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与BBWV 2胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

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植物病理学报 2005年第S1期35卷 188-189页

作者：王卫兵洪健周雪平浙江大学生物技术研究所杭州310029

植物病毒侵入寄主后在细胞中复制增殖,通过胞间连丝短距离胞间运动和维管束长距离转运到达植株各个部位,形成系统性侵染。以烟草花叶病毒(TMV)为代表的运动蛋白MP/RNA结合体形式和以豇豆花叶病毒(CPMV)为代表的管状结构形式是2种最主要... 详细信息

植物病毒侵入寄主后在细胞中复制增殖,通过胞间连丝短距离胞间运动和维管束长距离转运到达植株各个部位,形成系统性侵染。以烟草花叶病毒(TMV)为代表的运动蛋白MP/RNA结合体形式和以豇豆花叶病毒(CPMV)为代表的管状结构形式是2种最主要的胞间运动形式。有关蚕豆萎焉病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBMV 2)所在蚕豆病毒属(Fabavirus)的胞间运动机理迄今尚不明了。对BBWV 2中国分离物B935侵染的豌豆和蚕豆进行了详细的超微结构观察,得到了一些涉及病毒胞间运动和长距离转运的超微结构证据。

关键词：胞间运动蚕豆豌豆佛豆毕豆寄主 BBWV 2 管状体病毒样颗粒分离物胞间连丝

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植物病毒胞间运动分子生物学研究进展

中国生物工程杂志 2003年第2期23卷 52-58页

作者：郑文光王晓武高必达中国农科院蔬菜花卉研究所北京100081 湖南农业大学植物保护系长沙410128

综述了运动蛋白的分类、病毒运动的两种形态、运动蛋白介导植物病毒细胞间运动的机制及其磷酸化调节 ,同时简要介绍了互补试验与删除试验在研究运动蛋白功能上的应用。

关键词：植物病毒胞间运动分子生物学研究进展运动蛋白胞间连丝果胶甲酯酶

植物病毒胞间运动的分子生物学和细胞学研究进展

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植物生理学通讯 1995年第6期31卷 463-469页

作者：李毅陈章良北京大学生命科学学院蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室北京100871

本文从植物细胞胞间连丝解剖结构、植物病毒运动蛋白、运动蛋白与胞间连丝和病毒核酸的相互作用，植物病毒在细胞间运动形式及其调节等方面综述了病毒在植物细胞间（cell－to－cell）运动的分子生物学和细胞生物学进展。

关键词：植物病理植物病毒胞间运动分子生物学细胞学

辣椒脉黄病毒P4蛋白介导病毒胞间运动功能研究

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辣椒脉黄病毒P4蛋白介导病毒胞间运动功能研究

作者：李桑桑湖南大学

学位级别：硕士

植物病毒侵染寄主,需要克服寄主细胞胞间连丝（Plasmodesmata,PD）的限制,进行胞间运动,从而系统侵染寄主。为了克服PD屏障,植物病毒通过编码运动蛋白来介导病毒通过PD。辣椒脉黄病毒（Pepper vein yellows virus,Pe VYV）是正义单链RN... 详细信息

