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代谢工程改造大肠杆菌生产胸苷

生物工程学报 2024年

作者：姚卓越李然蒋帅吴鹤云马倩谢希贤天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷... 详细信息

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷的工程菌株。首先，依次敲除deoA、tdk、udp、rihA、rihB、rihC基因，以阻断胸苷的分解途径和补救途径；随后，引入来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) F126的嘧啶核苷操纵子基因，以增强前体物尿苷酸合成途径代谢通量；最后，依次优化胸苷合成途径中尿苷酸激酶、核糖核苷二磷酸还原酶、胸苷酸合酶和5’-核苷酸酶的表达，以强化尿苷至胸苷合成途径代谢通量。所构建的THY6-2工程菌株在5 L分批补料发酵实验中胸苷产量为11.1 g/L、转化率为0.04 g/g 葡萄糖、生产强度为0.23 g/(L?h)。本研究构建了以葡萄糖为唯一碳源且不携带质粒的高效合成胸苷工程菌株，为其他嘧啶核苷类产品的研发提供借鉴意义。

关键词：胸苷大肠杆菌代谢工程从头合成途径

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代谢工程改造大肠杆菌生产胸苷

代谢工程改造大肠杆菌生产胸苷

作者：秦臻天津科技大学

学位级别：硕士

胸苷是一种嘧啶核苷,作为抗艾滋病药物司他夫定和齐多夫定的前体,随着全球艾滋病患者的不断增加,胸苷的市场需求不断扩大。对菌株进行代谢工程改造并利用微生物发酵法生产胸苷已逐渐取代化学法、酶法成为大规模工业化生产胸苷的理想方... 详细信息

胸苷是一种嘧啶核苷,作为抗艾滋病药物司他夫定和齐多夫定的前体,随着全球艾滋病患者的不断增加,胸苷的市场需求不断扩大。对菌株进行代谢工程改造并利用微生物发酵法生产胸苷已逐渐取代化学法、酶法成为大规模工业化生产胸苷的理想方法。本文以大肠杆菌MG1655标准株为出发菌株,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对胸苷合成代谢网络进行系统改造,成功构建出一株以葡萄糖为原料,高效稳定生产胸苷的大肠杆菌工程菌THY18。主要研究内容如下:首先,通过引入枯草芽孢杆菌A260的嘧啶核苷操纵子,使菌株能够积累2.11 g/L尿嘧啶。这表明引入pyr操纵子能有效增强UMP合成通量,为进一步提高胸苷产量奠定了基础。随后,敲除了六个与胸苷分解代谢有关的基因deo A,tdk,udp,rih A/B/C。摇瓶结果显示,菌株THY7胸苷积累量达0.18 g/L,且副产物尿嘧啶消失,另一副产物尿苷积累量达到5.56 g/L。接着,为了增强胸苷下游合成途径,过表达了大肠杆菌的尿苷酸激酶突变基因pyr H。摇瓶结果显示,胸苷产量为0.31 g/L,与对照相比增加了70.5%,副产物尿苷产量与对照相比减少了90.6%,说明代谢流从尿苷合成途径引入下游胸苷合成途径。随后,又整合了来自T4噬菌体的td基因和大肠杆菌自身的nrd A/B/C操纵子,得到的菌株THY9和THY10-2,胸苷产量分别为0.33 g/L和1.01 g/L。其中菌株THY10-2较菌株THY9胸苷产量提升了204.2%,证实了核糖核苷二磷酸还原酶在胸苷合成过程中的关键作用。随后分别探究了ndk,dcd,dut,pyr G*基因对胸苷合成的影响,并将ndk,dcd,dut基因进行组合表达,胸苷产量增加至1.33 g/L。最后比较了来自大肠杆菌内源和噬菌体PBS1来源的5’-核苷酸酶,分别得到菌株THY17和THY18,摇瓶结果显示,THY17和THY18的胸苷产量分别为1.34 g/L和1.81 g/L。表明噬菌体PBS1来源的5’-核苷酸酶在水解胸苷酸合成胸苷能力上明显强于大肠杆菌中的5’-核苷酸酶。最后,在2 L发酵罐分批补料发酵条件下,菌株THY18培养36 h胸苷产量可达7.83 g/L,生产强度为0.22 g/L/h,转化率为2.7%,为后续的工程菌改进和工业化应用奠定了基础。

