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胰腺癌细胞ezrin基因启动子的靶向敲除及生物学功能研究

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胰腺癌细胞ezrin基因启动子的靶向敲除及生物学功能研究

作者：代基强遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:鉴定人胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因转录调控区,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除ezrin启动子,检测启动子敲除对Panc-1细胞的ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法:将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰... 详细信息

目的:鉴定人胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因转录调控区,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除ezrin启动子,检测启动子敲除对Panc-1细胞的ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法:将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区。使用在线软件预测ezrin转录调控区的启动子上下游g RNA靶位点,构建基因编辑重组质粒p X458-PL和p X459-PR。将重组质粒以不同的组合方式共转染Panc-1细胞,加入嘌呤霉素初步筛选,针对待敲除序列进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定Panc-1细胞ezrin启动子的靶向敲除。采用RT-q PCR、Western blotting、细胞增殖和划痕实验分别检测靶向敲除启动子的胰腺癌细胞的ezrin基因m RNA和蛋白的表达情况、细胞增殖和迁移能力的变化。结果:荧光素酶报告基因检测结果显示,ezrin基因上游–87/+134片段具有转录激活作用,–1541/–706片段具有转录激活和增强双重作用。测序结果显示,成功构建了靶向ezrin启动子的基因编辑重组质粒。重组质粒共转染至Panc-1细胞,得到ezrin启动子敲除的胰腺癌细胞Panc-1-epd。与未转染基因编辑重组质粒的对照细胞Panc-1相比,敲除启动子的Panc-1-epd细胞,其ezrin基因m RNA和Ezrin蛋白表达均显著下调,细胞增殖及迁移能力均显著受到抑制。结论:靶向敲除ezrin基因启动子的人胰腺癌细胞ezrin基因表达下调,细胞增殖与迁移能力受到抑制。

关键词：胰腺癌细胞基因编辑 ezrin启动子细胞增殖

胰腺癌细胞中PTN蛋白差异表达对神经元细胞的影响及机制

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胰腺癌细胞中PTN蛋白差异表达对神经元细胞的影响及机制

作者：张策河南科技大学

学位级别：硕士

目的:本研究在细胞实验中,过表达/沉默胰腺癌细胞中Ptn基因,达到PTN蛋白差异表达。观察PTN蛋白差异表达对背根神经节神经元(Dorsal Root Ganglion neurons,DRGn)增殖、凋亡影响,及对DRGn轴突生长的影响。方法:查询基因库(NCBI)中Ptn的... 详细信息

目的:本研究在细胞实验中,过表达/沉默胰腺癌细胞中Ptn基因,达到PTN蛋白差异表达。观察PTN蛋白差异表达对背根神经节神经元(Dorsal Root Ganglion neurons,DRGn)增殖、凋亡影响,及对DRGn轴突生长的影响。方法:查询基因库(NCBI)中Ptn的基因序列,构建过表达/沉默表达Ptn基因的质粒载体;用脂质体法将构建的过表达/沉默Ptn基因的质粒载体转染到培养的MIA PaCa-2胰腺癌细胞中,同时设计分组:空白对照组、空质粒组、实验组;之后采用qRT-PCR检测胰腺癌细胞中Ptn mRNA的表达,Western blot检测胰腺癌细胞中PTN蛋白的表达,用以验证过表达/沉默效果。提取不同分组中过表达/沉默表达的PTN蛋白,加入到培养的DRGn中,使用CCK-8法测定细胞增殖曲线,分析PTN蛋白差异表达对DRGn的细胞增殖、凋亡的影响;免疫荧光检测PTN蛋白差异表达对DRGn轴突生长的影响。结果:过表达/沉默胰腺癌细胞中Ptn基因,实验组中Ptn mRNA的表达较空白对照组明显升高/减少,差异具有统计学意义(p胰腺癌细胞中PTN蛋白的表达较空白对照组明显升高/减少,差异具有统计学意义(p细胞增殖曲线,高表达/低表达的PTN蛋白对背根神经节神经元细胞增殖情况影响变化明显(p胰腺癌细胞中PTN蛋白的表达。2.沉默Ptn基因,可以减少胰腺癌细胞中PTN蛋白的表达。3.PTN蛋白高表达能促进DRGn增殖及轴突生长,增加轴突复杂性。4.PTN蛋白低表达可以减少DRGn增殖及轴突生长,降低轴突复杂性。

