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食品与生物技术学报 2019年第2期38卷 72-80页

作者：陈修来王元彩董晓翔罗秋玲刘佳刘立明食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)及C4-二羧酸转运蛋白(Afmae),成功构建了L-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达Af... 详细信息

为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)及C4-二羧酸转运蛋白(Afmae),成功构建了L-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达Afpyc时,其丙酮酸浓度降低了42%,但不能积累L-苹果酸;(2)当共表达Afpyc和Afmdh时,菌株W005积累了1.93 g/L的L-苹果酸,与对照菌株W004相比细胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%;(3)当共表达Afpyc、Afmdh和Afmae时,菌株W006的L-苹果酸产量提高了21.2%,达到2.34 g/L;4)通过提高接种量至初始OD_(600)=2,L-苹果酸的产量提高到3.28 g/L。通过在酿酒酵母中过量表达黄曲霉胞质还原路径的关键基因,使得工程菌能够积累L-苹果酸,为目标产物的高效积累提供了一种可借鉴的思路。

关键词：酿酒酵母胞质还原路径 L-苹果酸代谢工程

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代谢工程改造酿酒酵母rTCA路径和C4-二羧酸转运系统生产L-苹果酸

代谢工程改造酿酒酵母rTCA路径和C4-二羧酸转运系统生产L-苹果酸

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作者：王元彩江南大学

学位级别：硕士

本论文以一株高产丙酮酸的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TAM为研究对象,运用代谢工程策略,从构建L-苹果酸的胞质还原路径(rTCA路径)、增强L-苹果酸的外转运、解除C4-二羧酸转运蛋白的泛素化修饰、优化代谢路径的平衡等四个方面调... 详细信息

本论文以一株高产丙酮酸的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TAM为研究对象,运用代谢工程策略,从构建L-苹果酸的胞质还原路径(rTCA路径)、增强L-苹果酸的外转运、解除C4-二羧酸转运蛋白的泛素化修饰、优化代谢路径的平衡等四个方面调控碳代谢流,从而实现L-苹果酸的高效生产。主要研究结果如下:1.研究了Afpyc、Afmdh、Ropyc和Romdh基因组合表达对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响。通过敲除酿酒酵母TAM的色氨酸(trp1)及组氨酸(his3)基因,构建了一株三重营养缺陷型(尿嘧啶、色氨酸、组氨酸)菌株thTAM。以此为出发菌株导入黄曲霉rTCA路径的关键基因Afpyc、Afmdh,重组菌株W1001的L-苹果酸积累量为1.85 g·L-1,但共表达米根霉rTCA路径的关键基因Ropyc、Romdh的重组菌株W2001及共表达基因Ropyc、Afmdh的重组菌株W3001均不能积累L-苹果酸。而共表达基因Afpyc和Romdh的重组菌株W4001的L-苹果酸产量由1.85 g·L-1提高到2.5 g·L-1。2.研究了外转运系统的强化对L-苹果酸生产的影响。菌株W4001的胞内L-苹果酸浓度达到9.52 mg·gDCW-1,较对照组W0001提高了2.28倍。为提高L-苹果酸的外转运水平,过量表达源于大肠杆菌(DcuC)、黄曲霉(Afmae)和栗酒裂殖酵母(Spmae)的C4-二羧酸转运蛋白,其中基因DcuC及Afmae的表达使得L-苹果酸的产量分别下降37.33%和41.78%,而Spmae的过量表达使得L-苹果酸的产量由2.5 g·L-1提高到5.15 g·L-1。为了进一步提高L-苹果酸的产量,解除转运蛋白Spmae的泛素化修饰,将Spmae的三个高置信度泛素化位点进行定点突变(K395R、K409R和K416R)后过量表达,其L-苹果酸产量提高到10.5 g·L-1。3.研究了rTCA路径中基因的表达强度对L-苹果酸积累的影响。结果发现仅有两个菌株的L-苹果酸积累量高于对照组W4401,其中菌株W4409的L-苹果酸产量最高达到13.2 g·L-1,生产强度为0.16 g·L-1·h-1,DCW为2.42 g·L-1,比W4401分别提高了26.2%、33.3%和3.0%。分析原因,W4409L-苹果酸高产的原因主要由于Afpyc的低表达导致进入TCA循环用于菌体生长的碳流增加,菌体浓度提高。同时Spmae*的高表达将胞质中的L-苹果酸及时的转运出细胞外,提高了单位细胞生产L-苹果酸的能力。4.研究了接种量和硫胺素添加量对L-苹果酸积累的影响。当初始接种细胞干重为2.31 g·L-1时,其细胞干重、L-苹果酸产量、苹果酸生产强度、单位葡萄糖生产L-苹果酸的能力分别为5.27 g·L-1、25.14 g·L-1、0.26 g·L-1·h-1和0.32 mo L·mo L-1。当硫胺素浓度为1.6 mg·L-1时,L-苹果酸产量提高到30.28 g·L-1,生产强度为0.30 g·L-1·h-1,且丙酮酸产量(57.74 g·L-1)比对照组菌株(43.25 g·L-1)降低了33.5%。

关键词：酿酒酵母 L-苹果酸胞质还原路径 C4-二羧酸转运蛋白泛素化

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