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共培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞团的研究

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中华胰腺病杂志 2022年第6期22卷 439-445页

作者：刘鑫岑妍慧贾微杨瑞李森姜娜黄泽萍宁志莹黄威广西中医药大学组织学与胚胎学教研室南宁530200

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与胰岛细胞共培养体系下分化为胰岛样细胞团的可能性。方法无菌条件下从Wistar大鼠的股骨及胫骨分离纯化BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标志物CD_(44)和CD_(90)表达;行成骨方向及成脂肪方向诱导分化... 详细信息

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与胰岛细胞共培养体系下分化为胰岛样细胞团的可能性。方法无菌条件下从Wistar大鼠的股骨及胫骨分离纯化BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标志物CD_(44)和CD_(90)表达;行成骨方向及成脂肪方向诱导分化,采用茜素红染色和油红O染色对诱导后的细胞进行鉴定。分离纯化大鼠胰腺的胰岛细胞,采用双硫腙染色鉴定。使用ELISA法检测胰岛细胞培养液的基础胰岛素水平;分别加入含葡萄糖5.6 mmol/L(低糖)和25.0 mmol/L(高糖)的培养液,ELISA法检测胰岛素释放量。取第5代BMSCs和胰岛细胞,随机分为干细胞单独培养组(干细胞组)、干细胞-胰岛细胞共培养组(共培养组)及胰岛细胞单独培养组(胰岛组),使用倒置相差显微镜观察各组BMSCs的形态学变化;使用ELISA法检测各组基础胰岛素分泌量及高、低葡萄糖刺激后胰岛素释放量;免疫细胞化学染色法检测共培养组诱导形成的胰岛样细胞团的胰岛素蛋白表达;透射电镜观察胰岛样细胞超微结构。结果BMSCs表面标志物CD_(44)和CD_(90)的阳性率分别为99.48%、99.50%,经成骨方向诱导分化形成多个钙结节,经成脂肪方向诱导分化胞质内形成较多脂滴。双硫腙染色显示胰岛中β细胞呈棕红色,每个胰腺可获得胰岛约450个,平均纯度达80%。低糖、高糖组刺激后胰岛的胰岛素释放量分别为(7.105±1.551)mIU/ml和(20.231±1.592)mIU/ml,差异有统计学意义(P细胞开始聚拢并以出芽的方式向上生长成小团块,直至最后形成球形的胰岛样细胞团结构。干细胞组基础胰岛素分泌量胰岛组培养5 d胰岛素分泌量达峰值,随后逐渐下降,13 d时降至最高值的20%;共培养组胰岛素水平在5 d时达到峰值,13 d时仍维持在峰值水平的40%左右,胰岛组与共培养组8、10、13 d基础胰岛素分泌量差异有统计学意义(P值均胰岛组胰岛和共培养组诱导形成的胰岛样细胞团的胰岛素释放量差异无统计学意义。培养14 d后,共培养组胰岛样细胞团内出现大量棕黄色颗粒,超微结构中出现较多分泌颗粒和粗面内质网,呈现较活跃的蛋白质分泌功能。结论BMSCs与胰岛细胞的共培养体系能诱导BMSCs分化为胰岛样细胞团,该细胞团表达胰岛素蛋白,具有较成熟的胰岛素分泌作用。

关键词：骨髓间充质干细胞胰岛共同培养技术细胞分化胰岛样细胞团

诱导人脐带MSCs分化为胰岛样细胞团的促成熟方案及机制

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中国病理生理杂志 2013年第2期29卷 294-301页

作者：苏仲春陈家劲王圳陈志明王跃春暨南大学医学院生理学系广东广州510632

目的:通过各种生物化学制剂的不同组合在体外诱导人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)向胰岛样细胞团(ILCs)分化,筛选出能表达激素原转化酶(PC)1和PC2的促成熟方案。方法:用胶原酶Ⅱ消化、过滤离心和不完全消化传代的方法从人的完整脐带中分... 详细信息

