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胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

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中国预防兽医学报 2023年第3期45卷 225-231页

作者：赵济钰王璐孙婧王春来李刚刘思国东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm ... 详细信息

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 MnmE基因基因突变株

胸膜肺炎放线杆菌双组份系统CpxAR调控荚膜形成和冷应激的研究

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胸膜肺炎放线杆菌双组份系统CpxAR调控荚膜形成和冷应激的研究

作者：姚庆长江大学

学位级别：硕士

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触性传染性猪呼吸道疾病。该病已在全世界范围内传播,影响所有年龄猪的生长,并对全球养猪产业... 详细信息

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触性传染性猪呼吸道疾病。该病已在全世界范围内传播,影响所有年龄猪的生长,并对全球养猪产业的经济和生态造成严重威胁。双组份系统(Two-component system,TCS)是大多数细菌的一种重要信号传导系统,能够感知外界环境刺激并作出应答。CpxAR双组份系统是多效应TCSs,目前已知其对APP生物被膜形成、氧化应激、渗透压、热应激和毒力等具有重要影响。本研究发现TCS CpxAR影响APP荚膜的形成和抗冷应激的能力,并展开了以下两方面的分子调控机制研究,以期为致病机制和减毒疫苗的研究提供理论基础。具体研究如下:1.CpxAR双组份系统调控APP荚膜形成的分子机制本研究发现CpxAR双组份系统缺失后,APP荚膜多糖输出系统cpx操纵子(cpx DCBA)的转录水平显著下调。在cpx操纵子的启动子区预测出符合调控因子CpxR结合位点规律的序列。通过凝胶迁移试验(EMSA)证实CpxR蛋白直接与cpx操纵子启动子区发生特异性结合。DNaseⅠ足迹法试验鉴定出CpxR蛋白与cpx操纵子启动子区两段精确的结合位点,位于起始密码子上游92～121 bp和146～170bp处。随后构建了cpxD基因缺失突变株及其互补菌株并通过透射电子显微镜观察到Δcpx AR缺失突变株和Δcpx D缺失突变株的荚膜相较于野生株S4074表现出明显的缺陷。为进一步探究CpxA/CpxR-cpx DCBA通路在APP感染宿主中扮演的角色,测定野生株、缺失突变株(Δcpx AR/Δcpx D)和互补菌株(CΔcpx AR/CΔcpx D)在攻毒后小鼠的存活曲线、肺组织和肝组织载菌量,并对攻毒小鼠肺脏进行组织学观察。动物试验结果表明,cpxAR双组份基因的缺失和cpx D基因的缺失均可导致APP对小鼠毒力显著降低,在小鼠肺和肝脏中定植能力减弱。这些数据表明,CpxAR双组份系统通过直接调控cpx DCBA操纵子的表达增强APP的毒力和定植能力,阐明了CpxAR-cpx DCBA通路对APP感染宿主具有重要意义。2.CpxAR双组份系统调控APP低温条件下生长的分子机制本研究以APP野生株S4074、缺失突变株(ΔcpxAR,ΔcspC,ΔcspD)和互补菌株(CΔcpx AR,CΔcsp C)为研究对象,探究CpxAR双组份系统影响APP在低温条件下生长相关的机制。通过生长曲线试验发现,CpxAR双组份系统的缺失和csp C基因的缺失均可导致APP冷生长速率显著下降,csp D基因缺失不影响其冷生长。在20℃低温环境下,q RT-PCR试验结果发现,cpxA和cpxR基因mRNA表达水平显著上调。LacZ活性检测试验结果显示,低温能够诱导csp C基因高度表达,不能诱导csp D基因表达;并且CpxAR双组份系统影响csp C基因的转录,不影响csp D基因的转录。这些结果表明,cpx A/cpx R/csp C在APP的抗冷应激过程中发挥重要作用,并且CpxAR双组份系统影响csp C m RNA的表达,不影响csp D m RNA的表达。为进一步研究APP冷适应机制,以Δcpx AR为亲本菌株,构建了含有Ptac启动子的csp C/csp D互补菌株。在20℃低温环境下,Δcpx AR/Ptac-csp C生长速率随IPTG诱导浓度的增加而显著提高,而Δcpx AR/Ptac-csp D生长速率无明显变化。这些结果进一步说明低温环境下发挥重要作用的是Csp C而不是Csp D,Csp C是关键冷休克蛋白。通过普通EMSA和点突变EMSA试验阐明了CpxR与csp C基因启动子区结合的序列是位于csp C转录起始位点上游94 bp-110 bp之间。这些试验结果表明,CpxAR双组份系统通过直接正向调控关键冷休克蛋白Csp C的表达来促进APP在低温条件下的生长。综上所述,本课题运用RT-PCR,qPCR,EMSA和DNaseⅠ足迹法等分子生物学和分子生物化学技术,不仅阐明了CpxAR双组分系统通过正向调控荚膜多糖输出系统cpx DCBA操纵子的表达来介导APP荚膜的形成和毒力调节,还证实了CpxAR双组分系统通过正向调控关键冷休克蛋白Csp C的表达来促进APP在低温条件下的生长。本研究为深入探究APP毒力和冷应激调控机制奠定了理论基础,对APP的致病机制和减毒疫苗研究具有重要意义。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 CpxAR双组份系统荚膜多糖 cpxDCBA基因簇冷休克蛋白

胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株与敏感菌株的差异蛋白质组学分析

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中国兽医杂志 2022年第2期58卷 12-16,21页

作者：李海利李静张青娴朱文豪游一焦文强方剑玉徐引弟王治方许峰王克领郎利敏张立宪邹靖河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州450002 商丘市民权县农业农村局河南商丘476800 信阳市畜牧工作站河南信阳464000

为了解猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌临床分离菌株与标准菌株蛋白质差异表达情况,采用定量差异蛋白质组学研究策略,以临床分离菌株(HN201616)与标准株(CVCC261)的细菌全蛋白质为研究对象,鉴定差异表达蛋白质及生物信息学分析。结果显示... 详细信息

为了解猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌临床分离菌株与标准菌株蛋白质差异表达情况,采用定量差异蛋白质组学研究策略,以临床分离菌株(HN201616)与标准株(CVCC261)的细菌全蛋白质为研究对象,鉴定差异表达蛋白质及生物信息学分析。结果显示:共鉴定出1373个蛋白质,其中显著差异的蛋白质数为395个[显著性差异蛋白质数目按照差异倍数(FC)≥1.5和FC≤0.67,P≤0.05进行相应的筛选],包括上调蛋白质205个,下调蛋白质190个;鉴定出的与抗生素耐药相关的蛋白质主要有二氢叶酸还原酶、外膜蛋白、麦芽糖蛋白、二氢蝶酸合成酶、谷胱甘肽转移酶、丙酮酸激酶、谷氨酰水解酶、ATP-结合盒家族蛋白等。这些结果将有助于深入探索猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药机制,为研发新型抗菌药剂和筛选潜在药物靶点提供思路。

关键词：猪接触传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌差异蛋白质组学多重耐药

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法的建立与应用

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中国动物传染病学报 2023年第2期31卷 114-119页

作者：张昆丽席振军徐民生李艳勾红潮楚品品蔡汝健李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×... 详细信息

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×10^(2)CFU/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍;特异性结果显示,该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带,而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性;应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料,结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07%(7/41)和19.51%(8/41)。以上结果表明,本研究成功建立的APP纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好,可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR 检测方法

胸膜肺炎放线杆菌在不同培养基中生长、生物膜形成及Apx毒素分泌能力的差异研究

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动物医学进展 2022年第1期43卷 6-11页

作者：吕佩帅张丽红丁小松郭芳芳崔一芳曹晓亚徐福洲山西师范大学生命科学学院山西临汾041000 北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097