关键词：胰腺癌细胞 PTN蛋白差异表达背根神经节神经元

miR-30c/YWHAZ轴对胰腺癌细胞耐药性的影响

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中华内分泌外科杂志 2022年第5期16卷 605-610页

作者：王金康湧张玮刘振山西医科大学第一医院肝胆胰外科太原030001 山西医科大学第一医院普通外科太原030001

目的探讨微小RNA-30c(miR-30c)是否通过靶向酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白zeta多肽(YWHAZ)介导胰腺癌细胞对吉西他滨(gemcitabine,Gb)耐药性的作用。方法用RT-qPCR法筛选出人胰腺癌细胞系中miR-30c表达最低的SW1990细胞株... 详细信息

目的探讨微小RNA-30c(miR-30c)是否通过靶向酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白zeta多肽(YWHAZ)介导胰腺癌细胞对吉西他滨(gemcitabine,Gb)耐药性的作用。方法用RT-qPCR法筛选出人胰腺癌细胞系中miR-30c表达最低的SW1990细胞株,并建立吉西他滨耐药细胞株SW1990/吉西他滨,设置为SW1990/吉西他滨组(未转染)、miR-30c过表达(Ad-miR-30c)组、Ad-miR-30c阴性对照(Ad-eGFP)组、SW1990组。RT-qPCR法检测miR-30c水平;CCK-8法测细胞半数抑制浓度(IC50)及耐药指数(IR);Western blot法检测耐药相关蛋白P-gp、凋亡相关蛋白Caspase-1、迁徙转移相关蛋白MMP-9、YWHAZ蛋白及下游通路-激酶丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/细胞外调节蛋白激酶1(ERK1)蛋白表达。共转染Ad-miR-30c及YWHAZ过表达腺病毒(Ad-YWHAZ),Western blot法测细胞P-gp及YWHAZ通路相关蛋白表达。结果SW1990/吉西他滨耐药细胞的IC50[(59.16±5.14)nmol/L]及IR(11.15±0.19)、YWHAZ蛋白(1.59±0.15)、P-gp(2.43±0.26)表达升高,miR-30c(0.25±0.02)表达降低(P细胞中miR-30c(1.59±0.15)表达后,细胞的IC50[(25.14±2.15)nmol/L]及IR(5.48±0.12)、YWHAZ(1.49±0.13)、P-gp(1.46±0.10)降低(P胰腺癌耐吉西他滨细胞株中miR-30c表达降低,上调miR-30c表达可靶向抑制YWHAZ/p38MAPK/ERK途径,并抑制耐药蛋白P-gp表达,降低胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。

关键词：微小RNA-30c 胰腺癌细胞耐药性吉西他滨

脂质运载蛋白-2对胰腺癌细胞“干性”的调控作用及机制研究

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脂质运载蛋白-2对胰腺癌细胞“干性”的调控作用及机制研究

作者：张嘉敏河北医科大学

学位级别：硕士

胰腺癌是恶性度最高的肿瘤之一,确诊和治疗较为困难,死亡率高,预后差,其发病率与死亡率相接近。现在越来越多的细胞学和分子生物学证据证实,肿瘤发生起源于肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)。CSCs由于其自我更新能力和耐药特性,参与... 详细信息