关键词：胸苷大肠杆菌代谢工程发酵

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代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷

生物工程学报 2015年第1期31卷 105-114页

作者：李思梦李晓静陈涛天津大学化工学院教育部系统生物工程重点实验室天津300072 海军工程大学勤务学院天津300072

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定(3′-脱氧-2′,3′-双脱氢胸苷)和叠氮胸苷的重要前体物质。应用代谢工程方法对大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)生物合成胸苷进行了研究。通过敲除E.coli BL21嘧啶回补途径的deo A、tdk和udp三个基因,BS0... 详细信息

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定(3′-脱氧-2′,3′-双脱氢胸苷)和叠氮胸苷的重要前体物质。应用代谢工程方法对大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)生物合成胸苷进行了研究。通过敲除E.coli BL21嘧啶回补途径的deo A、tdk和udp三个基因,BS03工程菌株能够积累21.6 mg/L胸苷。为了增加合成胸苷前体物核糖-5-磷酸和NADPH的供给,进一步敲除pgi和pyr L使工程菌BS05胸苷的产量提高到90.5 mg/L。而通过过表达胸苷合成途径的ush A、thy A、dut、ndk、nrd A和nrd B六个基因,菌株BS08胸苷的产量能达到272 mg/L。通过分批补料发酵,BS08最终可以积累1 248.8 mg/L的胸苷。本研究结果表明经过代谢工程改造的E.coli BL21具有良好的胸苷合成能力和应用潜力。

关键词：代谢工程胸苷从头合成途径

咖啡酸对胸腺嘧啶和胸苷阴离子自由基的快速修复

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辐射研究与辐射工艺学报 1995年第3期13卷 140-145页

作者：左志华姚思德李虎成林维真张加山林念芸中国科学院辐射化学开放研究实验室上海原子核所

采用脉冲辐解动态吸收光谱研究了咖啡酸对胸腺嘧啶、胸苷的阴离子自由基的快速修复过程，其机理是电子自嘧啶碱基及其衍生物的阴离子自由基向咖啡酸的快速转移。咖啡酸作为一种电荷转移保护剂，它具有比靶分子更高的单电子还原电位或电... 详细信息

采用脉冲辐解动态吸收光谱研究了咖啡酸对胸腺嘧啶、胸苷的阴离子自由基的快速修复过程，其机理是电子自嘧啶碱基及其衍生物的阴离子自由基向咖啡酸的快速转移。咖啡酸作为一种电荷转移保护剂，它具有比靶分子更高的单电子还原电位或电子亲合势。

关键词：咖啡酸胸腺嘧啶胸苷阴离子自由基

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大肠杆菌胸苷激酶基因的克隆表达与应用研究

生物技术 2013年第5期23卷 20-24页

作者：张广宇丁庆豹欧伶华东理工大学生物工程学院上海200237

目的:构建含大肠杆菌胸苷激酶基因(tdk)的重组质粒,并对胸苷激酶性质进行研究。方法:通过PCR技术从大肠杆菌K-12中扩增出tdk基因,并克隆到表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌株(DTK)。结果:成功扩增出了tdk基因,... 详细信息

目的:构建含大肠杆菌胸苷激酶基因(tdk)的重组质粒,并对胸苷激酶性质进行研究。方法:通过PCR技术从大肠杆菌K-12中扩增出tdk基因,并克隆到表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌株(DTK)。结果:成功扩增出了tdk基因,并构建了重组菌株。结论:获得的tdk基因长为618bp,重组菌株能表达出大量可溶性胸苷激酶蛋白。胸苷激酶的酶比活力可达到1 600U/mg;酶最适温度为45℃;最适pH为8.0。同时,胸苷激酶最佳反应条件为:50mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液,30U的粗酶,5mmol/L的MgCl2,5mmol/L的TR,5mol/L的ATP,45℃反应100min,胸苷酸的转化率可达到60%以上。