为比较胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型~12型菌株在不同培养基中的生长、生物膜形成以及Apx毒素分泌能力的差异,选用5种细菌培养基BHI、LB、MHB、PPLO和TSB,首先测定APP不同血清型菌株在5种培养基中的生长曲线,进而测定不同血清型菌株在5... 详细信息

为比较胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型~12型菌株在不同培养基中的生长、生物膜形成以及Apx毒素分泌能力的差异,选用5种细菌培养基BHI、LB、MHB、PPLO和TSB,首先测定APP不同血清型菌株在5种培养基中的生长曲线,进而测定不同血清型菌株在5种培养基中的生物膜形成能力,同时测定这些菌株对20种抗菌药物的耐药性,最后测定APP血清1型菌株在5种培养基中添加CaCl_(2)对ApxⅠ毒素分泌的影响。结果显示,APP不同血清型菌株在BHI和TSB中生长较好,而在MHB、LB和PPLO生长较差;在不同培养基中培养24 h生物膜形成能力为MHB>BHI>TSB>LB>PPLO,血清3、4、7型和12型参考菌株生物膜形成能力较强;药敏结果显示,APP不同血清型菌株仅对万古霉素耐药;Apx毒素分泌结果显示,ApxⅠ在MHB、LB和PPLO中表达量显著高于BHI和TSB,而且培养基中添加5 mmol/L CaCl_(2)后ApxⅠ分泌量显著增加。研究结果可为分析APP不同血清型菌株在不同培养基中的生物学特性以及疫苗研制提供参考。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌生长曲线生物膜形成 Apx毒素

胸膜肺炎放线杆菌YecSC在硫转运及致病中的作用研究

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胸膜肺炎放线杆菌YecSC在硫转运及致病中的作用研究

作者：程钰冰华中师范大学

学位级别：硕士

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是兼性厌氧、革兰氏阴性菌,能引起猪胸膜肺炎疾病,该病对全球养猪业造成了巨大的经济损失。近年研究发现,硫营养摄取和代谢途径会影响病原菌的致病性,是潜在的病菌治疗靶点。其... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是兼性厌氧、革兰氏阴性菌,能引起猪胸膜肺炎疾病,该病对全球养猪业造成了巨大的经济损失。近年研究发现,硫营养摄取和代谢途径会影响病原菌的致病性,是潜在的病菌治疗靶点。其中半胱氨酸/胱氨酸是重要的含硫氨基酸,且与一些致病菌的毒力相关。研究表明,大肠杆菌Ydj N和YecSC-Fli Y与半胱氨酸/胱氨酸转运有关,APP中也存在大肠杆菌Ydj N和YecSC-Fli Y同源系统,且已知Ydj N和Fli Y参与半胱氨酸/胱氨酸利用,但YecSC在转运中的作用、与Fli Y及Ydj N的相互作用及与APP致病性的关系还有待进一步研究。