植物病毒侵染寄主,需要克服寄主细胞胞间连丝（Plasmodesmata,PD）的限制,进行胞间运动,从而系统侵染寄主。为了克服PD屏障,植物病毒通过编码运动蛋白来介导病毒通过PD。辣椒脉黄病毒（Pepper vein yellows virus,Pe VYV）是正义单链RNA病毒,属于黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）。该病毒能够通过蚜虫和嫁接进行传毒,受侵染寄主会出现叶脉黄化、新叶簇生等症状,严重影响辣椒等茄科作物的产量和品质。研究Pe VYV编码的运动蛋白及其功能,可为分析Pe VYV的致病性提供科学依据,也可为科学评估Pe VYV对茄科经济作物的潜在威胁提供理论基础。辣椒脉黄病毒ORF4编码的一个大小为17.5 KDa的蛋白,P4蛋白的结构域分析表明,在117-138 aa区段有一个跨膜结构域。P4蛋白亚细胞定位结果表明,P4蛋白,与PD的标志蛋白PDLP8共定位,形成不连续的黄色荧光点。删去或A替代P4蛋白的117-138 aa跨膜结构域,?P4 117-138蛋白（缺失突变子）和?P4 AAA117-138（A替代突变子）虽定位于细胞膜,但两个突变子均不能与PDLP8蛋白共定位。研究结果表明,P4蛋白的117-138 aa跨膜结构域是P4蛋白定位于PD的关键结构域。P4蛋白介导植物病毒胞间运动研究表明,P4蛋白能够互补运动蛋白缺失突变黄瓜花叶病毒（CMV?3a）进行胞间运动,92%的病毒运动到邻近细胞;?P4 AAA117-138驱动仅16%CMV?3a侵染邻近细胞;而?P4 117-138蛋白完全失去互补CMV?3a进行胞间运动的能力。利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）结合液相色谱-质谱/质谱（Liquid-chromatography Mass/Mass,LC-MS/MS）,筛选鉴定与P4蛋白及其跨膜结构域突变子互作的寄主蛋白。筛选到与P4蛋白可能直接互作的寄主蛋白16个,主要参与内质网结合（ER binding）、能量代谢、丝裂原活化激酶途径、自噬体途径、DNA甲基化途径等;两个突变子可能直接互作的寄主蛋白14个,不能与丝裂原活化激酶途径、自噬体途径的2个蛋白互作。P4蛋白不但介导病毒胞间运动,还可能参与调控病毒复制和寄主抗性等多重功能。

关键词：辣椒脉黄病毒 P4蛋白胞间连丝运动蛋白胞间运动

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植物转录因子的胞间运动

细胞生物学杂志 2007年第1期29卷 56-60页

作者：王建国宋喜娥李润植山西农业大学农业生物工程研究中心太谷030801

植物体的组织和器官由多细胞组成,细胞之间的通信对植物体的生长发育必不可少。转录因子作为一类特殊的蛋白质分子不仅在转录水平上参与植物生长发育的调控,而且新近研究发现,转录因子的胞间运动是细胞之间通信方式之一,具有重要的功能... 详细信息

植物体的组织和器官由多细胞组成,细胞之间的通信对植物体的生长发育必不可少。转录因子作为一类特殊的蛋白质分子不仅在转录水平上参与植物生长发育的调控,而且新近研究发现,转录因子的胞间运动是细胞之间通信方式之一,具有重要的功能。对转录因子胞间运动的发现过程、转录因子胞间运动的机制及其通道进行了论述。转录因子的胞间运动有基于扩散作用的非目标性转运和具有目标性的主动转运两种模式。转录因子胞间运动具有明显的组织特异性和方向性。分析了影响转录因子胞间运动的因素,讨论了转录因子胞间运动的功能以及转录因子胞间运动所参与的植物生长发育及形态建成的调控。

关键词：转录因子胞间运动信号转导植物生长发育调控

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小麦珠心组织中原生质细胞间运动机理的探讨

中国科学(B辑化学生物学农学医学地学) 1985年第6期 527-536页

作者：张伟成严文梅娄成后中国科学院上海植物生理研究所北京农业大学

在小麦未成熟籽粒的珠心表皮层活体制片中,频繁地出现着原生质在细胞间运动的现象。通过电镜观察、结合生理处理,对运动的机理进行了探讨;论证了珠心表层中的原生质胞间运动,是原生质经剧烈的收缩、伸展,穿越扩大的胞间连丝通道而进行... 详细信息

在小麦未成熟籽粒的珠心表皮层活体制片中,频繁地出现着原生质在细胞间运动的现象。通过电镜观察、结合生理处理,对运动的机理进行了探讨;论证了珠心表层中的原生质胞间运动,是原生质经剧烈的收缩、伸展,穿越扩大的胞间连丝通道而进行的。胞间通道附近可检察到活跃的酸性磷酸酶活动,它可能参与了胞间连丝内部结构的瓦解和孔径的扩大。低温(5—6℃)、KCN(0.05M)和松胞素B(20μg/ml)处理可对运动予以可逆性的抑制。穿壁的原生质组份上显示活跃的三磷酸腺苷酶活性,表明运动的能量来自ATP,原生质在细胞间的主动迁移与微丝活性直接有关。

