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千金子制霜前后提取物通过调控脂筏介导Caco-2细胞中TLR4信号通路的作用机制研究

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中草药 2023年第22期54卷 7474-7481页

作者：王慧楠魏晓彤石双慧王梦琳马思媛胡宇峰姜明瑞张婧秋王英姿北京中医药大学中药学院北京102488

目的探究千金子Euphorbiae Semen制霜前后提取物通过调控脂筏介导Caco-2细胞中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路的作用机制。方法将Caco-2细胞分为千金子生品低、中、高剂量(50、200、800μg/mL)组及千金子霜品低、中、... 详细信息

目的探究千金子Euphorbiae Semen制霜前后提取物通过调控脂筏介导Caco-2细胞中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路的作用机制。方法将Caco-2细胞分为千金子生品低、中、高剂量(50、200、800μg/mL)组及千金子霜品低、中、高剂量(50、200、800μg/mL)组和对照组,利用流式细胞术检测Caco-2细胞膜脂筏丰度;采用激光共聚焦实验检测Caco-2细胞中TLR4与脂筏的共定位;利用Western blotting检测Caco-2细胞中TLR4、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)、p-NF-κB p65和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)的蛋白表达;ELISA检测Caco-2细胞上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量;Caco-2细胞转染TLR4后检测IL-1β和TNF-α的含量变化。结果与对照组比较,千金子生品提取物可以显著增加Caco-2细胞膜脂筏的丰度(P脂筏的募集(P脂筏丰度、TLR4向脂筏募集、TLR4介导的信号通路传导和促炎因子分泌的影响均明显减弱(P脂筏丰度干扰TLR4向脂筏募集,最终影响脂筏中包含的TLR4信号蛋白的传导有关。

关键词：千金子制霜减毒脂筏 Toll样受体4 Caco-2细胞千金子甾醇

载脂蛋白E4、二十二碳六烯酸通过调控膜脂筏功能影响阿尔茨海默病发生的研究进展

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卫生研究 2022年第5期51卷 860-864页

作者：祭校铭徐京晶(综述) 苑林宏(审校) 首都医科大学基础医学院北京100069 首都医科大学公共卫生学院北京100069

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性中枢神经系统退行性疾病,约占痴呆发病率的50%-70%。AD的病因复杂,目前临床上对AD尚无有效治疗方法。中枢脂代谢异常是引发AD病理过程的重要环节。在AD发生过程中,脂筏老化与AD的疾... 详细信息

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性中枢神经系统退行性疾病,约占痴呆发病率的50%-70%。AD的病因复杂,目前临床上对AD尚无有效治疗方法。中枢脂代谢异常是引发AD病理过程的重要环节。在AD发生过程中,脂筏老化与AD的疾病进展并行。衰老叠加中枢脂代谢异常可导致膜脂质稳态失衡,加速脂筏老化及AD的疾病进程。载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)是中枢系统参与脂类代谢及调节胆固醇平衡的重要蛋白,其中ApoE4介导的脑内脂代谢改变可干扰脂筏的正常生理功能。此外,ApoE4可能影响脑组织摄取二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的过程,并影响脑内DHA的水平,提示ApoE4与DHA可通过影响中枢脂代谢调控膜脂构成及脂筏功能,并参与AD的病理过程。本文就ApoE4及DHA通过调控膜脂筏功能影响AD发生的研究进展进行综述。

关键词：阿尔茨海默症脂筏载脂蛋白E4 二十二碳六烯酸

脂筏在Ptpn11E76K/+突变间充质干细胞恶性转化中的潜在作用

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脂筏在Ptpn11E76K/+突变间充质干细胞恶性转化中的潜在作用

作者：黄珍安徽医科大学

学位级别：硕士

【研究背景】癌症被认为是一种自我更新能力不受调控的疾病,严重危害着人类的生命健康。自20世纪中叶随着肿瘤干细胞学说(Cancer stem cells,CSCs)的提出,极大的激起了学者对肿瘤起源的研究兴趣。肿瘤干细胞通常由成体干细胞(Adult stem... 详细信息

