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胃肠道间质瘤60例中c-kit和PDGFRA基因突变的检测

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北京大学学报（医学版） 2005年第3期37卷 320-324页

作者：贺慧颖项一宁李燕钟镐镐吴秉铨郑杰北京大学基础医学院病理学系北京100083 贵阳医学院病理学系

目的: 探讨c kit基因和PDGFRA基因在我国胃肠道间质瘤(GIST)中的突变状况。方法: 用PCR扩增和直接测序的方法,检测60例GISTc kit基因9号、11号、13号和17号外显子突变以及PDGFRA基因12号和18外显子突变。结果: 60例GIST中kit基因突变率... 详细信息

目的: 探讨c kit基因和PDGFRA基因在我国胃肠道间质瘤(GIST)中的突变状况。方法: 用PCR扩增和直接测序的方法,检测60例GISTc kit基因9号、11号、13号和17号外显子突变以及PDGFRA基因12号和18外显子突变。结果: 60例GIST中kit基因突变率为63. 3%,绝大多数为杂合性突变,少数为纯合性突变。其中以编码近膜区的11号外显子突变最为常见(58. 3% );其次为编码胞外区的9号外显子突变(3. 3% );偶见编码胞内酪氨酸激酶结构域的13号外显子突变(1. 7% ),是一个新的突变位点L641P;未检出17号外显子突变。11号外显子的突变位点多集中在5′端的经典热点(42. 9% ),表现为密码子第557 -560的点突变和框内缺失。第二个热点位于11号外显子的3′端,为框内串联重复。后者主要发生在胃部,女性患者多见。60例GIST中PDGFRA基因突变率为5%,表现为编码胞内酪氨酸激酶结构域的18号外显子D842V点突变,且均为CD117阴性。未见编码近膜区的12号外显子突变。结论:CD117阳性GIST主要表现为c kit突变,分布在11号外显子经典热点和3′端热点,后者与老年女性胃GIST相关。PDGFRA基因突变主要见于CD117阴性GIST,多发生在后腹膜,具高度侵袭危险性。

关键词：胃肠道间质瘤检测 c-kit基因外显子突变 CD117 GIST FRA基因基因突变率酪氨酸激酶突变位点 PCR扩增直接测序女性患者主要表现老年女性 PDG 结构域点突变编码热点杂合性胞外区密码子后腹膜多发生膜区

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第5期25卷 396-398,405页

作者：刘莹左大明卢晓张丽芸陈政良南方医科大学基础医学院免疫学教研室广东广州510515

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因,获得其胞外段的原核表达产物。方法:采用RT-PCR方法,从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA,扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,以SDS-PAGE和Western blo... 详细信息

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因,获得其胞外段的原核表达产物。方法:采用RT-PCR方法,从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA,扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:从健康产妇胎盘总RNA中,扩增获得约1300bp的DNA片段,克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN。从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因,构建重组表达质粒pET-41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST,鉴定其相对分子质量(Mr)为66000,Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合。结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因,并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST,为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。

关键词： DC-SIGN 基因克隆胞外区蛋白表达

mB7AP-exCD40L融合蛋白的分子设计及其在Pichia pastoris中的表达和生物活性

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复旦学报（医学版） 2005年第4期32卷 401-406,F003页

作者：陈晋储以微邵先安任学芳张洪勇高海峰何球藻熊思东复旦大学上海医学院免疫学系-教育部分子医学重点实验室-上海基因免疫与疫苗研究中心上海200032

目的小鼠B7反义肽与小鼠CD40L胞外区融合蛋白(mB7AP-exCD40L)的分子模拟设计及其酵母表达体系的建立,研究其酵母表达产物的生物活性。方法分子模拟设计mB7AP-exCD40L;构建pPIC9K-mB7AP-exCD40L质粒并用电击法转化PichiapastorisGS115。W... 详细信息

目的小鼠B7反义肽与小鼠CD40L胞外区融合蛋白(mB7AP-exCD40L)的分子模拟设计及其酵母表达体系的建立,研究其酵母表达产物的生物活性。方法分子模拟设计mB7AP-exCD40L;构建pPIC9K-mB7AP-exCD40L质粒并用电击法转化PichiapastorisGS115。Westernblot鉴定融合蛋白的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)研究mB7AP-exCD40L对淋巴细胞增殖的影响。结果构建的重组Pichiapastoris实现了mB7AP-exCD40L的分泌表达,表达蛋白质的相对分子质量约2.6×103,对MLR具有抑制作用。结论分子模拟设计的mB7AP-exCD40L在Pichiapastoris表达体系成功表达,为进一步研究mB7AP-exCD40L在抗移植排斥反应中的作用奠定了基础。