关键词：胸苷胸苷酸胸苷激酶

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酶法合成胸苷

中国医药工业杂志 1995年第9期26卷 424-427页

作者：邱蔚然沈荣坤华东理工大学生化工程研究所

综述了酶法合成胸苷的反应机理，并列举了６个应用实例。

关键词：胸苷甲基尿苷酶法合成

胸苷5′位修饰物的合成、表征及抗HIV活性

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南京大学学报（自然科学版） 1998年第4期34卷 478-482页

作者：朱宝华陈中俊王志林陈慧兰南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室

合成了两个胸苷５′位修饰物，即５′－叠氮－胸苷（５′Ｎ３－Ｔ）和５′－氨基－胸苷（５′ＮＨ２－Ｔ），以及３′－脱氧－２′，３′－二脱氢胸苷（Ｄ４Ｔ），对照物通过ＩＲ，ＵＶ／ｖｉｓ，１ＨＮＭＲ和ＭＳ等方进行了表征．抗Ｈ... 详细信息

合成了两个胸苷５′位修饰物，即５′－叠氮－胸苷（５′Ｎ３－Ｔ）和５′－氨基－胸苷（５′ＮＨ２－Ｔ），以及３′－脱氧－２′，３′－二脱氢胸苷（Ｄ４Ｔ），对照物通过ＩＲ，ＵＶ／ｖｉｓ，１ＨＮＭＲ和ＭＳ等方进行了表征．抗ＨＩＶ活性试验表明，５′－Ｎ３－Ｔ与Ｄ４Ｔ对于ＨＩＶ－１感染的ＭＴ－４淋巴细胞具有较好的抑制作用，而５′－ＮＨ２－Ｔ′几乎没有活性．由于５′－Ｎ３－Ｔ缺少５′－ＯＨ不能磷酸化。

关键词：胸苷叠氮 HIV 抗病毒活性核苷合成修饰

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核苷磷酸化酶—化学组合技术合成胸苷的研究

核苷磷酸化酶—化学组合技术合成胸苷的研究

作者：罗丽琴浙江工业大学

学位级别：硕士

核苷及其衍生物具有良好的抗病毒、抗肿瘤活性,己被广泛应用于临床,如何高效绿色合成核苷类药物一直是研究的重点。本文结合化学和生物方法,以1-氯-2-脱氧-3’,5’-二-O-对氯苯甲酰基-D-核糖为起始原料,采用结晶诱导不对称转化技术合成... 详细信息

核苷及其衍生物具有良好的抗病毒、抗肿瘤活性,己被广泛应用于临床,如何高效绿色合成核苷类药物一直是研究的重点。本文结合化学和生物方法,以1-氯-2-脱氧-3’,5’-二-O-对氯苯甲酰基-D-核糖为起始原料,采用结晶诱导不对称转化技术合成中间体2-脱氧--D-核糖-1-磷酸二环己胺盐,然后以该中间体和胸腺嘧啶为底物,利用含核苷磷酸化酶的大肠杆菌（Escherichiacoli）进行生物酶催化合成胸苷。结果表明,采用结晶诱导不对称转化的化学法合成2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己胺盐收率达到84.9%,经HPLC测得其纯度为94.7%。产物经核磁共振氢谱和红外光谱鉴定,与文献相符。以其为底物,采用核苷磷酸化酶催化合成胸苷并优化其过程,得到最佳反应条件为:底物浓度为2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己胺盐100 mmol/L,胸腺嘧啶400mmol/L;菌体量为80g/L;缓冲液pH8,反应温度55℃,反应时间4 h,转化率达到61.8%。最后,采用柱层析法对产物进行了分离,层析柱填料为硅胶（粒径为200～300目）,洗脱剂组成为F（甲醇）:V（二氯甲烷）=1:15,最终得到纯度较高的胸苷产品,经核磁共振氢谱和红外光谱鉴定,结构与目标产物一致,收率和纯度分别达到49.7%和95.3%,其熔点为184～186 ℃。通过化学-生物酶法的有效结合,有效解决了核苷合成中碰到的诸如原料来源缺乏、化学合成立体选择性差等问题,并减少了有毒试剂的使用,具有高选择、高效性、少污染的优点。该方法还可用于其它脱氧核苷的合成,对促进核苷的研究具有积极意义。