胰腺癌是恶性度最高的肿瘤之一,确诊和治疗较为困难,死亡率高,预后差,其发病率与死亡率相接近。现在越来越多的细胞学和分子生物学证据证实,肿瘤发生起源于肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)。CSCs由于其自我更新能力和耐药特性,参与肿瘤的转移和复发。脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2,Lcn2)是25KD的分泌型糖蛋白,属于载脂蛋白超家族成员,也是新近发现的一种与肿瘤高度相关的蛋白。目前有研究表明Lcn2表达程度的不同与胰腺癌的发生发展密切相关。Lcn2具有多种重要的生物功能,参与许多生命过程,包括凋亡、增殖、信号转导、肿瘤细胞的发生以及肿瘤的发展进程。然而,Lcn2在调控胰腺癌细胞干细胞特性中的作用及其机制尚不清楚。本课题组前期应用高通量测序技术,系统分析全基因组后发现Lcn2在胰腺癌干细胞中的表达明显下调,通过多种分子生物学实验和动物体内实验,观察到Lcn2与干细胞标志物表达呈负相关,且通过负向调控c-Jun磷酸化影响胰腺癌细胞的“干性”。由此,本课题拟通过对Lcn2/c-Jun调控轴的研究,探讨Lcn2在调控胰腺癌细胞干性转归过程中的作用及具体分子机制,推动胰腺癌转移和复发相关的病理研究,将为筛选新的胰腺癌靶点提供理论基础和科学依据。目的:本研究通过探究Lcn2对胰腺癌细胞干性的影响,明确其分子作用机制,为进一步认识胰腺癌转移和复发过程及筛选新靶点提供实验依据。方法:1.免疫组化的方法检测Lcn2在人胰腺癌组织中的表达程度,并分析其与胰腺癌临床病理特征的相关性。2.在PANC-1和MIA-Pa Ca2胰腺癌细胞中,通过质粒转染的方法构建稳定过表达Lcn2的胰腺癌细胞系并检测干细胞标志物SOX2、OCT4、CD24、Nanog、CD44和Ep CAM的表达。3.在Bx PC3胰腺癌细胞中,通过感染Lenti-Cas9-puro-Lcn2敲除慢病毒,构建稳定敲除Lcn2细胞系并检测干细胞标志物SOX2、OCT4、CD24、Nanog、CD44和Ep CAM的表达。4.成球实验检测Lcn2过表达和敲除细胞系各组间的成球数目。5.通过皮下注射的方式构建荷瘤模型,体内水平验证Lcn2过表达和敲低后对胰腺癌细胞干性特征的影响。6.利用磷酸蛋白芯片初筛Lcn2调控的下游分子,并通过western blot方法验证差异分子的表达。7.通过质粒转染、抑制剂和激动剂处理细胞,检测差异分子上下游调控关系。8.检测Lcn2下游分子p-c-Jun对胰腺癌细胞干性标志物的表达及成球能力的影响。9.检测肿瘤微环境中转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1),对Lcn2表达的调控关系。结果:1.分别对GEO(Gene Expression Omnibus)和TCGA(Cancer Genome Atlas)数据库数据分析后发现,对比正常胰腺组织,Lcn2在胰腺癌组织中表达升高。通过利用组织芯片进行Lcn2免疫组化染色后评分,统计结果和数据库结果一致,显示Lcn2在胰腺癌组织中显著高表达;且其表达量与病人年龄、性别、临床分期和病理分级无相关性。2.在三株胰腺癌细胞株(PANC-1,MIA-Pa Ca2,Bx PC3)中,检测Lcn2蛋白的内源性表达,结果显示在PANC-1和MIA-Pa Ca2细胞株中Lcn2弱表达,Bx PC3中Lcn2高表达;3.构建pc DNA3.1-Myc/His A和pc DNA3.1-Myc/His A-Lcn2过表达质粒,对PANC-1瞬时转染并检测质粒的质量和Lcn2抗体的特异性。质粒质量和抗体检测良好,构建PANC-1和MIA-Pa Ca2稳定过表达Lcn2细胞系。用CRISPR-Ca S9 Lcn2敲除慢病毒构建Bx PC3稳定敲除Lcn2细胞系。Western blot结果显示Lcn2稳定过表达和敲除细胞系构建成功;4.利用PANC-1过表达Lcn2细胞系和Bx PC3敲除Lcn2细胞系,在m RNA水平检测干性marker,结果显示,与对照组相比,过表达Lcn2后,SOX2,OCT4,CD24,Nanog干性marker降低,敲除Lcn2后SOX2,OCT4,CD24,Nanog增强;5.检测PANC-1稳定过表达Lcn2细胞和Bx PC3敲除Lcn2后干性marker的蛋白表达水平,结果显示过表达Lcn2后,SOX2,Ep CAM,CD44显著降低,CD133无明显差异。敲除Lcn2后,SOX2,Ep CAM,OCT4,Nanog,c-Myc,CD44显著升高;6.分别利用Lcn2稳定过表达和敲除细胞系检测实验组和对照组的成球能力,结果显示与对照组相比,过表达Lcn2组成球数目减少,敲除Lcn2组成球数目增多;7.在裸鼠皮下荷瘤实验中发现,与对照组相比,过表达Lcn2组肿瘤体积和重量减少,敲除Lcn2组肿瘤体积和重量增加;8.利用磷