目的:通过各种生物化学制剂的不同组合在体外诱导人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)向胰岛样细胞团(ILCs)分化,筛选出能表达激素原转化酶(PC)1和PC2的促成熟方案。方法:用胶原酶Ⅱ消化、过滤离心和不完全消化传代的方法从人的完整脐带中分离和纯化hUC-MSCs,流式细胞术、RT-PCR和免疫细胞荧光技术检测其干细胞标志物。选用A、B、C 3种方案诱导hUC-MSCs向ILCs分化:方案A为含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μg/L表皮生长因子(EGF)、10 mg/L银杏提取液(GBE)及2%胎牛血清(FCS)的高糖培养基IM-DM;在方案A基础上加入10μg/L尼克酰胺为方案B;在方案B基础上加入10μg/L肝细胞生长因子(HGF)为方案C。在hUC-MSCs诱导前后,通过倒置显微镜观察其形态变化,采用RT-PCR、qPCR和Western blotting检测胰岛相关mRNA和蛋白,特别是PC1和PC2的表达情况。结果:(1)细胞形态、表面相关抗原、干细胞特异基因的表达等情况表明hUC-MSCs可以从人脐带中被成功地分离和纯化;hUC-MSCs普遍表达nestin,轻微表达Isl1。(2)RT-PCR检测发现方案A诱导的ILCs有Glut-2和MafA mRNA表达,方案B诱导的ILCs有Glut-2、MafA、Nkx6.1和PC2mRNA表达,方案C诱导的ILCs有Glut-2、MafA、Nkx6.1、PC2、Ngn3、Pdx1、PC1和胰岛素mRNA表达,提示A、B和C3种方案诱导的细胞有逐渐成熟的趋势。qPCR检测也证实了PC1 mRNA仅在方案C中有表达,PC2 mRNA在方案B和方案C中均有表达,但方案C中PC2 mRNA的表达量显著高于方案B(P胰岛祖细胞或胰岛细胞分化的潜能;(2)方案C中尼克酰胺和HGF可促进hUC-MSCs向ILCs分化,使ILCs表达PC1并上调PC2;相对于方案A和B,方案C是一种促成熟方案。

关键词：脐带间充质干细胞激素原转化酶胰岛样细胞团

胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离、纯化和鉴定

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生物工程学报 2007年第2期23卷 246-251页

作者：乔海赵婷王赟杨春荣效梅窦忠英西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心杨凌7121002 广东海洋大学湛江524088

旨在优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系，为糖尿痛研究和治疗提供种子细胞。采用胶原酶消化法，分离培养出胰岛样细胞团（ICCs），对其进行贴壁培养，从中纯化出上皮样细胞。采用MTT法测定其生长情况并绘制生长曲线。采用免疫组织... 详细信息

旨在优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系，为糖尿痛研究和治疗提供种子细胞。采用胶原酶消化法，分离培养出胰岛样细胞团（ICCs），对其进行贴壁培养，从中纯化出上皮样细胞。采用MTT法测定其生长情况并绘制生长曲线。采用免疫组织化学染色检测分离得到细胞的PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nesfin、Glut2、Vimenfin、Insulin表达情况。应用流式细胞仪检测其表面标志。由分离培养的ICCs成功纯化出上皮样细胞；传40代，每代冻存106～10s个细胞；生长曲线显示其传代第3天进入对数生长期，第5天进入平台期；免疫组织化学染色显示其表达PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin；不表达Insulin；流式细胞仪分析表明其表达CD29、CD44、CD166，不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。由胎儿胰腺能分离出具有自我更新能力的上皮样细胞，为导管来源，具干细胞特性。

关键词：胎儿胰腺胰腺干细胞胰岛样细胞团上皮样细胞

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诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

中国组织工程研究与临床康复 2010年第27期14卷 5001-5005页

作者：周静李进林戈卢光琇中南大学生殖与干细胞研究所湖南省长沙市410078 国家干细胞工程研究中心湖南省长沙市410078

背景:随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立,对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。目的:研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。方法:自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株,运... 详细信息

背景:随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立,对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。目的:研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。方法:自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株,运用基于胰腺体内发育规律的改良5阶段诱导法诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团,加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分5阶段序贯培养。结果与结论:终末分化细胞光镜下呈团状聚集,RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征,是未来治疗1型糖尿病的可用材料。

关键词：人类孤雌胚胎干细胞胰岛样细胞团诱导分化糖尿病干细胞

胎鼠胰腺干细胞体内移植向胰岛样细胞团的分化

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第14期13卷 2691-2695页

作者：张悦张育森余小舫周汉新李富荣深圳市人民医院暨南大学第二临床医学院普通外科广东省深圳市518020 深圳市福田区人民医院肝胆甲乳外科广东省深圳市518020 深圳市人民医院暨南大学第二临床医学院临床研究中心广东省深圳市518020

