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脂溶性贝类毒素的LC-MS/MS分析检测方法研究

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脂溶性贝类毒素的LC-MS/MS分析检测方法研究

作者：万嘉峻军事科学院

学位级别：硕士

近年来,国内外赤潮频发,大面积的水域和海洋生物遭受污染,对海洋生态环境、渔业资源和人类身心健康等都造成了巨大的危害。赤潮发生时,有毒藻类大量繁殖并产生贝类毒素,贝类毒素主要在双壳贝类中累积和代谢,通过食物链传递给消费者产生... 详细信息

近年来,国内外赤潮频发,大面积的水域和海洋生物遭受污染,对海洋生态环境、渔业资源和人类身心健康等都造成了巨大的危害。赤潮发生时,有毒藻类大量繁殖并产生贝类毒素,贝类毒素主要在双壳贝类中累积和代谢,通过食物链传递给消费者产生毒害作用。由于脂溶性贝类毒素在贝类等生物体中的消除半衰期长达数十天甚至数月,因此给消费者带来严重威胁。近四十年来,全球各地关于贝类毒素导致集体中毒、甚至死亡事件的报道屡见不鲜。因此,开展贝类毒素分析研究,建立统一、高效、覆盖种类广的贝类毒素检测方法,对管控、监测水产品和海域中贝类毒素,了解我国沿海地区贝类毒素发生及分布特征、保障水产品安全和民众健康具有重要意义。本研究选择常见的脂溶性贝类毒素作为研究对象,针对脂溶性贝类毒素在不同基质中检测的特点,通过对不同的前处理方法的研究,建立了贝类、海水样品中脂溶性贝类毒素的液相色谱-串联质谱分析方法。论文主要包括以下三个方面的研究:1、脂溶性贝类毒素HPLC-MS/MS分析检测方法的建立。通过优化高效液相色谱和质谱条件,重点对梯度洗脱程序和流动相等色谱条件,母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能量等质谱参数进行优化,实现了10种脂溶性贝类毒素(包括OA组毒素、AZA组毒素、YTX组毒素、GYM、PTX2)的定性、定量检测,建立了对10种脂溶性贝类毒素的HPLC-MS/MS同时检测方法。通过方法学验证,该方法稳定性良好,每种脂溶性贝类毒素在定量线性范围内线性关系良好(R>0.997),对10种目标物的检出限为0.01～3.27μg/L(S/N=3),天内(n=3)、天间(n=6)准确度和精密度良好。2、贝类中脂溶性贝类毒素HPLC-MS/MS同时分析检测方法的建立。通过优化贝类样品前处理过程,重点对液液萃取、固相萃取条件进行优化,有效解决了SPE柱堵塞和大体积溶剂浓缩问题,兼顾了操作的连续性与时效性,实现了对贝类样品中脂溶性贝类毒素(包括OA组毒素、AZA组毒素、YTX组毒素、GYM、PTX2)的有效富集,建立了对贝类中脂溶性贝类毒素HPLC-MS/MS分析检测方法。具体方法为:用甲醇作为提取溶剂,正己烷液液萃取两次,OASIS HLB固相萃取柱富集净化,洗脱液旋转蒸发浓缩,复溶离心后上机检测。通过方法学验证,该方法稳定性良好,每种脂溶性贝类毒素在定量线性范围内线性关系良好(R>0.997),对10种目标物的检出限为0.04～3.50μg/kg(S/N=3),10种脂溶性贝类毒素的平均回收率为77.54%～116.9%,天内(n=3)、天间(n=6)准确度和精密度良好。对6种实际贝类样品(贻贝、文蛤、青蛤、缢蛏、花蛤和扇贝)进行检测,部分样品检出毒素,含量均低于贝类毒素的国际安全限量标准。3、海水中痕量脂溶性贝类毒素HPLC-MS/MS分析检测方法的建立。首次尝试将大孔树脂应用于海水样品前处理过程,通过对大孔树脂型号筛选、固相萃取条件优化,有效解决了海水样品中痕量脂溶性贝类毒素(包括OA组毒素、AZAs、PTX2)的快速富集,建立了对海水中痕量脂溶性贝类毒素HPLC-MS/MS分析检测方法。具体方法为:选用大孔树脂NKA-9(OA组毒素分析)、S-8(AZA组毒素、PTX2分析)装填自制固相萃取柱,海水样品过滤后直接使用该自制固相萃取柱进行前处理,甲醇洗脱后旋转蒸发,复溶离心后上机测定。该方法稳定性良好,对于7种脂溶性贝类毒素线性方程的线性关系良好(R>0.999),方法的理论检出限0.10～2.45 ng/L,天内、天间的准确度、精密度良好,7种脂溶性贝类毒素的平均回收率为81.10%～92.67%。该方法与国际上新兴的SPATT技术相比,有效解决了海水样品富集时间长、无法定量分析脂溶性贝类毒素的难题。该方法成功应用于利玛原甲藻培养液中OA组毒素的浓度分析,为下一步的研究提供了技术手段。总之,本论文以海洋中的脂溶性贝类毒素为研究对象,充分利用SPE技术优势,通过不同的样品前处理技术,建立了贝类和海水中脂溶性贝类毒素的液相色谱-质谱分析检测方法,为海产品安全检测方法提供参考,并为海域中脂溶性贝类毒素的实时监测提供新思路。