关键词：脂质运载蛋白-2 胰腺癌细胞干细胞特性 c-Jun 转化生长因子-β1

IGHG1在胰腺癌中表达及其对胰腺癌细胞生物学行为的影响

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中华内分泌外科杂志 2022年第2期16卷 211-215页

作者：周阳贞童伟湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院检验科襄阳441000

目的探讨IgG1重链(IGHG1)编码基因在胰腺癌中的表达及其对胰腺癌细胞(PANC-1)增殖、迁移及侵袭的影响。方法选取2018年6月至2020年12月期间在湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院进行手术治疗的65例胰腺癌患者,手术取癌组织及癌旁正常组... 详细信息

目的探讨IgG1重链(IGHG1)编码基因在胰腺癌中的表达及其对胰腺癌细胞(PANC-1)增殖、迁移及侵袭的影响。方法选取2018年6月至2020年12月期间在湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院进行手术治疗的65例胰腺癌患者,手术取癌组织及癌旁正常组织,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测胰腺癌组织及癌旁组织IGHG1 mRNA表达水平,分析IGHG1表达与胰腺癌临床病理特征的相关性;将PANC-1细胞分为对照组、IGHG1阴性对照组(si-NC)和干扰IGHG1表达组(si-IGHG1),分别检测PANC-1细胞IGHG1 mRNA表达、增殖、迁移、侵袭与凋亡,及上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及Bax、Bcl-2、caspase3蛋白表达。结果胰腺癌组织中IGHG1 mRNA表达水平为(2.47±0.23),显著高于癌旁组织的(1.03±0.12)(P细胞mRNA(1.05±0.14)及蛋白(0.68±0.05)比较,对照组PANC-1细胞IGHG1 mRNA(2.67±0.23)及蛋白(0.97±0.11)表达水平显著升高(P细胞的细胞凋亡率[(5.34%±0.65%)、(5.54%±0.81%)vs(45.62%±2.84%)]、Bax[(0.34±0.05)、(0.32±0.04)vs(1.13±0.12)]、caspase3[(0.43±0.05)、(0.45±0.06)vs(1.22±0.13)]、E-cadherin[(0.78±0.12)、(0.81±0.11)vs(1.34±0.08)]蛋白表达水平显著升高(P细胞存活率[(98.21%±0.56%)、(97.89%±0.67%)vs(46.67%±1.23%)]、迁移[(76.12%±2.72%)、(74.23%±3.41%)vs(28.55%±2.63%)]及侵袭[(85.32%±3.71%)、(83.27%±3.45%)vs(37.58%±2.63%)]能力、N-cadherin[(1.12±0.13)、(1.04±0.11)vs(0.61±0.08)]、Vimentin[(1.03±0.11)、(0.97±0.09)vs(0.49±0.07)]、Bcl-2[(0.87±0.08)、(0.89±0.09)vs(0.62±0.07)]蛋白表达水平显著降低(P胰腺癌中高表达,且与胰腺癌的发生发展相关,干扰IGHG1表达可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT。

关键词： IgG1重链胰腺癌细胞增殖迁移侵袭

siRNA沉默ECT2对人SW1990胰腺癌细胞中时钟基因PER表达的影响

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中国老年学杂志 2022年第14期42卷 3587-3590页

作者：彭宇环洪明昭王洪刘峰中国科学院大学深圳医院药学部广东深圳中国科学院大学深圳医院内分泌科广东深圳

目的研究小RNA干扰上皮细胞转化序列2癌基因(ECT2)对于人SW1990胰腺癌细胞中时钟基因PER1、PER2表达的影响。方法采用高糖培养基培养胰腺癌细胞并采用siRNA-ECT2沉默ECT2表达,在干预24、48、72、96 h后采用CCK-8法检测其增殖能力变化,... 详细信息