背景:由于干细胞的转分化受细胞外基质和基因程序的调控,因此在体外很难模拟体内干细胞巢的微环境而使干细胞定向分化,或许干细胞原位移植是可行方法之一。目的:探讨胎鼠胰腺干细胞在糖尿病鼠体内不同部位移植后分化为胰岛细胞团的可能... 详细信息

背景:由于干细胞的转分化受细胞外基质和基因程序的调控,因此在体外很难模拟体内干细胞巢的微环境而使干细胞定向分化,或许干细胞原位移植是可行方法之一。目的:探讨胎鼠胰腺干细胞在糖尿病鼠体内不同部位移植后分化为胰岛细胞团的可能性。设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2006-03/2007-04在深圳市人民医院中心实验室完成。材料:16d龄SD胎鼠12只,10周龄200～250g的SD雌鼠50只,均由广东省实验动物中心提供。方法:分离纯化胎鼠胰腺干细胞,经荧光原位杂交检测为雄性的第5代胎鼠胰腺干细胞用于体内移植。50只SD雌鼠取10只作为正常对照组,余40只通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,造模后分为4组:胰腺实质内移植组在胰腺实质内多点注射1×106个雄性胎鼠胰腺干细胞,肝内移植组行门静脉穿刺注射等量细胞悬液,肾包膜下移植组于左肾包膜下注射等量细胞悬液,模型对照组胰腺实质内多点注射相同体积的PBS液,10只/组,培养8周。主要观察指标:定期监测大鼠血糖及血浆胰岛素水平,观察胰腺、肝脏及肾脏组织病理学变化。结果:雄性胎鼠胰腺干细胞培养传3代后,巢蛋白阳性细胞率为74.1%。胰腺实质内移植组在移植后第3周血糖开始下降,血浆胰岛素水平逐渐升高;第5周血糖降至正常水平并维持,血浆胰岛素达到正常水平,病理学观察在胰腺内可见外源性胰岛样细胞团,胰岛素免疫组化染色呈阳性,巢蛋白免疫组化染色呈强阳性,荧光原位杂交检测Y染色体呈阳性。肝内移植组、肾包膜下移植组大鼠仍维持高血糖状态,相应组织内均未见外源性细胞团形成。结论:分离纯化的胎鼠胰腺干细胞在胰腺内原位移植后,于体内可转分化为胰岛样细胞团,并使血糖降至正常水平。

关键词：胰腺干细胞胎鼠胰岛样细胞团分化降血糖

白藜芦醇对小鼠胰岛样细胞团的抗移植排斥作用及其IL-2、IL-10表达的影响

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解放军医学杂志 2012年第6期37卷 606-609页

作者：马丽张薇华周光纪吴洪福蔡波徐明锋东莞广东医学院医学检验学院广东523808 东莞广东医学院医学检验学院基础医学院广东523808

目的探讨白藜芦醇(Res)对小鼠胰岛样细胞团(ICCs)的抗移植排斥作用及相关细胞因子表达的影响。方法采用BALB/c小鼠胚胎干细胞系B/c-ES在体外定向诱导形成ICCs,DIPA标记后移植至近交系昆明小鼠皮下。将小鼠随机分为环孢素A(CsA)组(阳性对... 详细信息

目的探讨白藜芦醇(Res)对小鼠胰岛样细胞团(ICCs)的抗移植排斥作用及相关细胞因子表达的影响。方法采用BALB/c小鼠胚胎干细胞系B/c-ES在体外定向诱导形成ICCs,DIPA标记后移植至近交系昆明小鼠皮下。将小鼠随机分为环孢素A(CsA)组(阳性对照)、Res组、CsA+Res组和PBS组(阴性对照),每组6只,移植前3d开始给药(CsA及Res剂量均为50mg/kg),每天1次直至取材日。分别于ICCs移植后第5天和第10天取移植物常规病理切片,观察免疫排斥情况,部分切片行免疫组化染色,检测IL-2、IL-10表达情况。结果移植后第5天各组均出现不同程度的移植排斥反应,除不用免疫抑制剂的PBS组外,其余各组均有移植细胞存活;Res组和CsA+Res组IL-2表达率分别为17.5%及14.5%,明显低于CsA组(59.5%,P0.05);Res组和CsA+Res组IL-10阳性表达率(分别为23%和48%)明显高于CsA组(12.5%,P细胞存活,其余各组未见移植细胞;CsA组IL-2和IL-10表达明显减弱,其余各组几乎不表达IL-2和IL-10。结论 Res可抑制小鼠ICCs移植后的急性排斥反应,其机制可能与下调IL-2表达及上调IL-10表达有关。