【研究背景】癌症被认为是一种自我更新能力不受调控的疾病,严重危害着人类的生命健康。自20世纪中叶随着肿瘤干细胞学说(Cancer stem cells,CSCs)的提出,极大的激起了学者对肿瘤起源的研究兴趣。肿瘤干细胞通常由成体干细胞(Adult stem cells),祖细胞(Progenitor cells)和分化的细胞突变转化而来。间充质干细胞作为成体干细胞的一种,当遭受致癌基因突变后,细胞的基因表达、细胞信号转导途径及细胞微环境发生改变,转化形成肉瘤干细胞(Sarcoma stem cells,SSCs),肉瘤干细胞在长期的自我更新中受到致癌突变诱导去分化转为肉瘤起始细胞,并最终形成肉瘤细胞,间充质干细胞在恶性转化或上皮间质转化(EMT)途径参与了肉瘤的发生。肉瘤是来源于间叶组织形成的恶性肿瘤,尤以骨肉瘤、横纹肌肉瘤恶性程度高,生长迅速,是一类高度异质性的肿瘤,目前尚无有效的预防措施。在肉瘤发生进展过程中,SSCs一直存在,是后续疾病转归中转移复发的重要始因。致癌基因突变是肉瘤形成的重要因素之一,其中包含PTPN11(Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11)激活突变,PTPN11是一种由非受体酪氨酸磷酸酶激酶(PTP)编码的原癌基因,可编码SHP-2蛋白,其结构为2个串联排列的N端的SH2结构域(N-SH2,C-SH2)和一个SHP-2的C末端的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)结构域所构成。N-SH2结构域作为构像开关,可结合或抑制磷酸酶。处于生理状态时,SHP-2的催化活性极低;当SHP-2突变时,N-SH2结构域和PTP结构域的在解耦联状态下可以与磷酸酶蛋白结合从而并激活下游的磷酸化信号通路。SHP-2与癌症发展关系密切,SHP-2激活突变导致了下游致癌信号通路的异常激活,调控肿瘤细胞异常的恶性增殖和分化,在多种实体肿瘤和白血病疾病模型中被发现,SHP-2能通过加速肿瘤干细胞的扩增参与了实体肿瘤的衍生。有文献证实,在横纹肌肉瘤中也存在着Ptpn11激活突变,然而其在肉瘤发生的作用及机制不清楚的。课题组前期结果发现:Ptpn11激活突变的MSCs可以发生恶性转化,且突变的MSCs中有少量PDPN亚群。PDPN已报导在多种类型的人类癌症中都发现其高表达。通过流式细胞分选出PDPN亚群的MSCs具有形成肿瘤微球的能力,也可以在裸鼠和C57BL/6J小鼠体内形成肿瘤,揭示我们Ptpn11中PDPN亚群可能为小鼠MSCs的肿瘤干细胞标志物。但究其原因Ptpn11突变后MSCs如何转化成PDPN的CSCs导致肉瘤形成的机制是不清楚的。为了探索其机制,将Ptpn11MSCs与Ptpn11MSCs送出做蛋白质组学分析,找寻到参与脂筏形成差异蛋白在突变MSCs表达是降低的。文献已报道脂筏是肿瘤干细胞信号转导的枢纽,是细胞膜上物质运输的平台,提供了肿瘤细胞的能量代谢,参与了肿瘤的发生发展增殖转移等。Caveolin-1是脂筏经典标志性蛋白,也是构成细胞膜的主要支架蛋白。提出科学猜想Ptpn11MSCs中诱导转化成PDPN亚群肉瘤干细胞是否伴随着脂筏的积累。在前期肉瘤模型前提的基础之下,探究是否可能通过靶向脂筏的形成来遏制肉瘤的进展。为了验证上述猜想,首先检测了Ptpn11MSCs恶性转化过程中脂筏的表达是增加的,随后选用了mβCD(脂筏经典抑制剂),将分离纯化的Ptpn11MSCs用mβCD处理后,发现可抑制了脂筏特征性蛋白(Caveolin-1)的表达。另外,通过体外细胞相关实验及体内移植瘤实验成功验证其破坏脂筏的形成后,可降低肉瘤干细胞在细胞膜上的富集,遏制肉瘤的发生与进展,同时也为肉瘤的治疗提供一个全新的视角。【研究方法】1.Mx1-cre工具鼠与Ptpn11小鼠杂交,基因型鉴定出Ptpn11 小鼠,在6-8周龄时腹腔注射p I-p C(20ug/只),隔2天注射一次,注射3-4针剂。一个月诱导Cre酶在骨髓的间充质干细胞中表达,从而在小鼠体内诱导骨髓间充质内Ptpn11激活突变,再通过体外分离小鼠骨髓及其密质骨纯化得到Ptpn11(野生型)和Ptpn11(突变型)原代间充质干细胞。2.通过免疫荧光和Western blot检测Ptpn11MSCs恶性转化过程中脂筏标志性蛋白caveolin-1表达情况。3.用mβCD处理Ptpn11MSCs破坏脂筏,通过Western Blot与免疫荧光检mutant-MSCs与药物处理的后caveolin-1蛋白差异表达。体外检测mβCD处理mutant-MSCs对细胞生物学行为的影响:(1)细胞增殖能力:CCK-8;(2)细胞集落生长能力:平板克隆;(3)细胞非锚定生长:软琼脂集落形成;(4)细胞迁移侵袭功能:Transwell实验。4.通过肿瘤微球培养验证肿瘤细胞的干性,对比药物处理前后突变的Ptpn11MSCs内形成肿瘤微球的