关键词：核苷类药物核苷磷酸化酶 2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己胺盐胸苷酶-化学组合

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代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷

代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷

作者：李思梦天津大学

学位级别：硕士

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定（3’-脱氧-2’,3’-双脱氢胸苷）和叠氮胸苷的重要前体物质。本文应用代谢工程方法对Escherichia coli BL21（DE3）生物合成胸苷进行了较系统的研究，构建了一系列生产胸苷的菌株。研究考查了嘧啶核苷酸的... 详细信息

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定（3’-脱氧-2’,3’-双脱氢胸苷）和叠氮胸苷的重要前体物质。本文应用代谢工程方法对Escherichia coli BL21（DE3）生物合成胸苷进行了较系统的研究，构建了一系列生产胸苷的菌株。研究考查了嘧啶核苷酸的回补途径与从头合成途径;考查了前体物NADPH和核糖-5-磷酸对胸苷积累的影响;还尝试了增加甘氨酸或天冬氨酸前体物来进一步提高胸苷的产量。最终通过分批补料发酵评价胸苷工业化的可能性。得到的主要结果如下：首先，考查了嘧啶核苷酸回补途径的胸苷积累的影响。采用组合敲除策略，敲除E. coli BL21嘧啶回补途径编码胸苷磷酸化酶、胸苷激酶和尿苷磷酸化酶的三个基因，分别是deoA、tdk、udp，构建了BS01(ΔdeoA)、BS02(ΔdeoAΔtdk)和BS03(ΔdeoAΔtdkΔudp)菌株，其中BS03工程菌株的胸苷分解途径完全被阻断，能够生产21.6mg/L胸苷。其次，为了增加合成胸苷前体物核糖-5-磷酸和NADPH的供给，在BS03的基础上进一步敲除EMP途径的pgi基因，使工程菌BS04胸苷的产量提高到78.7mg/L，其产量是BS03的3.6倍。结果表明pgi基因的敲除阻止葡萄糖-6-磷酸异构为果糖-6-磷酸，使葡萄糖-6-磷酸流向磷酸戊糖途径，增加磷酸戊糖途径的通量，为胸苷的合成提供更多的前体物。随后，为了解除嘧啶核苷酸从头合成途径中编码第一个关键酶（天冬氨酸氨甲酰基转移酶）的pyrBI操纵子的反馈阻遏，在BS04的基础上敲除了pyrB上游的调控序列pyrL，BS05可以积累90.5mg/L的胸苷。最后，进一步考查了胸苷合成途径的UDP到胸苷的核苷二磷酸还原酶(nrdA和nrdB)、核苷二磷酸激酶(ndk)、dUTP酶(dut)、胸苷酸合酶(thyA)和脱氧核糖核苷酸酶(ushA)。在p5C基础上插入大肠杆菌自身的ushA、thyA、dut和ndk，构建了pLS4质粒。在pTRC99A基础上插入nrdA和nrdB，构建pLM2质粒。在BS05基础上构建了BS06（pLS4）、BS07（pLM2）和BS08（pLS4pLM2）。BS06可以积累100.7mg/L的胸苷，BS07胸苷的产量达到169.2mg/L。而最终菌株BS08在摇瓶发酵条件下胸苷的产量可以达到272mg/L。通过分批补料发酵，BS08最终可以积累1248.8mg/L的胸苷，生产率达到15.61mg/(L·h),得率为12.5mg/(g·glucose)。本研究结果表明经过代谢工程改造的E. coli BL21具有良好的胸苷合成能力和应用潜力。

关键词：大肠杆菌胸苷从头合成补救途径分批补料发酵