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单碱基水平上胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的研究进展

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畜牧兽医学报 2020年第1期51卷 1-8页

作者：李广栋张鲁富俊才连正兴刘国世中国农业大学动物科学技术学院北京100193

尽管新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点,但在执行单个碱基水平的突变时其效率往往很低。由于DNA的双链断裂具有很多的不确定性,又加上基于供体模板的同源末端重组(homology directed repair,HDR)仅仅发生在分裂活跃的细胞中,... 详细信息

尽管新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点,但在执行单个碱基水平的突变时其效率往往很低。由于DNA的双链断裂具有很多的不确定性,又加上基于供体模板的同源末端重组(homology directed repair,HDR)仅仅发生在分裂活跃的细胞中,而非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)在整个细胞周期中都可以发生,因此,传统CRISPR/Cas9在单碱基分辨率上进行基因编辑时存在一定弊端。碱基编辑器(base editor,BE)的出现则在一定程度上弥补了这一缺陷。胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)都能够在不引起双链断裂的情况下实现C·G到T·A或A·T到G·C的转换,极大地提高了单碱基编辑的应用价值。本文侧重对出现较早的CBE的原理、发展、应用及存在的问题进行综述,以期为高效单碱基突变工具在生物医学和畜牧业生产中的应用提供有益的参考和借鉴。

关键词：基因编辑单碱基突变胞嘧啶碱基编辑器

基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器的优化

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基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器的优化

作者：连萌安徽大学

学位级别：硕士

近些年以CRISPR/Cas系统为基础发展起来的单碱基编辑器,因其不产生DNA双链断裂、无需外源供体模板、适用于不分裂细胞和编辑效率高等特点,已然成为基因编辑领域的新星,该工具已经被运用到点突变疾病动物模型构建、农作物性状改良、疾病... 详细信息

近些年以CRISPR/Cas系统为基础发展起来的单碱基编辑器,因其不产生DNA双链断裂、无需外源供体模板、适用于不分裂细胞和编辑效率高等特点,已然成为基因编辑领域的新星,该工具已经被运用到点突变疾病动物模型构建、农作物性状改良、疾病基因治疗等方面。现阶段发展较为迅猛的单碱基编辑器是基于Sp Cas9发展而来的,其继承了Sp Cas9识别富含G/C PAM(NGG)的特点,这一定程度上限制了该工具的可靶向范围;另一个属于CRISPR第二类系统V型的Cpf1(也称为Cas12a)由于识别富含T/A PAM(TTTV)也被用来构建相关的碱基编辑系统。将r APOBEC与核酸酶失活的d Lb Cpf1进行融合而成的d Lb Cpf1-BE0拓宽了已有的碱基编辑工具箱,但也存在一些问题,比如很多位点编辑效率低下、对于GC基序中的C编辑无效等,这些问题阻碍着基于Cpf1碱基编辑工具的应用发展。本研究基于现有的以Cpf1为基础的碱基编辑工具效率低下的问题,通过不同策略进行优化以提高其编辑效率。首先,我们替换为胞嘧啶脱氨活性更高的h APOBEC3A构建而成的d Lb Cpf1-h A3A,编辑效率最高可达50%。对于一些d Lb Cpf1-BE0基本无效的位点,d Lb Cpf1-h A3A的编辑效率也可达20%。相较于d Lb Cpf1-BE0来讲,d Lb Cpf1-h A3A的平均编辑效率得到显著提高。由于使用脱氨活性更高的h APOBEC3A,d Lb Cpf1-h A3A的活性窗口也有所拓宽,为C6-C13,这也会导致旁观者效应的发生。我们采用h A3A-Y130F、h A3A-Y132D这两个变体来构建编辑器,其可以在保持编辑效率的同时缩窄活性窗口,为C6-C12。我们还利用另一变体h A3A-N57G构建特异性对TCR(R=A/G)基序中的C进行编辑的d Lb Cpf1-h A3A-N57G,这一编辑器可以大大减少旁观者效应,同时保持较高的精确性。除以上特点之外,无论是AC、CC、GC、TC中任一基序中的C,我们构建的d Lb Cpf1-h A3A系列碱基编辑器都可对其进行高效编辑,这与d Lb Cpf1-BE0对于GC基序中的C无效有很大差别。因此,我们成功构建高效的d Lb Cpf1-h A3A系列碱基编辑器。除替换脱氨酶进行编辑效率提升之外,我们还从染色质的开放程度入手,进一步来提高基于Cpf1碱基编辑器的效率。我们利用d Cas9/sg RNA结合在靶位点双侧可以局部打开染色质结构,进而增加靶向编辑效率。但是对于不同的位点,效率提高有所差异,最高可以提高一倍。我们还对sg RNA是否会造成d Cas9靶向位置造成脱靶进行分析,发现使用长度更短(14-15nt)的dead sg RNA比sg RNA脱靶现象要少很多,几乎检测不到。综上所述,我们对基于Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器进行优化,实现了高效的碱基编辑,实现了碱基编辑工具箱的扩充。在本研究中使用h APOBEC3A变体构建的系列碱基编辑器,具有不同的特性,为今后的应用提供更多的选择;通过d Cas9结合邻近位置的策略可以进一步提高编辑效率,为该工具的应用奠定基础。