关键词： Ptpn11 间充质干细胞肉瘤干细胞脂筏

脂筏特异性AIE荧光探针的设计、合成及其应用

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中国药科大学学报 2020年第5期51卷 514-521页

作者：陈悦郝玫茜鞠曹云张灿中国药科大学高端药物制剂与材料研究中心南京210009

脂筏(lipid raft)是由饱和磷脂、鞘磷脂以及胆固醇组成的位于细胞膜的液态有序微区,与细胞的许多生理/病理过程密切相关。基于脂筏区与非脂筏区脂质组成与分布的差异,本研究设计并合成了一种具有聚集诱导发光(aggregationinduced emissi... 详细信息

脂筏(lipid raft)是由饱和磷脂、鞘磷脂以及胆固醇组成的位于细胞膜的液态有序微区,与细胞的许多生理/病理过程密切相关。基于脂筏区与非脂筏区脂质组成与分布的差异,本研究设计并合成了一种具有聚集诱导发光(aggregationinduced emission,AIE)特性的脂筏探针胆固醇-三聚乙二醇-四苯乙烯(TCHS-TPE)用于细胞膜上脂筏区的便捷特异性成像。本研究首先成功合成了TCHS-TPE,同时测定了TCHS-TPE的光物理性质以评价其AIE特性,最后采用激光共聚焦显微镜研究了TCHS-TPE对B16F10黑色素瘤细胞膜上脂筏区的特异性成像。与现有脂筏探针霍乱毒素B(CTxB)相比,TCHS-TPE脂筏探针具有操作简单、特异性高等优势。该荧光探针的成功合成将为研究脂筏区相关生理、病理过程提供有利工具,并为其他脂筏区成像探针的设计奠定了理论基础。

关键词：脂筏荧光探针聚集诱导发光胆固醇

髓鞘碱性蛋白对脂筏微区结构影响的模式化研究

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电子显微学报 2022年第1期41卷 40-46页

作者：张蕾杨慧慧孙润广西安航空学院理学院陕西西安710077 陕西师范大学物理学与信息技术学院陕西西安710062

本文主要通过原子力显微镜(AFM)和Langmuir单层膜技术研究不同浓度的髓鞘碱性蛋白(MBP)与"脂筏"(PC/SM/Cholesterol)模型相互作用形成仿生膜的物理特性。利用表面压缩模量(C_(s)^(-1))和二维维里状态方程对π-A曲线进行分析,计算了MBP与... 详细信息

本文主要通过原子力显微镜(AFM)和Langmuir单层膜技术研究不同浓度的髓鞘碱性蛋白(MBP)与"脂筏"(PC/SM/Cholesterol)模型相互作用形成仿生膜的物理特性。利用表面压缩模量(C_(s)^(-1))和二维维里状态方程对π-A曲线进行分析,计算了MBP与"脂筏"单层膜分子间相互作用的第二维里系数。根据二维维里状态方程分析可得随着亚相中MBP浓度的增加,第二维里系数的值也随之变大,这说明在低的表面压力下,MBP吸附到"脂筏"模型脂膜中,且分子间的相互作用为空间排斥力。压缩模量的值表明,亚相中MBP的浓度越大,MBP与"脂筏"单层膜分子之间的作用力越强,且MBP分子将携带更多的"脂筏"分子进入亚相与其发生疏水相互作用,使得单层膜更加稀疏,可压缩性更大。AFM的表面形貌结果和曲线的分析结果相呼应,表明亚相不同浓度的MBP对"脂筏"单层膜排列和构象有着显著的影响。亚相中不同浓度的MBP与"脂筏"分子间相互作用的热力学研究为维持髓鞘结构和功能的稳定提供了有用的信息和理论基础。

关键词：髓鞘碱性蛋白脂筏理论分析第二维里系数原子力显微镜

脂筏募集蛋白分析针刺对阿尔茨海默病小鼠跨膜细胞信号途径的影响

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中国中西医结合杂志 2014年第8期34卷 991-996页

