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尼古丁通过TET2调控的Fas去甲基化促进胸腺细胞凋亡

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尼古丁通过TET2调控的Fas去甲基化促进胸腺细胞凋亡

作者：刘莎武汉大学

学位级别：硕士

研究背景:尼古丁作为香烟中最主要的成瘾和毒性成分,在吸烟引起的免疫系统损伤和相关疾病中发挥着关键和主导作用。本室前期研究显示,孕期尼古丁暴露可促进胎胸腺细胞及CD4单阳性(CD4 single positive,CD4SP)细胞凋亡,引起CD4+初始T细... 详细信息

研究背景:尼古丁作为香烟中最主要的成瘾和毒性成分,在吸烟引起的免疫系统损伤和相关疾病中发挥着关键和主导作用。本室前期研究显示,孕期尼古丁暴露可促进胎胸腺细胞及CD4单阳性(CD4 single positive,CD4SP)细胞凋亡,引起CD4+初始T细胞输出减少,进而导致子代免疫功能紊乱,其中Fas通路发挥重要的促凋亡作用,但具体的分子机制还不清楚。有研究证明,尼古丁可调控胎组织基因的DNA甲基化水平,且Fas表达可受DNA甲基化的调控。因此我们推测,尼古丁可能通过调控Fas的DNA甲基化修饰促进胸腺细胞凋亡。目的:观察尼古丁对胸腺细胞凋亡的影响,并从DNA甲基化修饰角度,探讨Fas凋亡通路介导的尼古丁促胸腺细胞凋亡的分子机制。方法:(1)胸腺细胞凋亡及Fas通路基因表达:选取出生后3周断奶ICR健康小鼠,无菌环境下建立原代胸腺细胞培养体系,分成正常对照组和尼古丁不同剂量(25、50、100、200 和 400 μM)组,给药 48 h,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞活力。选取合适的尼古丁剂量(25、50和100 μM)给药48h,流式细胞术(Fluorescence Activating Cell Sorter,FACS)检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化;根据尼古丁量效结果,选取50 μM尼古丁分别处理胸腺细胞0、24、48、72 h,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测胸腺细胞α7 nAChR和Fas凋亡通路相关基因(Fas、Caspase 8、Caspase 3)的mRNA表达,FACS检测胸腺细胞膜表面的Fas蛋白表达,Caspase酶活性检测试剂盒测定Caspase 8和Caspase 3的活性蛋白水平。(2)Fas甲基化及甲基化酶参与尼古丁促胸腺细胞凋亡:首先,根据尼古丁对胸腺细胞的量效和时效作用结果,选择50 μM作为尼古丁给药剂量和48 h作为尼古丁给药时间,分子量阵列技术(SequenomMassARRAY)检测Fas启动子区的DNA甲基化水平,qPCR检测甲基化酶(TET1、TET2、TET3、Dnmt 1、Dnmt 3a、Dnmt 3b)的mRNA表达。然后选取表达显著改变的基因TET2进行siRNA干扰,Western blot检测TET2的蛋白表达,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞的凋亡比例及细胞膜表面的Fas蛋白表达,Sequenom MassARRAY检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。(3)研究α7nAChR在尼古丁诱导的胸腺细胞凋亡中的作用:尼古丁处理前1小时给予尼古丁受体特异性抑制剂α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-Btx)1 μg/mL或PBS处理,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化和细胞膜表面的Fas蛋白表达,Caspase酶活性检测试剂盒测定Caspase 8和Caspase 3的活性蛋白水平,Western blot检测TET2的蛋白表达,Sequenom MassARRAY检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。结果:(1)尼古丁促进胸腺细胞凋亡并激活α7 nAChR/Fas通路基因的表达:①细胞活性结果:25μM尼古丁对胸腺细胞活力没有显著影响,而50～200μM尼古丁呈剂量依赖性降低了胸腺细胞的活力(P胸腺细胞和CD4SP细胞的凋亡无明显影响,而50和100μM尼古丁显著增加了二者的凋亡比例;时效结果显示,尼古丁作用24h对胸腺细胞的凋亡无明显影响,随着尼古丁作用时间的延长,48～72h胸腺细胞的凋亡率呈时间依赖性显著增加(P胸腺细胞凋亡:①Fas甲基化和甲基化酶表达的结果:尼古丁处理后,胸腺细胞Fas基因启动子区核酸(nuleotide,nt)-2394、nt-2441 及 nt+295 的甲基化水平显著降低(P胸腺细胞和CD4SP细胞凋亡效应、Fas去甲基化及Fas表达升高均被抑制。(3)α7nAChR介导Fas去甲基化及胸腺细胞凋亡:添加α-Btx后,尼古丁诱导的总