关键词： CRISPR/Cpf1 hAPOBEC3A 胞嘧啶碱基编辑器 dCas9结合

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碱基编辑系统研究最新进展及应用

生物工程学报 2021年第7期37卷 2307-2321页

作者：徐鑫刘明军新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046 新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆乌鲁木齐830026

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homologydirected recombination,HDR)修复途径,且效率极低。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶... 详细信息

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homologydirected recombination,HDR)修复途径,且效率极低。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(Baseeditors,BE):胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)。这两类编辑器分别能够在不产生DNA双链断裂的前提下在基因靶位点完成C>T (G>A)或A>G (T>C)的替换,最终实现精准的碱基编辑。目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域,为基础和应用研究提供了强大的技术工具。文中概括了碱基编辑技术的研发过程、技术优势、应用现状、存在问题及改进策略,以期为相关领域的科研人员了解和使用碱基编辑系统提供参考。

关键词： CRISPR/Cas9 碱基编辑胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术及其在生物医学和农业中的应用

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生物工程学报 2021年第9期37卷 3071-3087页

作者：余传照莫健新赵鑫李国玲张献伟华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心广东广州510642 温氏食品集团股份有限公司广东新兴527439

近年来,基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)的基因编辑技术飞速发展,该系统可以利用同源定向重组(Homology directed repair,HDR)来完成其介导的精准编辑,但效率极低,限制了其在农业和生物医学等领域上的推广应用。基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术作为一种新兴的基因组编辑技术,能在不产生双链断裂的情况下实现碱基的定向突变,相对于CRISPR/Cas介导的HDR编辑具有更高的编辑效率和特异性。目前,已开发出了可将C碱基突变为T碱基的胞嘧啶碱基编辑器(Cytidine base editors,CBE),将A碱基突变为G碱基的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors,ABE),以及可实现碱基任意变换和小片段精准插入和缺失的Prime编辑器(Prime editors,PE)。另外,能实现C到G颠换的糖基化酶碱基编辑器(Glycosylase base editors,GBE)以及能同时编辑A和C两种底物的双碱基编辑器也已被开发出来。文中主要综述了几种DNA碱基编辑器的开发历程、研究进展及各自优点和局限性;介绍了DNA碱基编辑技术在生物医学以及农业中的成功应用案例,以期为DNA碱基编辑器的进一步优化和选择应用提供借鉴。

关键词： CRISPR/Cas 碱基编辑胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器 Prime编辑器

单碱基编辑技术的原理、发展及其在家畜育种中的应用

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生物工程学报 2023年第1期39卷 19-33页

作者：张迎冰张成图吴英于芮峦苏建民西北农林科技大学动物医学院农业、农村部动物生物技术重点实验室陕西杨凌712100 西宁市动物疫病预防控制中心青海西宁810016