作者：聂坤张雪竹赵岚贾玉洁韩景献天津中医药大学第一附属医院针灸研究所天津300193

目的揭示针刺治疗阿尔茨海默病(AIzheimers disease,AD)中参与神经元功能调控的跨膜细胞信号途径。方法以SAMP8小鼠为AD动物模型,用液质联用蛋白质组学方法检测益气调血扶本培元针法对早老化痴呆小鼠SAMP8海马脂筏募集的跨膜细胞信号蛋... 详细信息

目的揭示针刺治疗阿尔茨海默病(AIzheimers disease,AD)中参与神经元功能调控的跨膜细胞信号途径。方法以SAMP8小鼠为AD动物模型,用液质联用蛋白质组学方法检测益气调血扶本培元针法对早老化痴呆小鼠SAMP8海马脂筏募集的跨膜细胞信号蛋白数量和种类的影响。结果与对照组比较,针刺组小鼠SAMP8海马脂筏募集的细胞信号类蛋白质数量增多39种,其中,离子通道蛋白14种,G蛋白8种,跨膜信号受体8种,激酶9种,共涉及包括G蛋白偶联受体信号、酶耦联受体信号和离子通道介导3类主要的细胞信号途径;与非穴组比较,针刺组海马脂筏募集的激酶类信号蛋白数量显著增加,增加的激酶从功能上看,以调节神经元细胞骨架相关的突触功能和神经递质分泌为主。结论针刺治疗AD的细胞生物学机制,可能是通过多种跨膜细胞信号改善神经元突触的功能和促进神经递质分泌,达到改善AD患者大脑认知功能的效果。

关键词：脂筏液质联用蛋白质组学阿尔茨海默病跨膜细胞信号转导

脂筏区BACE1聚集在铝致Aβ_(1-42)升高中的作用研究

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工业卫生与职业病 2022年第5期48卷 355-359,376页

作者：王甜甜袁春满李文静徐萌彤宋静山西医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室山西太原030001

目的探讨脂筏区的β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)聚集在铝致Aβ_(1-42)升高中的作用.方法动物实验选择健康2月龄雄性SD大鼠40只,按体质量随机分为对照组(生理盐水)、低剂量组(10μmol/kg)、中剂量组(20μmol/kg)和高剂量组(40μmol/k... 详细信息

目的探讨脂筏区的β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)聚集在铝致Aβ_(1-42)升高中的作用.方法动物实验选择健康2月龄雄性SD大鼠40只,按体质量随机分为对照组(生理盐水)、低剂量组(10μmol/kg)、中剂量组(20μmol/kg)和高剂量组(40μmol/kg),采用腹腔注射麦芽酚铝染毒90 d.细胞实验分为对照组、低剂量组(100μmol/L)、中剂量组(200μmol/L)、高剂量组(400μmol/L),麦芽酚铝染毒PC12细胞36h;干预实验:将PC12细胞分为4个2-BP(2-Bromopalmitate)浓度处理组(0、25、50、100μg/ml),分别接受2-BP处理9 h,再加入200μmol/L麦芽酚铝24 h.染毒结束后,水迷宫实验测试大鼠的学习记忆能力,Western blotting检测BACE1表达量,ELISA检测Aβ_(1-42)表达量.结果水迷宫测试结果,第3、4、5天大鼠的逃避潜伏期随着染铝剂量的增加而逐渐增加,第6天大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间随着染毒剂量的增加而逐渐减少.动物实验结果显示,与对照组比较,中、高剂量组的BACE1表达量升高(F=30.672,P脂筏区的聚集导致Aβ_(1-42)浓度升高.

关键词：铝 BACE1 Aβ_(1-42) 脂筏

脂筏在肠道病毒D68型感染中的作用及机制研究

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脂筏在肠道病毒D68型感染中的作用及机制研究

作者：姜云鹤吉林大学

学位级别：硕士

肠道病毒D68型（EV-D68）属小核糖核酸病毒科肠道病毒属,属于无包膜的单股正链RNA病毒。1962年从加利福尼亚儿童咽拭子中首次分离,可引起神经系统疾病及儿童呼吸系统疾病,并且呼吸系统疾病在临床更为常见。近年来,EV-D68在全世界的多个... 详细信息

