂筏结构的研究,是阐明脂筏各种功能分子机制的基础。目前,对脂筏的结构已有一定的认识。尤其对脂筏脂双层外层的结构组成比较清楚。鞘磷脂、糖鞘脂、胆固醇和GPI锚定蛋白均属于脂筏脂双层外层的组份。它们是脂筏得以形成的分子基础。但脂筏脂双层内层的分子组成及结构还不十分清楚。已知许多参与细胞信号转导的分子(包括脂类、酰基化蛋白及膜蛋白等)都聚集在脂筏的内层。它们在脂筏中的定位是脂筏做为信号跨膜转导平台的重要结构基础之一。这些信号转导分子是如何定位于脂筏?其结构基础是什么?它们与脂筏外层质膜磷脂间的关系如何,这些都尚待进一步研究。本文就是通过对细胞脂筏与非脂筏部分质膜的磷脂组份及结构进行比较分析,从而探讨脂筏内层质膜的结构以及脂筏内、外层质膜之间的关系。方法:小鼠肝癌腹水转移细胞高转移株HcaF于小鼠腹腔培养。收集细胞后,制备匀浆。采用Percoll梯度高速离心获得质膜。质膜用1 % TritonX100裂解后,用蔗糖密度梯度超速离心分离脂筏。采用霍乱毒素-B亚基点杂交技术鉴定,分为脂筏与非脂筏部分质膜。采用Floch法分别萃取两部分的总磷脂。以高效薄层层析分离各磷脂组份。各磷脂组份经14 % BF3-MeOH甲酯化处理后,以石油醚萃取脂肪酸甲酯,高效气相色谱分析脂肪酸链结构。结果:对脂筏和非脂筏部分磷脂组份研究表明,脂筏部分主要磷脂组份为磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)。非脂筏质膜部分为PC和PE。这说明SM和PS主要分布在细胞质膜的脂筏微域。对脂筏和非脂筏部分内层磷脂的脂肪酸分析表明,PE所含脂肪酸结构有显著性差异。脂筏部分PE含较多的中、短链脂肪酸(C16和C18),而非脂筏部分含较多的长链脂肪酸(C18、C20和>C22);PS所含脂肪酸结构组成与脂筏部分PE所含的脂肪酸结构类似。结论:已知,细胞质膜磷脂呈不对称分布。PC和SM分布于质膜双层的外层,而PE和PS分布于质膜外层。根据磷脂的分布特点和我们的实验结果可知,脂筏部分质膜外层主要由PC和SM组成,非脂筏部分质膜外层仅由PC组成;脂筏部分质膜内层主要由PE和PS组成,非脂筏部分质膜内层主要由PE组成;综上可知,在细胞膜的各种磷脂中,SM和PS最重要的功能是参与脂筏的形成。SM位于脂筏的外层,PS位于内层。已知,SM中的鞘氨醇烃链较长(C24),与所含脂酰链的长度差别很大,类似含不对称脂酰链的磷脂。当含不对称脂酰链的磷脂形成脂双层时,为使磷脂达到最低能量的排列方式,常形成交错对叉脂双层。SM是组成脂筏外层的主要磷脂,这就要求脂筏内层的磷脂组份在结构上与其互补,即组成脂筏内层的磷脂含不对称脂酰链或含有较多的短链脂肪酸。我们的实验结果显示,脂筏部分质膜内层的PE含的中、短链脂肪酸远较非脂筏部分多,PS所含脂肪酸结构组成与脂筏部分PE所含的脂肪酸结构类似,这可能是这些磷脂组份在脂筏内侧定位分布的重要因素。PS的存在是一些信号转导分子如蛋白激酶C发挥功能的前提条件。另外,一些微量磷脂组份如肌醇磷脂都是分布在脂筏中。脂筏的形成使质膜内层参与信号转导的脂类分子在局部浓集,形成有利于细胞信号传递的微环境。这可能是脂筏参与信号转导的分子机制之一。

关键词：脂筏磷脂脂肪酸点杂交气相色谱

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