因此,本研究以APP血清7型菌为材料,进行了相关研究,具体实验内容和取得的研究结果如下:1.APP突变株的构建与鉴定本实验以APP血清7型菌WF83野生型(Wild type,WT)作亲本,采用同源重组及负向筛选技术,构建yec S、yec C双基因缺失突变株(35)YecSC;以实验室之前建构的单基因缺失突变株(35)ydj N作亲本,构建yec S、yec C、ydj N三基因缺失突变株(35)YecSC(35)ydj N;通过电转化和抗性筛选,得到回复突变株(35)YecSC(35)ydj N-YecSC。2.APP野生型及突变株的生长特性将WT、(35)YecSC、(35)YecSC(35)ydj N、(35)YecSC(35)ydj N-YecSC转接至不同的培养基中培养,测定OD,分析其生长能力。结果显示,在仅以半胱氨酸或胱氨酸为硫源的化学限制性培养基(chemically defined medium,CDM)中,(35)YecSC(35)ydj N不能生长;而四种菌在TSB培养基和含其他硫源的CDM培养基中生长能力基本一致。结果表明,yec S、yec C、ydj N三基因缺失不能以半胱氨酸及胱氨酸为硫源。3.YecSC、Ydj N缺失对APP的氧化应激耐受力的影响将WT、(35)YecSC、(35)YecSC(35)ydj N分别暴露在含2.5 m M HO的PBS缓冲液0.5h、1 h,进行活菌计数,计算三种菌的存活率,发现(35)YecSC与WT相比较,存活率并没有降低(P>0.05),但(35)YecSC(35)ydj N的存活率下降,极显著低于WT和(35)YecSC(P0.05),且(35)YecSC vs WT和(35)YecSC(35)ydj N vs WT的竞争指数(分别为0.77、0.57)都高于致弱临界值(0.2),表明APP的YecSC、ydj N基因缺失后对小鼠的致病性无影响。本研究还以APP天然宿主—猪为模型,测定(35)YecSC(35)ydj N和WT两种菌株在猪肺部的竞争感染指数。结果显示,WT和(35)YecSC(35)ydj N在猪肺部的竞争感染指数为1.38((35)YecSC(35)ydj N vs WT),高于致弱临界值(0.2),表明APP YecSC、ydj N基因缺失后对猪仔的致病力没有衰减。综上所述,本研究证实APP YecSC的ATP酶活性可被Fli Y及特异性底物激活,YecSC的缺失影响Fli Y对半胱氨酸/胱氨酸的转运,YecSC介导的硫转运与APP抗氧化应激相关,但与APP的致病性无关。本研究进一步了解了APP硫营养物转运机制,也为后续硫营养物转运和代谢及其与APP致病力的研究提供了指引。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 YecSC-FliY/YdjN 半胱氨酸-胱氨酸利用氧化应激 ATP酶活性致病性