目的研究小RNA干扰上皮细胞转化序列2癌基因(ECT2)对于人SW1990胰腺癌细胞中时钟基因PER1、PER2表达的影响。方法采用高糖培养基培养胰腺癌细胞并采用siRNA-ECT2沉默ECT2表达,在干预24、48、72、96 h后采用CCK-8法检测其增殖能力变化,流式细胞术检测各组细胞凋亡率的改变,荧光定量PCR法检测时钟基因PER1、PER2表达的变化。结果siRNA-ECT2沉默ECT2表达后,SW1990胰腺癌细胞抑制率和凋亡率均有不同程度增加,差异有统计学意义(P细胞时钟基因PER1、PER2的表达水平来抑制人SW1990胰腺癌细胞的增殖能力,诱导其凋亡。

关键词： siRNA 胰腺癌细胞 PER 细胞增殖凋亡

老鼠簕生物碱A对胰腺癌L3.6细胞增殖和凋亡的影响

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中国中药杂志 2024年第9期49卷 2355-2363页

作者：梁嘉敏杨思淇胡文浩李旭艳王锂韫粤西特色生物医药工程技术研究中心广东湛江524048 广东省粤西蓝碳资源保护与利用工程技术研究中心广东湛江524048 岭南师范学院红树林研究院广东湛江524048 岭南师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048 广东省粤西海鲜资源可持续利用工程技术研究中心广东湛江524048

探讨老鼠簕生物碱A[4-hydroxy-2(3H)-benzoxazolone,HBOA]对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。0~1.0 mmol·L^(-1) HBOA处理体外培养的胰腺癌L3.6细胞,采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法测定细胞活力并计算半数抑制浓度IC50,筛选药物作用浓度和时间。利用倒置显微镜、吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察细胞形态,活细胞计数、细胞集落形成实验检测细胞增殖、自我更新能力,流式细胞术检测细胞周期进程和细胞凋亡比率,扫描电镜观察细胞凋亡形态,qPCR检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞周期蛋白A(cyclinA1、cyclinA2)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21)mRNA表达,流式细胞术检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)、脂质过氧化物、线粒体膜电位水平,Western blot检测蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路活性。与对照组相比,HBOA处理组细胞活力显著下降,筛选出0.4、0.6 mmol·L^(-1) HBOA干预48 h为后续实验剂量与时间;与对照组相比,0.4、0.6 mmol·L^(-1) HBOA处理组细胞增殖和集落形成能力被抑制,PCNA、cyclinA1、cyclinA2、CDK2 mRNA表达水平显著降低,P21 mRNA表达水平显著升高,细胞周期阻滞于S期,细胞凋亡率显著增加、出现凋亡小体,ROS水平显著升高,脂质过氧化物水平显著升高,线粒体膜电位降低,其中0.6 mmol·L^(-1)处理组显著降低,p-Akt、p-mTOR蛋白水平显著降低。该研究表明HBOA抑制胰腺癌L3.6细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与ROS增加、Akt/mTOR通路活性抑制有关。

关键词：老鼠簕生物碱A 胰腺癌细胞细胞增殖细胞凋亡

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Tif1γ在胰腺癌细胞凋亡中的作用

复旦学报（医学版） 2018年第1期45卷 62-66页

作者：涂彦渊唐文皓王伟艺复旦大学附属华东医院普外科上海200040

目的通过吉西他滨(gemcitabine,GEM)与雷替曲塞(raltitrexed,RTX)分别单纯处理人胰腺癌Capan-1细胞,观察转录中介因子1γ(transcriptional internediary factor 1gamma,Tif1γ)及其信号通路对细胞凋亡的影响。方法人胰腺癌Capan-1细胞经GEM和RTX分别处理36h,用流式细胞术检测细胞凋亡的变化,用Western blot检测Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad4、Bcl2、BAX和Caspase3蛋白质水平的变化。结果流式细胞术检测结果显示,Capan-1细胞经RTX处理后,细胞晚期凋亡(28.7%±5.1%)与死亡(3.7%±0.5%)比例明显高于GEM处理组和对照组(P细胞中的表达,降低Smad4水平,调节凋亡蛋白Bcl/Bax之间的平衡,提高Caspase3水平,诱导细胞凋亡。