基因编辑技术CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)在家畜育种领域得到广泛应用,但其效率低下,且存在非靶向切割、安全性较低等问题,极大地限制了家畜育种中单碱基突变的引入。单碱基编辑(single base editing)作为一种最新的基因编辑工具,能够在不导入双链断裂的情况下直接进行碱基的替换,具有编辑效率高和特异性强的特性,为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。本文主要介绍了单碱基编辑系统的原理及发展进程和碱基编辑技术在家畜育种中的应用,以期为单碱基编辑器在家畜育种中进一步优化和选择应用提供参考。

关键词：碱基编辑胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器家畜育种

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碱基编辑的研究进展

黑龙江畜牧兽医 2022年第5期 20-24,29,132页

作者：王晶朱喆毕延震张鹏湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室武汉430064 中南民族大学生命科学学院武汉430074

碱基编辑(base editing)是一种基于CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统发展起来的新型基因修饰技术,它成功地将切割DNA双链的“剪刀”改变为特定碱基的“修正器”,该技术能在不诱导双链DNA断... 详细信息

碱基编辑(base editing)是一种基于CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统发展起来的新型基因修饰技术,它成功地将切割DNA双链的“剪刀”改变为特定碱基的“修正器”,该技术能在不诱导双链DNA断裂的情况下,通过sgRNA引导碱基修饰酶至特定位点,进而实现碱基的替换。碱基编辑器主要分为胞嘧啶碱基编辑器(cytidine base editors, CBEs)、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)和Prime编辑器(prime editors, PEs),CBEs可以完成胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转换,ABEs能将腺嘌呤(A)转换成鸟嘌呤(G),PEs可以实现任意碱基间的转换。文章对碱基编辑的基本原理、发展历史、使用方法、应用策略和发展前景等进行综述,以期为其在分子育种和基因治疗等领域的应用提供新的思路。

关键词： CRISPR/Cas9 碱基编辑技术胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器分子育种

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单碱基编辑技术在动物中的应用

黑龙江畜牧兽医 2023年第23期 21-25,31,130-132页

作者：陈力王静吴平先张廷焕郭宗义王金勇重庆市畜牧科学院重庆402460 国家生猪技术创新中心重庆402460

近年发展起来的人工核酸酶技术可引起特定位点的DNA双链断裂,断裂后通过同源重组修复机制使精准单碱基编辑成为可能。基于CRISPR/Cas9将Cas9n与胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶融合而开发出的单碱基编辑系统可进一步提高单碱基编辑的效率和精... 详细信息

近年发展起来的人工核酸酶技术可引起特定位点的DNA双链断裂,断裂后通过同源重组修复机制使精准单碱基编辑成为可能。基于CRISPR/Cas9将Cas9n与胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶融合而开发出的单碱基编辑系统可进一步提高单碱基编辑的效率和精确度,在不造成DNA双链断裂的情况下实现精准单碱基编辑。对动物进行单碱基编辑不仅有望提高其生产性能,而且能为人类疾病研究作出重要贡献。文章回顾了单碱基编辑系统的发展历程,重点介绍了单碱基编辑系统在动物中的应用,并对单碱基编辑系统在动物中的应用前景进行了展望,以期为动物基因编辑技术的研发和应用提供理论依据和应用案例。

关键词：同源重组单碱基编辑系统胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器糖基化酶碱基编辑器引导编辑器

改造腺嘌呤脱氨酶TadA-8e开发精准高效的C-to-G碱基编辑器

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改造腺嘌呤脱氨酶TadA-8e开发精准高效的C-to-G碱基编辑器

作者：汝高盟华东师范大学

学位级别：硕士

已知人类遗传疾病中有超过一半的比例是由点突变导致的,因此开发能精确“改写”单碱基的工具对研究和治疗这类遗传疾病至关重要。单碱基编辑器的开发为其带来了希望,它主要由脱氨酶与Cas9缺口酶(nCas9)融合而成,其作用过程中不会直接导... 详细信息