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ sIgA-ELISA方法的建立及临床应用

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胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ sIgA-ELISA方法的建立及临床应用

作者：赵月桥华中农业大学

学位级别：硕士

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)导致的猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是一种造成巨大经济损失的传染性呼吸道猪病。APP从呼吸道入侵,定植于扁桃体的隐窝内,造成潜伏感染,临床确诊... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)导致的猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是一种造成巨大经济损失的传染性呼吸道猪病。APP从呼吸道入侵,定植于扁桃体的隐窝内,造成潜伏感染,临床确诊有一定困难。为更好地开展猪传染性胸膜肺炎的净化,了解猪群APP感染情况,本研究基于APP ApxⅣ蛋白,建立检测猪只鼻拭子中特异性sIgA抗体的ELISA方法。并通过动物同居感染试验,探索APP感染规律及sIgA抗体分泌规律。同时对某规模化养殖场APP抗体情况进行监测,探究该场APP的感染阶段,为PCP临床净化提供技术支持。1.sIgA-ELISA方法的建立本研究以方阵滴定法对ApxⅣ蛋白浓度及样品最佳稀释度等反应条件进行确定,再对酶标抗体浓度及反应条件、样品孵育时间、显色时间等条件进行摸索。最佳反应条件如下:该方法以1μg/m L的ApxⅣ蛋白为包被抗原;样品不进行稀释,37℃孵育30 min;酶标抗体以1μg/m L浓度于37℃反应30 min;显色时间为室温下反应15 min。当Cut-off值确定为0.267时,ROC曲线下面积(AUC)最大,为0.995。此时本方法敏感性为96.9%(95%CI:92.73%-99.38%),特异性为98.6%(95%CI:91.68%-99.92%)。重复性试验发现,该方法的批内变异系数为1.057%-8.677%,批间变异系数为1.976%-8.055%。该结果表明,该方法有较好的特异性和敏感性,能够在鼻拭子样品中检测到sIgA抗体,为APP的诊断和流行病学调查提供技术手段。2.动物感染试验中sIgA分泌及排菌规律本研究通过气管注射APP血清1型菌株感染6头1月龄仔猪,22头仔猪作为未感染哨兵猪。使用本研究建立的sIgA-ELISA方法检验感染动物的鼻拭子,其中感染组的动物在感染后6 h抗体转为阳性,在感染20 h后55%感染动物的抗体转为阳性,在感染70 h后所有感染动物的抗体均转为阳性。本研究结果表明,动物感染APP后120 h内,血液中检测不到IgG抗体,但可以在鼻拭子中检测sIgA抗体,证明本研究建立的sIgA-ELISA可用于检测APP早期感染猪只。通过细菌分离试验发现,感染组可在感染6 h后的鼻拭子中检测到APP;感染20 h后,哨兵猪群出现咳喘等呼吸道症状,并在鼻拭子中检测到APP,同时环境、空气样品分别于感染6 h、60 h后检测到APP。由此可知,带毒猪在20 h内可传播给健康猪,并通过气溶胶及鼻分泌物在环境中排毒。3.sIgA-ELISA方法的临床应用湖北某种猪场存栏5000头,其中母猪2000头。2022年7月该猪场育肥阶段猪只发生呼吸困难、咳喘等症状,偶有死亡猪只。本次研究通过采集血清、鼻拭子等样品,开展血清学调查。使用本研究建立的sIgA-ELISA方法及商品化试剂盒检测90头猪的鼻拭子和血清,结果显示,同商品化试剂盒对比,建立的方法特异性为98.33%(95%CI:76.49%-98.84%),敏感性为93.33%(95%CI:89.86%-99.91%),总体符合率为96.67%。其中母猪、后备猪、育肥猪的sIgA抗体阳性率分别为83.33%、66.67%、43.33%,其中母猪、后备猪、育肥猪的血清IgG阳性率为96.67%、76.67%、33.33%。通过商品化试剂盒的检测结果可知,该场猪只10日龄、20日龄、30日龄、40日龄、50日龄、60日龄、70日龄、130日龄、150日龄、育肥猪群、后备猪群及母猪群的ApxⅣ-IgG抗体阳性率分别为100%、90%、30%、30%、30%、10%、10%、60%、80%、39.86%、66.92%、96.47%。本研究建立了检测猪只鼻拭子样品中sIgA的间接ELISA的方法,通过动物感染试验结果验证了该方法可以早于商品化试剂盒检测出猪只分泌的sIgA抗体,并成功应用于临床中,同时初步探索了PCP的净化技术。本研究建立的sIgA-ELISA方法为PCP的净化提供技术支撑。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 sIgA ELISA 同居感染