关键词：脂溶性贝类毒素固相萃取液相色谱-串联质谱大孔树脂

高效液相色谱-串联质谱法同时测定10种脂溶性贝类毒素

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分析科学学报 2022年第2期38卷 154-160页

作者：万嘉峻孟凡华代先东范崇旭曹瑛国民核生化灾害防护国家重点实验室北京102205

本研究采用甲醇提取,正己烷液-液萃取除油脂,HLB固相萃取柱富集净化,利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测,建立了同时检测贝类中10种脂溶性贝类毒素的分析方法。该方法明显降低了基质抑制效应;对10种目标物的检出限(S/N=3)为0.10... 详细信息

本研究采用甲醇提取,正己烷液-液萃取除油脂,HLB固相萃取柱富集净化,利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测,建立了同时检测贝类中10种脂溶性贝类毒素的分析方法。该方法明显降低了基质抑制效应;对10种目标物的检出限(S/N=3)为0.104~3.87μg/kg;利用外标法进行定量,目标物线性良好;加标平均回收率(n=6)为77.54%~116.9%,相对标准偏差(RSD)小于15%。利用本方法对6种贝类样品进行了检测,部分样品检出低浓度的米氏裸甲藻毒素(GYM)和原多甲藻酸毒素(AZA1)。该方法基质干扰小,净化效果强,灵敏度高,适合贝类中多种脂溶性贝类毒素的同时检测。

关键词：正己烷萃取固相萃取液相色谱-串联质谱脂溶性贝类毒素

石墨烯-管尖固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定贝类中10种脂溶性贝类毒素

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色谱 2019年第5期37卷 505-511页

作者：杨霄黄华伟伍远安万译文李小玲黄向荣湖南省水产科学研究所湖南长沙410153 农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙) 湖南长沙410153 水产高效健康生产湖南省协同创新中心湖南常德415000

以石墨烯为吸附剂,制作了石墨烯-管尖固相萃取装置,结合液相色谱-串联质谱,建立了一种同时测定贝类中10种脂溶性贝类毒素的方法。实验对提取剂、石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量等实验参数进行了详细优化。在最... 详细信息

以石墨烯为吸附剂,制作了石墨烯-管尖固相萃取装置,结合液相色谱-串联质谱,建立了一种同时测定贝类中10种脂溶性贝类毒素的方法。实验对提取剂、石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量等实验参数进行了详细优化。在最优的实验条件下,10种脂溶性贝类毒素在各自相应浓度范围内线性良好,相关系数均大于0.99,方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别在0.1～1.1μg/kg和0.3～3.2μg/kg之间;对阴性牡蛎样品进行3个水平的加标回收实验,10种脂溶性贝类毒素的回收率在72.0%～101.2%之间,相对标准偏差小于15%。结果表明,该方法灵敏度高,操作简单高效,适用于贝类水产品中脂溶性贝类毒素的检测分析。