关键词：尼古丁胸腺细胞凋亡 DNA甲基化 Fas

褪黑素对大鼠胸腺细胞凋亡及线粒体途径凋亡调控蛋白的影响

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褪黑素对大鼠胸腺细胞凋亡及线粒体途径凋亡调控蛋白的影响

作者：郑琳福建医科大学

学位级别：硕士

目的通过研究体外培养大鼠胸腺细胞的自然凋亡和褪黑素对其凋亡的影响及机制,探索褪黑素影响胸腺细胞凋亡的机制,进一步揭示褪黑素与胸腺发育及细胞免疫之间的关系,从而丰富对神经-内分泌-免疫网络的认识。方法①体外培养大鼠胸腺细胞... 详细信息

目的通过研究体外培养大鼠胸腺细胞的自然凋亡和褪黑素对其凋亡的影响及机制,探索褪黑素影响胸腺细胞凋亡的机制,进一步揭示褪黑素与胸腺发育及细胞免疫之间的关系,从而丰富对神经-内分泌-免疫网络的认识。方法①体外培养大鼠胸腺细胞,分为空白对照组(Ctrl)和褪黑素干预组M1、M2、M3、M4、M5(药物浓度分别为10、10、10、10、10mol/L)。②在培养的第4、8小时以Annexin-V/PI双标法染色及流式细胞仪检测,观察不同浓度褪黑素干预下胸腺细胞凋亡率的变化。③用RT-PCR法及凝胶成像分析系统观察分析培养的第4、8小时,不同浓度褪黑素干预下胸腺细胞Bax、Bcl-xL、Bim mRNA量的变化。④运用western blot法观察培养的第4、8小时,不同浓度褪黑素干预下胸腺细胞Bax、Bcl-xL和Bim蛋白表达量的变化。结果①流式细胞检测结果显示,培养4小时,FITC/ PI的大鼠胸腺细胞高于8小时,相同培养时间的M1、M2、M3组FITC/ PI细胞明显下降。②半定量PT-PCR及Western blot结果显示,Bax和Bim的表达随时间延长而增高,mRNA与蛋白水平一致,但对照组与褪黑素干预组之间无明显差异;相同培养时间的M1、M2、M3组与对照组相比,Bcl-xL mRNA与蛋白水平均出现升高,但同一处理组的4小时与8小时比较无明显变化。结论体外培养的大鼠胸腺细胞随着时间延长而凋亡增加,褪黑素能降低胸腺细胞的早期凋亡率,并呈剂量依赖性。Bax和Bim的表达随培养时间延长而增高,褪黑素干预对其无明显影响;褪黑素干预后Bcl-x的表达水平呈剂量依赖性增高,但不随培养时间延长而变化。因此,褪黑素可通过影响线粒体途径从而调控大鼠胸腺细胞的凋亡。

关键词：褪黑素胸腺细胞凋亡线粒体途径 Bax Bcl-xL Bim

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地塞米松诱导大鼠胸腺细胞凋亡

上海免疫学杂志 1995年第2期15卷 65-68页

作者：周安宇谌贻璞邹万忠王海燕卫生部肾脏疾病重点实验室北京医科大学肾脏病研究所

细胞凋亡是细胞受到特异刺激后启动内在“自杀”程序而引起的一种控制性死亡。为观察糖皮质激素对免疫器官──胸腺的调节作用，本文加地塞米松与大鼠胸腺细胞共同孵育，胸腺细胞是现了凋亡的典型形态学改变；提取该培养细胞的ＤＮＡ进... 详细信息

细胞凋亡是细胞受到特异刺激后启动内在“自杀”程序而引起的一种控制性死亡。为观察糖皮质激素对免疫器官──胸腺的调节作用，本文加地塞米松与大鼠胸腺细胞共同孵育，胸腺细胞是现了凋亡的典型形态学改变；提取该培养细胞的ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳可见典型“阶梯状”条带，提供了该细胞发生凋亡的生物化学依据。本研究结果表明糖质激素能诱导胸腺细胞凋亡。