关键词：白藜芦醇胰岛样细胞团移植排斥白细胞介素2 白细胞介素10

PuraMatrix水凝胶三维培养对人脐带MSCs向胰岛样细胞团分化的影响

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PuraMatrix水凝胶三维培养对人脐带MSCs向胰岛样细胞团分化的影响

作者：苏仲春暨南大学

学位级别：硕士

目的：在二维培养条件下用单纯生物学制剂诱导人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向胰岛样细胞团（ILCs）分化，筛选出能表达激素原转换酶PC1和PC2的最佳诱导方案;在PuraMatrix (PM)水凝胶中对hUC-MSCs进行三维培养，找到最佳浓度和最佳作... 详细信息

目的：在二维培养条件下用单纯生物学制剂诱导人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向胰岛样细胞团（ILCs）分化，筛选出能表达激素原转换酶PC1和PC2的最佳诱导方案;在PuraMatrix (PM)水凝胶中对hUC-MSCs进行三维培养，找到最佳浓度和最佳作用时间点后，用上述筛选出的最佳方案进行诱导，探讨PM三维培养对hUC-MSCs向ILCs分化的影响。方法：从人的完整脐带中分离和纯化hUC-MSCs，流式细胞仪、RT-PCR和免疫细胞荧光染色技术检测其干细胞标志进行鉴定。在二维培养条件下选用A、B、C三种方案诱导hUC-MSCs向ILCs分化，在诱导前后采用qPCR和Western blot检测PC1和PC2的表达情况以确定最佳诱导方案。将hUC-MSCs接种于经过一定预处理的不同浓度的PM中进行三维培养，通过观察细胞形态、检测细胞活性和干细胞标志基因的表达情况来确定最佳浓度和最佳作用时间点，再用上述筛选出的最佳方案诱导在PM中生长的hUC-MSCs向ILCs分化，检测pc1、pc2和insulin等基因的表达情况。结果： hUC-MSCs普遍表达Nestin，轻微表达isl1。A、B、C三种方案诱导的ILCs有逐渐成熟的趋势;qPCR及Western blot检测表明PC1仅在方案C中有表达，而PC2在方案B和方案C中均有表达，但后者显著高于前者（P团状生长，且表达一定水平的nestin及少量pc1,pc2和insulin;经方案C诱导后，0.5%PM中的hUC-MSCs的pc1,pc2和insulin表达量均高于二维培养环境下诱导的表达量(P 团，表达少量胰岛发育相关基因;用上述方案C诱导后形成ILCs，胰岛相关基因表达增多，表明0.5%PM三维培养可促进hUC-MSCs向ILCs分化。

关键词：纳米水凝胶胰岛样细胞团间充质干细胞脐带

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体外诱导胰腺干细胞向胰岛样细胞团的分化

中国组织工程研究 2012年第10期16卷 1799-1802页

作者：岑妍慧谢小薰陈维平何国珍黄波郭文文肖燕子广西医科大学组织学与胚胎学教研室广西壮族自治区南宁市530021

背景:目前由于胰岛来源匮乏,使得胰岛细胞移植治疗糖尿病无法满足临床需求,故体外将胰腺干细胞诱导分化为胰岛成为研究焦点。目的:于体外将小鼠胰腺干细胞诱导成胰岛样细胞团并对其进行相关检测,探寻一种胰腺干细胞体外诱导分化成胰岛... 详细信息

背景:目前由于胰岛来源匮乏,使得胰岛细胞移植治疗糖尿病无法满足临床需求,故体外将胰腺干细胞诱导分化为胰岛成为研究焦点。目的:于体外将小鼠胰腺干细胞诱导成胰岛样细胞团并对其进行相关检测,探寻一种胰腺干细胞体外诱导分化成胰岛及鉴定的技术和方法。方法:体外获得纯化的小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂对其进行成胰岛方向的诱导分化,并对诱导形成的胰岛样细胞团进行形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR和Western blot检测。结果与结论:实验通过细胞形态学和细胞生长特性的观察以及免疫细胞化学染色证实体外成功获得了小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂将其诱导成胰岛样结构,呈球形,以较细长的蒂部与瓶底连接,双硫腙染色将其染成铁红色。RT-PCR和Western blot法可分别检测到胰岛样细胞团的胰岛素mRNA和胰岛素蛋白。结果证实小鼠胰腺干细胞可体外诱导分化成含β细胞的胰岛样细胞团。