关键词： pastoris 融合蛋白生物活性分子设计混合淋巴细胞反应重组Pichia Western 抗移植排斥反应酵母表达体系分子模拟淋巴细胞增殖相对分子质量 CD40L B7反义肽 GS115 表达产物 blot 分泌表达抑制作用胞外区电击法

卵泡刺激素受体FSHR234纳米抗体的分离纯化及多克隆抗体的制备

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微生物学通报 2018年第11期45卷 2463-2469页

作者：李玲霞吴锦艳曹小安冯倩杜国玉尹双辉李江伟尚佑军中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 新疆大学生物资源基因工程重点实验室新疆乌鲁木齐830046

【背景】卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)在人体成熟破骨细胞及单核细胞表面表达,成为阻断卵泡刺激素(FSH)作用的潜在靶点,制备亲和力较高的FSHR抗体已成为靶向治疗FSH相关疾病的切入点。【目的】构建FSHR... 详细信息

【背景】卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)在人体成熟破骨细胞及单核细胞表面表达,成为阻断卵泡刺激素(FSH)作用的潜在靶点,制备亲和力较高的FSHR抗体已成为靶向治疗FSH相关疾病的切入点。【目的】构建FSHR重组载体获得表达量较高的可溶性蛋白,进一步制备骆驼多克隆抗体及其纳米抗体。【方法】利用XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切重组质粒p ET30a-FSHR234,将目的基因fshr构建于p GEX-4T-1载体并进行原核表达,利用Western blot及ELISA检测目的蛋白的配体结合能力。免疫新疆双峰驼制备骆驼多克隆抗体,并利用噬菌体展示技术筛选获得FSHR纳米抗体。细胞免疫化学法检测FSHR抗体在coav-3的表达情况。【结果】构建了pGEX-4T-1-FSHR234重组质粒,获得了表达量较高的FSHR234可溶性蛋白;并构建了5株FSHR纳米抗体,鉴定出一株结合能力较强的纳米抗体,命名为VHH-3F9。【结论】制备的骆驼FSHR多克隆抗体效价达1:128 000,筛选获得的VHH-3F9纳米抗体能与FSHR234具有较高的结合性,且两者均能表达于coav-3细胞表面。

关键词：卵泡刺激素受体 pGEX-4T-1 胞外区纳米抗体

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人sCD40L基因的克隆及表达

细胞与分子免疫学杂志 2002年第2期18卷 125-127页

作者：程琳玲聂红王利尤强路丽明沈佰华张冬青李宁丽上海第二医科大学上海市免疫学研究所上海200025 胞外区 RT-PCR Western blot

目的　　克隆人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞中表达。方法用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从激活的人外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中，扩增ＣＤ４０Ｌ胞外区ｃＤＮＡ，并克隆至载体ｐＧＥＭ－Ｔ。测序验证后，转至载体ＰＱＥ３１中，并在大肠杆... 详细信息

目的　　克隆人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞中表达。方法用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从激活的人外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中，扩增ＣＤ４０Ｌ胞外区ｃＤＮＡ，并克隆至载体ｐＧＥＭ－Ｔ。测序验证后，转至载体ＰＱＥ３１中，并在大肠杆菌Ｍ１５中进行表达，最后通过亲和层析柱得到纯化蛋白。结果纯化所得的产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ证实，确为人ｓＣＤ４０Ｌ蛋白。结论　应用基因重组法构建了人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞内成功地进行了表达，为今后进一步研究ＣＤ４０Ｌ与凋亡、疾病的发病机制及临床治疗奠定了基础。

关键词： CD40L 胞外区 RT-PCR Westernblot 基因克隆基因表达

抗猪PD-L1单克隆抗体的制备与其生物学特性鉴定

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基因组学与应用生物学 2018年第6期37卷 2368-2373页

作者：岳锋杨健周娟娟李静朱艳平李鹏孙国鹏张艳芳王选年新乡学院、生命科学技术学院新乡453003 河南省畜牧兽医服务中心郑州450008

本研究旨在制备抗猪PD-L1单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）,有助于阻断猪PD-1/PD-L1通路逆转免疫功能。免疫原为猪PD-L1胞外区重组蛋白,雌性BALB/c鼠为免疫动物,用淋巴细胞杂交瘤技术将鼠骨髓瘤细胞NS0和免疫BALB/c鼠脾细胞融合,... 详细信息