关键词：地塞米松胸腺细胞凋亡大鼠

人工感染鸡包涵体肝炎病毒雏鸡胸腺细胞凋亡的检测

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中国兽医科技 2003年第6期33卷 42-44页

作者：王凤龙内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

应用原位末端标记方法对人工感染鸡包涵体肝炎病毒雏鸡的胸腺细胞的凋亡进行检测 ,结果表明 ,鸡包涵体肝炎可引发胸腺细胞的凋亡 ,多数凋亡阳性细胞核结构完整 ,核内有数量不等的阳性颗粒 ,少部分凋亡阳性细胞核破碎或核浓缩 ;HE染色光... 详细信息

应用原位末端标记方法对人工感染鸡包涵体肝炎病毒雏鸡的胸腺细胞的凋亡进行检测 ,结果表明 ,鸡包涵体肝炎可引发胸腺细胞的凋亡 ,多数凋亡阳性细胞核结构完整 ,核内有数量不等的阳性颗粒 ,少部分凋亡阳性细胞核破碎或核浓缩 ;HE染色光学显微镜下观察 ,多数坏死的胸腺细胞属细胞凋亡。

关键词：人工感染鸡包涵体肝炎雏鸡胸腺细胞细胞凋亡检测原位末端标记方法发病机理禽类腺病毒

甲状腺素对脾虚小鼠肺、脾和胸腺细胞体外分泌造血细胞集落刺激因子的影响

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中国中西医结合杂志 1999年第S1期19卷 89-90页

作者：章梅夏天南耘张仲海徐重明第四军医大学西京医院中医科西安710032

造血细胞集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)作为一组糖蛋白,已被人们认识。它可由多种组织细胞产生,主要分为四大类,即 MU-CSF、GM-CSF、G-CSF 和M-CSF。CSF 在刺激骨髓细胞的增殖与分化,激活成熟粒细胞和巨噬细胞的功能,增... 详细信息

造血细胞集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)作为一组糖蛋白,已被人们认识。它可由多种组织细胞产生,主要分为四大类,即 MU-CSF、GM-CSF、G-CSF 和M-CSF。CSF 在刺激骨髓细胞的增殖与分化,激活成熟粒细胞和巨噬细胞的功能,增强机体免疫力等方面有重要作用。材料和方法1 实验动物 BALB/C 6～8周龄纯系雄性小白鼠,体重16～22g,平均(19±3)g,由本校动物中心提供。2 药物利血平注射液,1mg/ml,上海医科大学红旗制药厂,批号930128。四君子汤:人参48g 白术36g 茯苓36g 炙甘草18g,水煎液浓度每毫升4g,本院中药房提供。3 试剂淋巴细胞培养液,美国 Gibc 公司产品;

关键词：巨噬细胞正常组造血细胞集落刺激因子医科大学甲状腺素胸腺细胞增殖与分化脾虚小鼠四君子汤西京

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激素对重症肌无力胸腺细胞增殖和凋亡的影响

中华实验外科杂志 2002年第3期19卷 201-202页

作者：张清勇王铁栓魏云徐美英杜英阮丽荣李倩如梁长春郑州大学附属第二医院胸外科 450003 郑州大学微生物学与免疫学教研室安阳市人民医院神经科

目的　通过观察激素对胸腺细胞凋亡及Fas表达的影响 ,探讨糖皮质激素、雌激素、甲状腺素在重症肌无力(MG)发生、发展和治疗中的作用。方法　用流式细胞术分析胸腺细胞Fas、CD4 和CD8分子的表达 ;用琼脂糖凝胶电泳和细胞形态学观察细胞凋... 详细信息

目的　通过观察激素对胸腺细胞凋亡及Fas表达的影响 ,探讨糖皮质激素、雌激素、甲状腺素在重症肌无力(MG)发生、发展和治疗中的作用。方法　用流式细胞术分析胸腺细胞Fas、CD4 和CD8分子的表达 ;用琼脂糖凝胶电泳和细胞形态学观察细胞凋亡 ;用噻唑蓝 (MTT)比色分析法观察细胞的增殖情况。结果　地塞米松和雌激素均能抑制MG患者胸腺细胞增殖 ,对胸腺细胞的细胞增殖抑制率分别为 63.72 %和 61 .0 6% ,胸腺细胞DNA电泳可见梯状条带。甲状腺素可促进胸腺细胞增殖。地塞米松诱导MG患者胸腺细胞Fas表达百分率增加 ,数据为 (2 0 .38±6 .0 7) % ,与空白对照组 (1 2 .43± 4.32 ) %相比 ,差异有显著性(P<0 .0 5)。