关键词：胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团干细胞培养小鼠

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人胎儿胰岛样细胞团源胰腺干细胞分离和鉴定

人胎儿胰岛样细胞团源胰腺干细胞分离和鉴定

作者：乔海西北农林科技大学

学位级别：硕士

糖尿病作为严重危害人类健康的三大主要疾病之一,传统的药物及胰岛素替代疗法不能从根本上医治该病。近年来,随着成人胰岛移植的成功和对免疫抑制方案的改进,移植胰岛细胞已成为治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途径。但是,由于每个临床... 详细信息

糖尿病作为严重危害人类健康的三大主要疾病之一,传统的药物及胰岛素替代疗法不能从根本上医治该病。近年来,随着成人胰岛移植的成功和对免疫抑制方案的改进,移植胰岛细胞已成为治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途径。但是,由于每个临床胰岛移植受体通常需要2～4个新鲜尸体胰腺,胰岛供体短缺的矛盾阻碍了胰岛细胞治疗糖尿病技术的推广和应用。胰腺干细胞（Pancreatic stem cells）是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞,能自我更新,具有多分化潜能,其特点是在自然分化过程中首先分化为胰腺组织的各种细胞。体外分离、克隆人类胰腺干细胞作为种子细胞,并定向诱导其分化为功能性胰岛细胞移植治疗糖尿病,是解决胰岛供体短缺的有效途径。本试验从人胎儿胰腺分离胰岛样细胞团（Islet-like cell clusters, ICCs）,从中纯化出干细胞并进行扩增培养,对其表达特性及诱导分化等方面进行研究,从而优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系,为糖尿病研究和治疗提供种子细胞,为人胎儿胰腺干细胞的临床应用提供基础资料。本实验无菌取3-5月龄人胎儿胰腺,剪碎后用Ⅳ型胶原酶消化,RPMI1640+10%NBS培养获得胰岛样细胞团;挑出细胞团接种于明胶包被的玻璃皿中,低糖DMEM +10%NBS+10ng/mL EGF进行贴壁培养,当细胞长成单层后传代,以RPMI1640+10%NBS培养;传代4d后可见许多呈克隆样生长的上皮样细胞片,挑出用RPMI1640 +10%NBS扩增培养,获得纯化的上皮样细胞,现传45代,每代冻存106-108个细胞。随机取生长状态良好的第13代细胞,接种到96孔板中,采用MTT法测定并绘制细胞生长曲线。生长曲线显示,用20%血清培养时,其传代第三天进入对数生长期,第五天达到平台期,在10%血清的培养液中生长则相对较慢。将第6代、11代、21代细胞分别接种于96孔板中,培养三天后4%多聚甲醛（pH7.4）固定后进行免疫组织化学染色。细胞表达PDX-1、CK-19、PCNA、CK-7、CK-3、E-钙粘素、Nestin、Glucagon、Glut2、Vimentin、;不表达Insulin、Somatostatin、IAPP（Islet amyloid polypeptide）。提取第39代细胞总RNA进行RT-PCR分析,细胞也表达PDX-1,CK-7,CK-19,Nestin,胰高血糖素,β-半乳糖苷酶,Vimentin,Glut2,不表达NGN3,胰岛素,生长抑素,胰多肽,葡萄糖激酶等。悬浮培养时CK-19表达仍然比较强,但nestin表达明显减弱。将培养的第5代细胞上流式细胞仪检测,细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。第39代细胞仍稳定表达CD29、CD44、CD166;稳定不表达CD54、CD90、CD11a。而CD14、CD34、CD45、CD105、CD117、CD 71、CD34、CD45的表达不稳定。将第39代HFIECs用10μg/L 10mmol/NIC, 10μg/L bFGF, 10μg/L HGF诱导培养14d,可形成DTZ阳性的细胞团。胰岛素释放量在第20d达到最大,证明诱导细胞在20d成熟程度达到最高。本试验表明从人胎儿胰腺分离培养的胰岛样细胞团中能纯化出具有自我更新能力的上皮样细胞,其来源于胰腺导管,具胰腺干细胞特性。该细胞有望成为研究治疗糖尿病的种子细胞。

关键词：人胎儿胰腺胰腺干细胞胰岛样细胞团上皮样细胞诱导