关键词：石墨烯管尖固相萃取液相色谱-串联质谱脂溶性贝类毒素贝类

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定血浆与尿液中12种脂溶性贝类毒素

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色谱 2021年第4期39卷 399-405页

作者：林强杨超李美丽王佳侯瀚然邵兵牛宇敏北京市延庆区疾病预防控制中心北京102100 北京市疾病预防控制中心北京100013

生物样品中脂溶性贝类毒素的检测,可为食物中毒等突发公共卫生事件的流行病学调查以及中毒者的临床救治提供技术支持。目前的研究存在目标化合物少,以及方法前处理复杂、灵敏度低等问题。该研究通过优化前处理和色谱分离技术,建立了超... 详细信息

生物样品中脂溶性贝类毒素的检测,可为食物中毒等突发公共卫生事件的流行病学调查以及中毒者的临床救治提供技术支持。目前的研究存在目标化合物少,以及方法前处理复杂、灵敏度低等问题。该研究通过优化前处理和色谱分离技术,建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定血浆、尿液中12种脂溶性贝类毒素的方法。实验对提取试剂以及流动相的选择进行了优化,采用乙腈对尿液和血浆样品进行提取。采用Phenomenex Kinetex C18色谱柱(50 mm×3 mm,2.6μm)进行分离,以0.05%(v/v)氨水水溶液、90%(v/v)乙腈水溶液为流动相,以流速0.40 mL/min梯度洗脱时,12种目标化合物分离效果最好。串联质谱的离子源为电喷雾离子(ESI)源,采用多反应监测(MRM)模式检测。12种目标物的基质效应均在0.8~1.1之间,表明该前处理方法的基质干扰低,采用外标法可对化合物进行准确定量。12种贝类毒素的线性范围为0.03~36.25μg/L,相关系数均大于0.995。尿液检测的方法定量限为0.23~0.63μg/L,血浆检测的方法定量限为0.31~0.84μg/L。3个加标水平的回收率为72.7%~124.1%,日内精密度为2.1%~20.0%,日间精密度为2.1%~15.3%。利用该方法检测健康人尿液和血浆样本,以及经腹腔注射12种贝类毒素的小鼠尿液和血液样本。20份健康人样本中未检出目标物,20份小鼠样本中12种贝类毒素均有检出。该方法操作简便,样品取样量少,方法灵敏高,适用于血浆和尿液中脂溶性贝类毒素的快速检测。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱脂溶性贝类毒素血浆尿液

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脂溶性贝类毒素安全评价与检测技术研究进展

中国水产科学 2013年第2期20卷 467-479页

作者：谭志军吴海燕郭萌萌杨帆王联珠李兆新翟毓秀农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所国家水产品质量监督检验中心

2004年,由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳软体生物毒素工作组根据贝类毒素的基本结构将其分为8类(组)。其中,大田软海绵酸类毒素(okadaic acid,OA)、原多甲酸毒素(azaspiracid,AZA)、环亚胺类毒素(cycli... 详细信息

2004年,由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳软体生物毒素工作组根据贝类毒素的基本结构将其分为8类(组)。其中,大田软海绵酸类毒素(okadaic acid,OA)、原多甲酸毒素(azaspiracid,AZA)、环亚胺类毒素(cyclic imine,CI)、短裸甲藻毒素(brevetoxin,BTX)、蛤毒素(pectenotoxin,PTX)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)均属于脂溶性贝类毒素(lipophilic phycotoxins,LPs),这6大类毒素均为聚醚类物质,在贝类中富集的时间较长,目前已成为欧盟调整检测方法、最高残留限量等法律法规的主要目标。LPs的主要成分在中国均已被发现,这不仅意味着中国贝类消费存在巨大的潜在风险,外贸出口还将面临新的技术和贸易壁垒。本文就LPs的化学性质、污染分布、毒理学评价、检测方法、限量标准、监控预警技术和政策法规等国际最新研究进展等逐一进行归纳与总结,并对我国在LPs方面的科研举措进行展望,旨在为我国制定相关政策措施提供科学依据。

关键词：脂溶性贝类毒素污染分布毒理学评价检测方法监控预警政策法规

QuEChERS净化技术结合高效液相色谱-串联质谱法测定食用贝类产品中4种脂溶性贝类毒素

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现代食品科技 2015年第12期31卷 338-344页