关键词：胸腺细胞脱噬作用细胞凋亡激素重症肌无力细胞增殖影响

清毒退热药对内毒素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的保护作用

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中国老年学杂志 2005年第5期25卷 580-581页

作者：张杰薛玉凤赵聚宾程玉新河北省医学科学院河北石家庄050021

目的探讨清毒退热药对内毒素引起的小鼠胸腺细胞凋亡的保护作用。方法24只昆明种小鼠,随机分为正常对照组、模型组和预防组。剖取胸腺观察细胞凋亡的变化。结果模型组胸腺细胞凋亡数和DNA断裂的百分率明显多于治疗组和正常组。结论清毒... 详细信息

目的探讨清毒退热药对内毒素引起的小鼠胸腺细胞凋亡的保护作用。方法24只昆明种小鼠,随机分为正常对照组、模型组和预防组。剖取胸腺观察细胞凋亡的变化。结果模型组胸腺细胞凋亡数和DNA断裂的百分率明显多于治疗组和正常组。结论清毒退热药对内毒素诱导的胸腺细胞凋亡有明显保护作用。

关键词：清毒退热药内毒素细胞凋亡胸腺细胞小鼠

催产素对BALB/c小鼠胸腺细胞增殖的促进作用

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细胞与分子免疫学杂志 2001年第2期17卷 131-132页

作者：金亮王百忍段晓莉鞠躬第四军医大学神经科学研究所陕西西安710032

目的研究催产素oxytocin,OT对离体Balb/c小鼠胸腺细胞增殖的影响。方法用3HTdR掺入法,研究在离体培养状态下不同浓度的OT对胸腺细胞增殖的影响。结果在1×105g/l至1×103g/l的范围内OT可使胸腺细胞增殖指数增加,在此范围之外对其... 详细信息

目的研究催产素oxytocin,OT对离体Balb/c小鼠胸腺细胞增殖的影响。方法用3HTdR掺入法,研究在离体培养状态下不同浓度的OT对胸腺细胞增殖的影响。结果在1×105g/l至1×103g/l的范围内OT可使胸腺细胞增殖指数增加,在此范围之外对其增殖指数无明显影响。结论在一定浓度范围内OT有促进胸腺细胞增殖的作用。

关键词：催产素胸腺细胞神经免疫调节细胞增殖

改构酸性成纤维细胞生长因子对小鼠胸腺细胞凋亡的影响

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中国生物工程杂志 2003年第9期23卷 80-84页

作者：曹定国李校坤付小兵程飚方利君暨南大学生物医药研发中心广州510632 解放军304医院全军创伤修复重点实验室北京100037

目的 :探讨改构酸性成纤维细胞生长因子 (MaFGF)对地塞米松 (DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡的保护作用。方法 :利用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡的模型 ,将实验分为空白对照组、DEX处理组、aFGF +DEX组和MaFGF +DEX组 ,采用DNA琼脂糖凝胶... 详细信息

目的 :探讨改构酸性成纤维细胞生长因子 (MaFGF)对地塞米松 (DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡的保护作用。方法 :利用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡的模型 ,将实验分为空白对照组、DEX处理组、aFGF +DEX组和MaFGF +DEX组 ,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪两种分析方法 ,测定MaFGF对小鼠胸腺细胞凋亡的影响。结果 :空白对照组凋亡率为 1 68% ,DEX处理后小鼠胸腺细胞出现明显的细胞凋亡 ,凋亡率为 1 9 6% ,aFGF和MaFGF处理后的细胞凋亡受到抑制 ,凋亡率分别下降到 1 5 95 %和 1 2 93% ,MaFGF效应强于aFGF ,且以剂量依赖方式发挥作用。结论 :MaFGF具有以剂量依赖方式的胸腺细胞保护作用。

关键词：酸性成纤维细胞生长因子胸腺细胞细胞凋亡地塞米松