关键词：原生质珠心胞间连丝小麦麦类作物胞间运动细胞运动机理

番茄斑萎病毒运动蛋白NSm在植物细胞和昆虫细胞内的定位

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微生物学报 2012年第8期52卷 962-968页

作者：尚卫娜孟春梅郑宽瑜丁铭张仲凯洪健周雪平浙江大学生物技术研究所杭州310058 浙江大学农生环测试中心杭州310058 浙江大学云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所昆明650223

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm的细胞定位。【方法】将NSm基因融合GFP后构建到植物双元表达载体pCHF3中,农杆菌介导浸润本氏烟叶片,同时将融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系转染... 详细信息

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm的细胞定位。【方法】将NSm基因融合GFP后构建到植物双元表达载体pCHF3中,农杆菌介导浸润本氏烟叶片,同时将融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞。在激光共聚焦显微镜下观察NSm-GFP在烟草表皮细胞和昆虫Tn细胞中的定位情况。【结果】观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同,NSm-GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散,能够在细胞壁边缘定位,并且在胞间连丝处呈不连续的绿色荧光小点,偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间;NSm蛋白在昆虫Tn细胞表面产生数量众多的管状结构并向外延伸。【结论】研究结果表明NSm能够特异性定位在植物细胞的胞间连丝处,并能在昆虫Tn细胞内表达,在细胞表面产生运动蛋白小管。

关键词：番茄斑萎病毒 NSm 细胞定位胞间运动 Tn细胞

苹果褪绿叶斑病毒运动蛋白与梨蛋白的互作及生物学功能研究

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苹果褪绿叶斑病毒运动蛋白与梨蛋白的互作及生物学功能研究

作者：朱德娟华中农业大学

学位级别：硕士

苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是侵染梨和苹果等仁果类果树的重要病毒之一,在感病的梨和苹果植株叶片上引起褪绿斑。ACLSV是芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)纤毛病毒属(Tric... 详细信息

苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是侵染梨和苹果等仁果类果树的重要病毒之一,在感病的梨和苹果植株叶片上引起褪绿斑。ACLSV是芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)纤毛病毒属(Trichovirus)的典型种。该病毒的基因组为7.5-8.0 kb的正义单链RNA(positivesense single-stranded RNA,+ss RNA),包含3个部分重叠的开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF2编码属于“30 K”超家族的运动蛋白(movement protein,MP)。鉴定与病毒互作的寄主蛋白,可为深入了解病毒生物学特性及作用靶标等提供重要信息。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system,Y2H)方法筛选到与ACLSV MP互作的梨蛋白,并进一步验证互作结果,分析互作特点。主要研究结果如下:(1)以p GBKT7-MP为诱饵载体,从红香酥梨cDNA文库中初步筛选到了39种与MP互作的梨蛋白,主要包括与泛素化、磷酸化、光合作用、糖代谢、嘌呤代谢、氨基酸的生物合成、次生代谢物的生物合成、蛋白质的加工及分解代谢、信号转导及转录调控等相关蛋白。根据候选蛋白的生物信息学分析结果,选择了12个梨蛋白,经酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补试验(LCA)进一步分析,确认泛素连接酶(probable BOI-related E3 ubiquitin-protein ligase 2,E3)、蛋白质磷酸化酶(probable protein phosphatase 2C 47,PP2C)、细胞周期蛋白(cyclinP3-1-like,Cyc)、6-磷酸山梨醇脱氢酶(NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,Nd S6PDH)、索马甜类蛋白(thaumatin-like protein 1b,TLP)、分支酸变位酶(chorismate mutase 1,CM)、叶绿素ab结合蛋白(chlorophyll a-b binding protein CP24 10A,CP24)和(chlorophyll a-b binding protein 6,LHCB6)可以与MP互作,且Bi FC试验表明互作位置均为胞间连丝(plasmodesmata,PD)。(2)对MP及互作蛋白进行了亚细胞定位分析,发现MP定位于PD;E3定位在细胞核和PD;PP2C、Nd S6PDH、Cyc和TLP定位在细胞核和细胞膜,其中PP2C和Nd S6PDH还定位在内质网(endoplasmic reticulum,ER);CM、CP24和LHCB6均以不均匀的颗粒状定位在叶绿体。除LHCB6外,这些梨蛋白均与MP在PD处共定位。同时鉴定明确MP的PD定位信号位于N端的11-201 aa,MP可自身互作的关键区域为19-312 aa,且MP与梨蛋白CP24和Cyc互作的关键氨基酸序列为11-201 aa。(3)初步研究了MP与这些互作蛋白的生物学功能,发现MP与来自本氏烟的蛋白NbCP24、NbLHCB6和NbCyc均互作。基于病毒诱导的基因沉默下调本氏烟中基因NbLHCB6和NbCyc表达,未诱导明显的表型变化,而基因NbCP24下调表达可引起烟草叶片褪绿和花叶。综上所述,本研究鉴定到与ACLSV的MP互作的8种梨蛋白,明确了互作蛋白的亚细胞位点及潜在生物学功能。