已知人类遗传疾病中有超过一半的比例是由点突变导致的,因此开发能精确“改写”单碱基的工具对研究和治疗这类遗传疾病至关重要。单碱基编辑器的开发为其带来了希望,它主要由脱氨酶与Cas9缺口酶(nCas9)融合而成,其作用过程中不会直接导致双链DNA断裂(DSB),也不依赖于DNA修复模板,相对于同源重组的策略,能更加高效地在基因组DNA特定区域实现碱基转换。通过将天然的胞嘧啶脱氨酶(AID/APOBEC家族)与nCas9融合构建最初版本的CBE,通常会产生大量的C-to-G或C-to-A副产物。主要是因为胞嘧啶脱氨酶对C脱氨形成U,U:G错配会被尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)识别,将U切除形成AP位点,经过TLS聚合酶以及DNA复制过程,在部分基因组DNA位点中主要诱导C-to-G的碱基颠换,从而构建出一类新的碱基编辑器—CGBE。基于天然胞嘧啶脱氨酶开发的CGBEs具有广泛的应用前景,但同时它们会产生较高比率的DSB而导致小片段插入缺失(indels)产物、旁观者编辑以及Cas9非依赖的DNA和RNA水平脱靶编辑。相反,ABE使用一种非天然的腺嘌呤脱氨酶,由大肠杆菌中的TadA进化而来催化单链DNA中的腺嘌呤脱氨,实现高效和高纯度(超过99.9%)的A-to-G碱基转换且引起较少indels的产生。最近的研究表明,ABEs还可以诱导TC*N基序中的胞嘧啶编辑,活性更高的ABE8e显示出增强的胞嘧啶脱氨酶活性,这说明进化后的TadA不仅可以作用双环的腺嘌呤,也可以对单环的胞嘧啶进行脱氨催化。因此我们设想有可能通过对TadA的改造,缩小催化活性口袋,只让更小体积的胞嘧啶进入,从而构建一种全新的非天然胞嘧啶脱氨酶来源的碱基编辑器实现C-to-G的颠换。本课题主要针对活性最高的TadA-8e进行改造。首先,我们在可能影响TadA-8e与底物DNA作用的口袋附近,选取14个潜在氨基酸位点,构建31个候选变体进行测试,在TadA-8e中引入N46L变体可以消除其腺嘌呤脱氨酶活性,并导致TadA-8e衍生的C-to-G碱基编辑器(Td-CGBE)催化C·G-to-G·C颠换。通过大量内源性靶点评价,表征Td-CGBE催化活性与经典的CGBE1相当,最高效率达72.8%,但是产生的indels频率减少了2倍且更加精准靶向C/C位(窗口缩窄至1-2nt)。接着,我们基于Cas9-dependent/independent和RNA-seq全面的脱靶评价,与目前经典的CGBEs工具对比,发现Td-CGBE的脱靶均降低至本底水平,为精准基因治疗提供强有力的技术平台支持。最后,我们利用Td-CGBE成功制备白化病小鼠模型,在小鼠Tyr基因S184位点产生提前终止密码子,在21只F0代小鼠中观察到了白化表型,共计14只产生目的位点C-to-G颠换,平均效率为36%,最高效率达到85%。此外,我们还通过在致病性多聚胞嘧啶序列中生成或纠正疾病相关细胞系模型,明确Td-CGBE在精准治疗和其他应用中的可行性。综上所述,本课题提供了一种突破性的碱基编辑工具改造概念,发现影响TadA底物选择的关键变体N46L,破坏其固有的腺嘌呤脱氨酶活性,同时显著提高胞嘧啶的编辑,一定程度上克服了天然脱氨酶的缺陷,创新性地开发了一款不依赖AID/APOBEC脱氨酶家族的新型C-to-G编辑器——Td-CGBE。与经典的CGBEs相比,Td-CGBE产生最少的indels产物、具有精准的编辑窗口、极大降低DNA和RNA水平脱靶编辑,丰富了碱基编辑技术的工具箱,也为蛋白质进化工程提供全新思路。