本研究旨在制备抗猪PD-L1单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）,有助于阻断猪PD-1/PD-L1通路逆转免疫功能。免疫原为猪PD-L1胞外区重组蛋白,雌性BALB/c鼠为免疫动物,用淋巴细胞杂交瘤技术将鼠骨髓瘤细胞NS0和免疫BALB/c鼠脾细胞融合,ELISA法筛选及多次克隆化培养,筛选抗猪PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株。成功制备1株能稳定分泌抗猪PD-L1的mAb的杂交瘤细胞株3B5,Ig亚型为IgG1,细胞上清和腹水效价分别为1：1×2^10和1：1.024×10^5,ELISA和Western-blotting结果表明该株单抗能特异性识别猪重组PD-L1蛋白,流式细胞术结果表明该单抗可以与猪PBMC上PD-L1蛋白有效结合,成功制备了1株分泌抗猪PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B5,为检测猪PD-L1蛋白表达水平及猪PD-1通路在猪传染性疾病中的致病机制提供有力的检测工具。

关键词： PD-L1 胞外区单克隆抗体效价

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2009年第12期22卷 1213-1215页

作者：潘勇兵田生和李国喜全家妩武汉生物制品研究所肿瘤研究室武汉430060

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤... 详细信息

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。

关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体胞外区单克隆抗体捕获ELISA

人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达

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中国生物制品学杂志 2009年第3期22卷 249-251页

作者：田晨石琳陆敏朱卫彬中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院天津300020 协和干细胞基因工程有限公司天津300384

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK... 详细信息

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK-Br3细胞系中扩增出387bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高;纯化后重组蛋白浓度为1.5mg/ml。结论已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原。

关键词：人表皮生长因子受体胞外区 HER2 克隆表达

重组人肝细胞生长因子激活因子抑制剂-2在毕赤酵母中表达的研究

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重组人肝细胞生长因子激活因子抑制剂-2在毕赤酵母中表达的研究

作者：张睿吉林大学

学位级别：硕士

人肝细胞生长因子激活因子抑制剂-2(human hepatocyte growth factor activator inhibitor 2,hHAI-2)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆组织激肽释放酶等多种丝氨酸蛋白酶有较强的抑制作... 详细信息

人肝细胞生长因子激活因子抑制剂-2(human hepatocyte growth factor activator inhibitor 2,hHAI-2)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆组织激肽释放酶等多种丝氨酸蛋白酶有较强的抑制作用;且对肝细胞生长因子激活因子(hepatocyte growth factor activator inhibitor,HGFA)具有特异性地抑制作用。因此,在抑制肿瘤的形成、肿瘤细胞的扩散和转移及新生血管的形成方面具有很大的应用价值。本研究从人乳腺癌组织总RNA中钓取hhai-2 cDNA序列,利用基因重组技术构建hhai-2基因的克隆载体pMD18-T-hhai-2;以此为基础,通过PCR技术获得了hhai-2基因的胞外区(extracellular domain, ECD)和Kunitz结构域Ⅰ( Kunitz domainⅠ, KDⅠ),并分别构建了表达载体pPICZα-hhai-2/ECD和pPICZα-hhai-2/KDⅠ。将这两种表达载体分别电转化X-33毕赤酵母,建立了稳定表达hhai-2/ECD和hhai-2/KDⅠ基因的毕赤酵母真核表达体系。应用特异性PCR引物进行PCR鉴定。结果表明,hhai-2/ECD和hhai-2/KDⅠ基因已经稳定整合到酵母基因组中。通过测定hHAI-2/ECD和hHAI-2/KDⅠ对胰蛋白酶作用后的残留胰蛋白酶活性检测其活力,筛选出高表达活性的重组hHAI-2/ECD和hHAI-2/KDⅠ酵母菌,结果显示,这两种蛋白的表达活性具有累积效应,产量在一段时间内随表达时间延长而增加。经SDS-PAGE检测其培养液上清,分别获得了相对分子量约为26kDa的hHAI-2/ECD蛋白和11kDa的hHAI-2/KDⅠ蛋白。本研究成功获得了天然结构的重组hHAI-2/ECD和hHAI-2/KDⅠ蛋白,为进一步研究hHAI-2蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词： HAI-2 胞外区 Kunitz结构域Ⅰ 表达毕赤酵母