关键词：苹果褪绿叶斑病毒梨运动蛋白蛋白互作酵母双杂交胞间运动

番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒细胞病理学及其运动蛋白的研究

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番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒细胞病理学及其运动蛋白的研究

作者：尚卫娜浙江大学

学位级别：硕士

番茄斑萎病毒属（Tospo virus）侵染植物,寄主范围广泛,危害严重,近年来在我国陆续有许多新种或新分离物报道。其中番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）是2008年报道的该属新种,与该属代表种番茄斑萎病毒（Tomato spotte... 详细信息

番茄斑萎病毒属（Tospo virus）侵染植物,寄主范围广泛,危害严重,近年来在我国陆续有许多新种或新分离物报道。其中番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）是2008年报道的该属新种,与该属代表种番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）基因组结构相似,但是同源性较低。为了研究大颗粒病毒的胞间运动机理,我们对两种病毒的细胞病理学及胞间运动机理开展了研究。通过透射电子显微镜观察常温固定包埋和高压冷冻固定包埋两种方法处理的TSWV、TZSV感病植物叶片发现,两种病毒的形态及细胞病理变化大致相似,但也存在差异。与TSWV相比,TZSV对细胞器的影响更大。TZSV侵染的叶片在叶绿体处也能像TSWV一样产生囊泡,部分叶绿体的囊泡几乎占据整个叶绿体,片层结构破坏更加严重。在线粒体中也能够产生与叶绿体内相似的囊泡结构,这种现象在TSWV侵染的叶片内难以观察到,相比之下,TSWV侵染的叶片线粒体保存的更加完好。该结果也可以在一定程度上说明为什么在田间状态下,TZSV对作物造成的危害更加严重。为了研究TSWV、TZSV运动蛋白NSm的细胞定位。将两种病毒的NSm基因融合GFP后构建到植物双元表达载体pCHF3中,农杆菌介导浸润本氏烟叶片,同时将融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞。在激光共聚焦显微镜下观察NSm-GFP在烟草表皮细胞中和昆虫Tn细胞中的定位情况。观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同,TSWV、TZSV NSm-GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散,能够在细胞壁边缘定位,并且在胞间连丝处呈不连续的绿色荧光小点,偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间。TSWV的GFP-NSm融合蛋白能够在昆虫Tn细胞表面诱导产生数量众多的管状结构并向外延伸,长度远长于在胞间连丝处形成的NSm蛋白小管。TZSV的GFP-NSm融合蛋白也能在昆虫Tn细胞内表达,但是不能产生管状结构,主要分布在细胞质内,成团块状聚集;该蛋白也能在细胞核表面定位,呈网刺状,围绕着细胞核形成圆环形。为了进一步直观研究两种病毒的运动蛋白在亚细胞结构内的确切定位分布情况,利用大肠杆菌系统pET系列载体表达了TSWV、TZSV的NSm基因,以Ni2+-NTA agarose亲和柱分别纯化了这两个蛋白与His组氨酸的融合蛋白并制备了相应的多克隆抗体。其中,TSWV NSm蛋白制备的多克隆抗血清进行Western blot结果显示,抗血清对该蛋白具有特异性反应,可用于进一步免疫胶体金标记分析。而TZSV Nsm蛋白的抗血清正在制备过程中,结果暂不显示。

关键词：番茄斑萎病毒番茄环纹斑点病毒 NSm 细胞定位胞间运动 Tn细胞