作者：刘青曾广丰王志元李文斌胡志玲韩深刘萤广东出入境检验检疫局技术中心广东广州510623 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室广东广州510623 迪马科技有限公司北京100029 北京出入境检验检疫局技术中心北京100026

建立了QuEChERS净化技术结合高效液相色谱-串联质谱法测定食用贝类产品中4种脂溶性贝类毒素(OA,SPX1,DTX1,AZA1)的快速方法。贝类样品匀质后用85%乙腈水萃取,采用QuEChERS净化技术对其进行富集净化后,用HPLC-MS/MS进行检测。以乙腈-水溶... 详细信息

建立了QuEChERS净化技术结合高效液相色谱-串联质谱法测定食用贝类产品中4种脂溶性贝类毒素(OA,SPX1,DTX1,AZA1)的快速方法。贝类样品匀质后用85%乙腈水萃取,采用QuEChERS净化技术对其进行富集净化后,用HPLC-MS/MS进行检测。以乙腈-水溶液(2 mmo/L乙酸铵,0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,经C18色谱柱分离,在多反应监测(MRM)模式下扫描。采用标准曲线外标法定量,OA和DTX1的方法检出限为10μg/kg,在1.0~100μg/L范围内线性关系良好;AZA1和SPX1的方法检出限为1.0μg/kg,在1.0~20μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.999。高、中、低三个添加水平的平均回收率在81.9%~93.1%之间,RSD小于5%。应用该方法对进出口的贻贝、北极贝、象拔蚌、牡蛎等15个样品进行检测,发现5个样品的SPX1测定结果为阳性。该方法操作简便、灵敏度高、重现性好,适用于贝类产品中脂溶性贝类毒素的检测。

关键词： QuEChERS 脂溶性贝类毒素高效液相色谱-串联质谱食用贝类产品

超高效液相色谱-四极杆串联线性离子阱质谱法测定贝类中的脂溶性贝类毒素

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卫生研究 2021年第6期50卷 967-974页

作者：刘红河秦逍云廖仕成康莉毛丽莎肖惠贞尹江伟深圳市疾病预防控制中心深圳518055 深圳市宝安区疾病预防控制中心深圳518101

目的建立一种超高效液相色谱-四极杆串联线性离子阱质谱技术测定贝类食品中12种脂溶性贝类毒素的方法。方法贝类中12种脂溶性贝类毒素采用甲醇超声提取,经Strata-X固相萃取小柱净化,用含0.3%(V/V)氨水的甲醇洗脱后,0.22μm微孔滤膜过滤,... 详细信息

目的建立一种超高效液相色谱-四极杆串联线性离子阱质谱技术测定贝类食品中12种脂溶性贝类毒素的方法。方法贝类中12种脂溶性贝类毒素采用甲醇超声提取,经Strata-X固相萃取小柱净化,用含0.3%(V/V)氨水的甲醇洗脱后,0.22μm微孔滤膜过滤,经Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)(150 mm×2.1 mm,1.7μm)超高效液相色谱柱分离,选用乙腈-水(含0.01%氨水和2 mmol/L甲酸铵)为流动相,梯度洗脱分离12种脂溶性贝类毒素;在优化的串联四极杆质谱条件下,采用电喷雾电离源、正负离子同时扫描模式、多反应监测方式,外标法定量,采用信息依赖采集扫描功能结合增强子离子扫描模式对检出阳性结果进行定性分析。结果方法的线性范围为0.5~50μg/L,12种脂溶性贝类毒素在各种样品基质中均有良好的线性关系,相关系数(r)在0.9984~0.9999,方法检出限为0.15~0.29μg/kg;方法回收率为80.0%~116.0%,相对标准偏差为0.6%~6.4%(n=7)。结论该方法测定12种脂溶性贝类毒素的残留量简便、快速、定性准确,可以满足对贝类食品中脂溶性贝类毒素的监测要求。

关键词：脂溶性贝类毒素四极杆串联线性离子阱质谱贝类

钦州湾海水和香港牡蛎体内脂溶性贝类毒素污染特征

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海洋与湖沼 2021年第1期52卷 144-152页

作者：徐轶肖韦光领王玉贾樱高寒张腾佟蒙蒙南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室南宁530001 南宁师范大学广西地表过程与智能模拟重点实验室南宁530001 浙江大学海洋学院舟山316000