肠道病毒D68型（EV-D68）属小核糖核酸病毒科肠道病毒属,属于无包膜的单股正链RNA病毒。1962年从加利福尼亚儿童咽拭子中首次分离,可引起神经系统疾病及儿童呼吸系统疾病,并且呼吸系统疾病在临床更为常见。近年来,EV-D68在全世界的多个国家或地区爆发,目前并无特效药物及疫苗。脂筏（lipid raft）位于细胞膜上,其中成份包括丰富的鞘磷脂与胆固醇,并且较为广泛的分布于细胞的膜系统。在细胞内外因素的影响下,脂筏可动态性和选择性地募集宿主蛋白,参与细胞的多种生物学功能。包膜病毒在感染宿主细胞时,首先通过其包膜与宿主细胞的细胞膜进行融合,从而将病毒基因组释放至宿主细胞内。病毒将通过表面的糖蛋白分子与细胞膜上的蛋白受体结合并且在受体的介导下以内吞的方式进入细胞,而脂筏在多种病毒如HIV-1、流感病毒和人类疱疹病毒-6（human herps virus 6,HHV-6）等的侵入、装配和释放过程中起重要作用。病毒在与宿主细胞膜受体结合的同时也会激活与受体偶联的相关细胞信号分子,从而激活相关的信号通路参与宿主细胞的各种生理过程,而且有些病毒就是通过脂筏来参与相关的信号传导。关于脂筏在EV-D68感染中的作用,尚未见相关文献报道。为探讨脂筏在EV-D68感染细胞中的作用,并最终为阐明EV-D68致病的分子机理及寻找新的抗病毒靶点提供依据,我们完成了如下研究。一、用甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin,MβCD）去除部分维持脂筏稳定性的胆固醇分子来破坏宿主细胞膜脂筏结构,可抑制EV-D68进入并使病毒滴度降低;而在病毒进入过程中补充外源胆固醇可逆转MβCD去除细胞膜胆固醇对EV-D68进入的抑制作用,表明脂筏与EV-D68的进入和复制密切相关。二、使用qRT-PCR检测脂筏对病毒吸附和进入的影响,发现破坏脂筏抑制病毒的进入作用,并且在补充外源胆固醇后病毒的进入作用有所恢复。三、应用Western blot检测提取的脂筏组分,发现EV-D68与脂筏标志蛋白有共同定位,证明EV-D68可以通过脂筏结构进入细胞。四、MβCD可将细胞脂筏组分驱散,其标志蛋白、病毒以及非脂筏区域标志蛋白有共同定位,说明EV-D68将通过非脂筏区域进入细胞。五、共聚焦显微镜方法检测到使用MβCD处理细胞后,病毒进入过程中内吞小泡的酸化受到影响。六、破坏脂筏抑制EV-D68流行株的感染。综上,本研究发现脂筏参与EV-D68的进入及内吞小泡的酸化,破坏脂筏后内吞小泡的形成可能受到影响,干扰病毒基因组的释放,从而干扰病毒生命周期,而破坏脂筏后EV-D68通过非脂筏区域进入细胞。

关键词： EV-D68 脂筏内吞小泡胆固醇

脂筏在柯萨奇病毒A组16型感染RD细胞中的作用

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中国病原生物学杂志 2019年第6期14卷 665-670页

作者：李兴志李鹏飞刘昕旸程丽鑫郑亮张雅婷沈玉江武雪宁徐嘉欣王显赫张华曹宏伟黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319 哈尔滨医科大学附属第五医院肾内科

目的探究脂筏在柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染RD细胞中的作用。方法使用胆固醇抑制剂甲基-β-环糊精(MβCD)驱散细胞膜胆固醇并破坏脂筏,分别采用RT-PCR和Western blot技术,在mRNA以及蛋白质水平检测MβCD处理对于CA16病毒感染RD细胞的... 详细信息

目的探究脂筏在柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染RD细胞中的作用。方法使用胆固醇抑制剂甲基-β-环糊精(MβCD)驱散细胞膜胆固醇并破坏脂筏,分别采用RT-PCR和Western blot技术,在mRNA以及蛋白质水平检测MβCD处理对于CA16病毒感染RD细胞的影响。在RD细胞感染不同时间使用MβCD处理,并检测其对CA16病毒感染的影响。MβCD处理后,使用添加外源胆固醇的方式对细胞膜胆固醇进行补充,观察CA16病毒感染的变化。通过Western blot检测CA16感染后宿主细胞Akt磷酸化水平的变化,以及MβCD处理对宿主细胞Akt磷酸化的影响。结果 MβCD以剂量依赖方式抑制CA16病毒对RD细胞的感染,MβCD处理浓度为2.5、5、7.5、10 mmol/L时CA16 VP1的mRNA水平和蛋白质水平表达均出现降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论脂筏在CA16病毒感染RD细胞与激活PI3K/Akt通路中起重要作用。

关键词：柯萨奇病毒A组16型脂筏胆固醇