胸膜肺炎放线杆菌DppA1DppA2变株的构建及生物学特性研究

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胸膜肺炎放线杆菌DppA1DppA2变株的构建及生物学特性研究

作者：徐欢华中师范大学

学位级别：硕士

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种革兰氏阴性菌,为巴氏杆菌科放线杆菌属菌种。其引发的猪胸膜肺炎是猪的主要呼吸道疾病,该病的急性爆发以出血坏死性肺炎和纤维蛋白性胸膜炎为特征,具有高传染率和致死率,... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种革兰氏阴性菌,为巴氏杆菌科放线杆菌属菌种。其引发的猪胸膜肺炎是猪的主要呼吸道疾病,该病的急性爆发以出血坏死性肺炎和纤维蛋白性胸膜炎为特征,具有高传染率和致死率,给全球猪养殖业造成了巨大的经济损失。该病发病快,传染力强,且在感染一些猪呼吸系统疾病后,容易继续感染猪胸膜肺炎,多种因素使猪胸膜肺炎防御和管控难度大。硫是致病菌繁殖和感染宿主所不能缺乏的重要化学物质,在细胞中发挥着多种功能,如参与构成细胞组分、信号传导、氧化还原等过程。APP作为一种猪的致病菌,其感染宿主致病能力与营养物质转运相关。目前对APP硫转运特别是谷胱甘肽的转运机制及其与致病力的关系还不清楚,为阐明APP营养物质的转运及代谢在感染中的作用,本研究对可能的二肽转运蛋白(Dipeptide Transporter)DppA1、DppA2在硫转运过程中的功能进行了分析,主要内容与结果如下:1.突变株的构建及鉴定以APP血清7型菌株WF83为亲本菌,利用同源重组和负向筛选法,构建了dppA1和dppA2的单基因缺失突变株ΔdppA1、ΔdppA2,双基因缺失突变株ΔdppA1ΔdppA2-1、ΔdppA1ΔdppA2-2;通过电转化和抗性筛选法,分别将dppA1、dppA2、dppA1dppA2基因导入到ΔdppA1ΔdppA2-1菌株中,构建回复突变株ΔdppA1ΔdppA2-1-CΔA1、ΔdppA1ΔdppA2-1-CΔA2 和ΔdppA1ΔdppA2-1-CΔA1A2。2.突变株体外生长特性分析将WF83、ΔdppA1、AdppA2、ΔdppA1ΔdppA2-1接种于TSB培养基和含不同硫源的化学限制性培养基(chemically defined medium,CDM)中,测定生长曲线,分析dppA1、dppA2基因缺失对APP生长水平的影响。结果显示,三种突变株与野生型相比,在TSB中生长能力无明显区别;在仅含谷胱甘肽的CDM中,ΔdppA1、ΔdppA2的生长水平与野生型WF83菌株一致,双基因缺失突变株ΔdppA1ΔdppA2-1有少量生长,低于亲本菌的生长水平,回复突变株ΔdppA1ΔdppA2-1-CΔA1、ΔdppA1ΔdppA2-1-CΔA2和AdppA1ΔdppA2-1-CAA1A2在谷胱甘肽CDM中的生长水平不能恢复至野生型水平,与ΔdppA1ΔdppA2-1相当。另外在仅含谷胱甘肽的CDM中,ΔdppA1ΔdppA2-2与WF83生长能力无明显区别。3.AdppA1ΔdppA2-1致病性分析本研究初步分析了谷胱甘肽利用受阻对APP致病性的影响。测定了 WF83野生型和双基因缺失突变株ΔdppA1ΔdppA2-1在小鼠肺竞争感染能力,结果显示,ΔdppA1ΔdppA2-1与野生型WF83在小鼠肺部竞争感染指数为1.35,高于致弱临界值(0.2)。为进一步验证突变株的致病力,本研究还通过鼻腔接种法感染仔猪,测定了ΔdppA1ΔdppA2-1和WF83野生型在猪肺部中的竞争感染能力。结果表明,两种菌在肺部组织中的竞争感染指数为0.91,高于致弱临界值(0.2),表明dppA1和dppA2基因的缺失不影响APP的致病性。综上,本研究初步表明,dppA1和dppA2基因连同之间的间隔序列同时缺失后,影响了 APP在谷胱甘肽CDM中的生长能力,间接表明这段序列与APP谷胱甘肽利用相关,但可能并不是因为DppA1和DppA2的贡献。不过,虽然这段序列的缺失影响了 APP对谷胱甘肽的利用,但缺失株对小鼠和仔猪的致病力并没有显著变化。本研究虽未能鉴定DppA1、DppA2与APP谷胱甘肽转运的直接关系,但为后续研究这两个基因在其他短肽转运中的作用,以及阐明APP谷胱甘肽转运与细菌感染致病的关系奠定了基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 dppA1 dppA2 突变株构建谷胱甘肽转运致病性

胸膜肺炎放线杆菌诱导肺脏免疫细胞应答特征及CD14+/-中性粒细胞免疫功能研究

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胸膜肺炎放线杆菌诱导肺脏免疫细胞应答特征及CD14+/-中性粒细胞...

作者：陈培如吉林大学

学位级别：硕士

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的高传染性接触性呼吸道疾病。由于APP血清型众多,灭活疫苗缺乏交叉保护,以及耐药菌增多且细菌与细菌/病毒... 详细信息