近年中国沿海普遍受到脂溶性贝类毒素(lipophilic shellfish toxins,LSTs)的污染。钦州湾是国内外闻名的牡蛎养殖基地,目前仍不了解该海域海水和主要养殖品种香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)沾染LSTs毒素情况与食用安全性。本文于2... 详细信息

近年中国沿海普遍受到脂溶性贝类毒素(lipophilic shellfish toxins,LSTs)的污染。钦州湾是国内外闻名的牡蛎养殖基地,目前仍不了解该海域海水和主要养殖品种香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)沾染LSTs毒素情况与食用安全性。本文于2015年10月至2016年9月,在钦州湾香港牡蛎养殖区海水交换口处,通过固相吸附毒素跟踪技术(solid phase adsorption toxin tracking,SPATT)吸附收集海水中的脂溶性贝类毒素,同时每月采集香港牡蛎样品,应用液相色谱串联质谱法分析海水和香港牡蛎体内的LSTs毒素含量与组成,并对香港牡蛎食用安全性进行评估。结果表明:(1)海水共检出GYM、OA和PTX2三种组分,平均浓度分别为0.44、14.20和1.67μg/(kg resin·30d)。香港牡蛎共检出DTX2、GYM、SPX1、Homo-YTX四种组分,其中Homo-YTX为定性结果,DTX2、GYM、SPX1三者平均浓度分别为0.95、18.86和0.95μg/kg。(2)GYM毒素均值在海水中和香港牡蛎体内含量变化趋势呈正相关,Pearson相关系数为0.70;OAs毒素在海水中和香港牡蛎体内变化趋势类似,Pearson相关系数为0.35。(3)毒素存在一定季节变化。海水OA和PTX2夏季高,其他季节低,均值最高值分别发生在7月和6月;香港牡蛎体内GYM冬季和夏季较高,DTX2春季和夏季较高;但海水中的GYM和香港牡蛎体内的SPX1全年变化均不明显。总体而言,钦州湾海水和香港牡蛎已受到多个LSTs毒素组分污染,海水LSTs毒素含量较国内其他海域低,参考欧盟LSTs毒素标准,本海域的香港牡蛎脂溶性贝类毒素仍未超标,可放心食用。

关键词：脂溶性贝类毒素固相吸附毒素跟踪技术海水香港牡蛎钦州湾北部湾

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广东省沿海脂溶性贝类毒素的分布特征

海洋环境科学 2018年第2期37卷 161-167页

作者：陈雨张菁江天久暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心水体富营养化与赤潮防治广东省高校重点实验室广东广州510632

为了弄清广东省沿海脂溶性贝类毒素的分布特征,采用高效液相色谱-质谱联用法对2013年11月至2015年10月间采自广东省沿海5个地区(汕头南澳、汕尾、深圳大鹏澳、珠海、阳江闸坡)的贝类样品进行了脂溶性贝类毒素的检测和分析。结果表明:在... 详细信息

为了弄清广东省沿海脂溶性贝类毒素的分布特征,采用高效液相色谱-质谱联用法对2013年11月至2015年10月间采自广东省沿海5个地区(汕头南澳、汕尾、深圳大鹏澳、珠海、阳江闸坡)的贝类样品进行了脂溶性贝类毒素的检测和分析。结果表明:在所采集的43种贝类,174个样品中共检测出5类脂溶性贝毒,分别为OA、AZAs、GYM、YTXs和PTXs类,毒素含量普遍较低且均未超标。广东省沿海的脂溶性贝类毒素存在地域性、季节性和贝种间差异。在地域上,OA、AZAs和YTXs呈现明显的地域性差异,三类毒素的检出率和平均含量均以粤东的汕头南澳最高。GYM和PTXs的地域性差异不显著。在季节上,OA的检出率在秋季最高,PTXs的检出率和平均含量均以春季最高。AZAs、GYM和YTXs则无季节性差异。在同一海域,贝体中毒素的含量及检出率也因贝种的不同而存在差异。

关键词：广东省沿海脂溶性贝类毒素分布特征