关键词：腺嘌呤碱基编辑器胞嘧啶碱基编辑器编辑窗口脱靶评估小鼠疾病模型

改良型胞嘧啶碱基编辑技术的创建与MSTN敲除猪的制备研究

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改良型胞嘧啶碱基编辑技术的创建与MSTN敲除猪的制备研究

作者：盘家圣佛山科学技术学院

学位级别：硕士

猪在农业和医学领域均具有重要利用价值,利用基因修饰技术能够快速改良猪的经济性状和构建人类疾病模型。巴马小型猪具有肉质鲜美、适应性强、耐粗饲和高抗逆性等优点,但也存在瘦肉率低、脂肪含量高、生长缓慢和饲料转化率低等劣势。利... 详细信息

猪在农业和医学领域均具有重要利用价值,利用基因修饰技术能够快速改良猪的经济性状和构建人类疾病模型。巴马小型猪具有肉质鲜美、适应性强、耐粗饲和高抗逆性等优点,但也存在瘦肉率低、脂肪含量高、生长缓慢和饲料转化率低等劣势。利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 9)基因编辑技术能够快速进行基因组改造,提升猪的生产性能。但CRISPR/Cas9伴随基因组双链断裂,可能存在基因缺失或染色体缺失等问题。因此,其在农业动物遗传改良应用上存在潜在安全风险。近年来基于CRISPR/Cas9开发的碱基编辑技术,如胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),能够在不引发DNA(Deoxyribonucleic acid)双链断裂的情况下高效实现单个碱基的定向修改,因而在猪遗传改良上具有更高的安全性。本研究旨在建立猪细胞改良型胞嘧啶碱基编辑技术,为精准培育能够显著促进肌肉生长的肌肉抑制素基因敲除猪奠定基础。首先采用经改良最大限度降低脱靶效应的CBE工具(YE1-BE4max NG)构建了“All-in-one”改良型CBE质粒(PX-YE1-BE4max NG),该质粒包含CBE编辑器和sg RNA(Small guide RNA)表达元件,选择四个猪的内源性靶点进行测试,经Sanger测序和二代测序,通用载体编辑效率在7.4%到30.1%,窗口主要位于4-7位,比传统双质粒转染效率高、操作便捷;根据通用载体的特性,针对肌肉生长抑制素基因(Myostatin gene,MSTN)设计四个能够提前引入翻译终止信号的MSTN编辑载体,通过上一步同样的检测步骤筛选出效率最高的MSTN编辑载体对巴马小型猪体细胞进行单碱基编辑,共获得46个单细胞克隆。经过Sanger测序,7个单等位碱基突变细胞,4个双等位碱基突变细胞;选取四个状态较好的细胞做脱靶鉴定,均不存在脱靶效应,从中选择符合预期突变、无脱靶,生长活性较佳的2-1#单细胞克隆进行了体细胞克隆和胚胎移植,目前代孕母猪生长状态良好,已经怀孕两个半月。本研究开发改良版胞嘧啶碱基编辑技术,测试其在猪细胞内源性基因的编辑活性和编辑窗口。靶向对猪肾脏成纤维细胞的MSTN基因,制备了因单个碱基突变引入提前终止密码子导致MSTN基因敲除的巴马小型猪体细胞,用其制备克隆胚胎并移植到代孕母猪获得妊娠。本研究为进一步应用体细胞克隆技术构建仅携带单个碱基突变、最大限度规避生物安全风险的MSTN碱基编辑巴马小型猪奠定了基础,并为开展巴马小型猪其它基因位点碱基编辑提供了经验借鉴。

关键词：巴马香猪基因编辑胞嘧啶碱基编辑器肌肉生长抑制素