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的高传染性接触性呼吸道疾病。由于APP血清型众多,灭活疫苗缺乏交叉保护,以及耐药菌增多且细菌与细菌/病毒的混合感染严重,特别是“禁抗限抗”政策实施后,PCP及其相关疾病增加,给养猪业造成严重的经济损失。肺脏是APP感染的重要受损组织,其免疫应答特征的解析是防治的基础。从宿主免疫的角度出发,系统揭示APP诱导的肺脏免疫应答特征,确证疾病发展过程中关键免疫细胞亚群及功能,不仅为APP防治提供新靶点,也为肺脏其他感染性疾病的提供新思路。因此,本研究首先构建了APP感染小鼠模型,通过高通量质谱流式技术联合生物信息学分析,解析了APP感染后不同时间点小鼠肺脏免疫细胞组成与变化。结果显示感染APP后,肺脏的免疫细胞具有极强的异质性,共鉴定表型不同的髓系细胞亚群27个和淋巴系细胞亚群21个。绘制了APP感染后肺脏免疫细胞应答图谱,鉴定特异性的免疫细胞亚群,其中Ly-6GCD4T尚未被报道。肺脏中鉴定的17种中性粒细胞亚群,表型聚类为5大群异质性中性粒细胞亚群,其中CD14中性粒细胞主要富集于肺组织修复期(24 h),提示CD14差异表达的中性粒细胞群可能与APP感染进程相关。随后,我们使用流式细胞术、单细胞测序技术及生物信息学分析进一步对小鼠和仔猪CD14差异表达的中性粒细胞亚群进行基本特性研究。流式检测小鼠CD14中性粒细胞白介素17A(IL-17A)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素10(IL-10)和白介素21(IL-21)分泌能力及主要组织相容性复合体2类(MHC-II)、CD86和APP的表达能力,相比于CD14中性粒细胞,CD14中性粒细胞具有较强的细胞因子分泌能力,可以分泌促炎因子和抑炎因子。CD14中性粒细胞的抗原提递能力比CD14中性粒细胞更强。仔猪肺脏细胞单细胞测序分析确证CD14中性粒细胞也存在于APP感染仔猪,并且细胞因子分泌和抗原提呈相关基因表达及Top基因在2群细胞中的GO和KEEG分析得到了与小鼠肺脏中相似的结果。此外,流式检测发现CD14和CD14中性粒细胞普遍存在于肺炎克雷伯、大肠杆菌和绿脓杆菌等革兰氏阴性菌感染的肺组织中。为了进一步研究CD14中性粒细胞功能,我们联合LPS体外诱导CD14中性粒细胞试验和过继转移方式将CD14中性粒细胞转移至正常小鼠肺脏,进行APP感染,检测小鼠存活率、临床症状和载菌量,发现CD14中性粒细胞会在感染早期加重小鼠死亡,抑制对细菌的清除,但感染后期加速小鼠临床症状的恢复,该细胞群在体内可能发挥抑炎作用。最后,免疫细胞的功能受各种免疫分子如细胞因子的调控,由于中性粒细胞表面表达白介素5(IL-5)受体,因此本研究构建了IL-5敲除(IL-5)小鼠APP感染模型,应用流式细胞术、免疫荧光、RT-q PCR、平板涂布检测IL-5和野生性(wild type,WT)小鼠中性粒细胞的杀菌能力、ROS表达、细胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)释放和杀菌颗粒蛋白m RNA。同时检测IL-5和WT小鼠感染前后肺组织内CD14中性粒细胞亚群数量。结果显示,IL-5缺失小鼠临床症状加重,死亡率升高,对APP感染的抵抗力减弱。进一步研究发现IL-5缺失导致小鼠未感染状况下CD14中性粒细胞增多,并且通过抑制中性粒细胞NET的形成而不是ROS的产生及杀菌颗粒蛋白来降低中性粒细胞杀菌能力。综上所述,本研究系统解析了APP诱导的肺脏免疫应答特征,构建了APP感染时间特异性图谱,鉴定了感染过程中关键免疫细胞亚群,并揭示CD14和CD14中性粒细胞亚群的免疫功能及其IL-5对其的影响,不仅丰富了人们对APP感染免疫应答的认识,也为APP及其相关感染性肺炎的防治提供了新思路。

关键词：肺脏免疫应答免疫细胞中性粒细胞亚群白介素5 胸膜肺炎放线杆菌