关键词：转录中介因子1γ 胰腺癌细胞细胞凋亡雷替曲塞吉西他滨

胰腺癌细胞对基质成纤维细胞的影响及机制研究

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胰腺癌细胞对基质成纤维细胞的影响及机制研究

作者：苏娇娇安徽医科大学

学位级别：硕士

背景近年来研究显示肿瘤的发生和发展与由多种基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成的肿瘤微环境密切相关,其中癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)越来越受到关注。胰腺癌中基质细胞含量丰富,尤其是CAFs,大量研究认... 详细信息

背景近年来研究显示肿瘤的发生和发展与由多种基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成的肿瘤微环境密切相关,其中癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)越来越受到关注。胰腺癌中基质细胞含量丰富,尤其是CAFs,大量研究认为胰腺癌中的CAFs可促进癌细胞的增殖迁移等生物学功能,但对于癌细胞在CAFs的产生过程中所发挥的作用及其机制的研究相对较少。目的1.观察胰腺癌细胞系与正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)共培养、癌细胞中的微囊泡(microvesicles,MVs)刺激NFs两种方式能否诱导NFs活化成CAFs,以及上述刺激对成纤维细胞生物学行为的影响。2.初步探索胰腺癌细胞促进NFs活化成CAFs的发生机制。方法1.原代分离培养野生型C57小鼠胰腺组织中的NFs,将其与胰腺癌细胞系BXPC-3、SW1990进行共培养,运用western方法检测共培养后成纤维细胞中α-SMA、FAP含量,并采用edu方法检测成纤维细胞增殖能力变化。2.采用超速离心法提取上述胰腺癌细胞系中的MVs并分别用其刺激NFs,同样方法检测相应蛋白含量以及成纤维细胞增殖能力。3.采用Trizol试剂盒法提取成纤维细胞中的RNA,后进行逆转录以及qRT-PCR实验检测12种miRNA含量,并采用同样方法提取MVs以及相应量MV-free中上述miRNA含量;4.根据前述结果,在NFs中转染miR-155类似物(即pre-miR-155),同样检测α-SMA、FAP含量以及成纤维细胞增殖能力。5.在胰腺癌细胞株中转染miR-155抑制剂(即anti-miR-155),收集MVs并刺激NFs,然后检测α-SMA、FAP含量以及成纤维细胞增殖能力。6.选取miR-155的下游靶基因TP53inp1,western方法检测共培养前后、MVs刺激前后、在nfs中转染pre-mir-155前后、敲除mir-155的mvs刺激前后的成纤维细胞中tp53inp1蛋白含量变化。7.在nfs中转染tp53inp1基因的干扰rna,同样采用western方法检测干扰前后的成纤维细胞中α-sma、fap含量变化以及其增殖能力变化。结果1.nfs分别与胰腺癌细胞系bxpc-3、sw1990共培养后,其中cafs标志蛋白α-sma含量分别提高了(84.70±0.36)%、(69.11±0.26)%(p细胞中提取的mvs刺激nfs,可见刺激之后的成纤维细胞中α-sma含量分别提高了(61.06±0.12)%,(54.47±0.20)%(p细胞中分别升高了(1.50±0.45)倍、(1.95±0.65)倍(p细胞的mvs以及sw1990细胞的mvs刺激后的成纤维细胞中分别升高了(1.11±0.35)倍,(87.90±0.27)%(p细胞的mvs以及sw1990细胞的mvs中富集量分别是相应mv-free的(7.37±0.66)倍,(7.85±0.62)倍(p细胞中α-sma、fap蛋白含量分别升高了(1.52±0.11)倍,(1.71±0.67)倍(p细胞增殖能力提高了(94.11±0.17)%(p胰腺癌细胞系的mvs刺激nfs后,与阴性对照相比,成纤维细胞中α-sma、fap蛋白含量无明显差别;同样地,成纤维细胞增殖能力在刺激前后无明显变化。6.nfs与bxpc-3,sw1990细胞共培养后,其中tp53inp1蛋白含量分别降低了(49.15±0.09)%,(27.54±0.10)%(p细胞的MVs刺激NFs后,其中TP53inp1蛋白含量分别降低了(78.80±0.12)%,(67.95±0.14)%(P胰腺癌细胞MVs刺激NFs后,该蛋白含量较阴性对照无明显

关键词：胰腺癌细胞成纤维细胞微囊泡 miRNA