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胞内劳森氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2022年第4期44卷 396-401,444页

作者：王丹丹周俊明倪艳秀祝昊丹朱雪蛟周金柱李彬江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014

为建立胞内劳森氏菌(LI)抗体的间接ELISA检测方法,本研究构建了含有LI外膜蛋白基因的重组质粒pET32-LI1022并进行原核表达。结果显示LI1022基因在BL21(DE3)宿主菌内以可溶性表达重组LI1022蛋白(rLI1022),western blot结果显示rLI1022具... 详细信息

为建立胞内劳森氏菌(LI)抗体的间接ELISA检测方法,本研究构建了含有LI外膜蛋白基因的重组质粒pET32-LI1022并进行原核表达。结果显示LI1022基因在BL21(DE3)宿主菌内以可溶性表达重组LI1022蛋白(rLI1022),western blot结果显示rLI1022具有较好的反应原性,可作为建立间接ELISA检测方法的包被抗原。进一步经Ni柱纯化获得纯化r LI1102,以其为包被抗原,对ELISA条件进行优化,结果显示纯化的rLI1022以4.69 ng/孔4℃过夜包被最佳;血清最佳反应条件为1:100稀释,37℃作用1 h;羊抗猪IgG-HRP最佳反应条件为1:10000稀释,37℃作用1 h;25℃TMB底物显色15 min。对建立的间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性进行分析,结果显示包被抗原与PRRSV、PRV、FMDV、PEDV等阳性血清均无交叉反应,仅可特异性检测LI抗体;当LI阳性血清稀释倍数为1:400时仍为阳性,表明该方法敏感性较好;批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比,二者的符合率达94.44%;利用所建立的间接ELISA方法对江苏部分地区319份临床猪血清样品进行检测,其中LI阳性检出率为87.77%,表明LI在江苏猪群中普遍存在。本研究首次建立了检测LI的间接ELISA方法,为临床LI血清流行病学调查提供了可行技术手段。

关键词：胞内劳森氏菌间接ELISA 抗体检测 LI1022重组蛋白

胞内劳森氏菌鞭毛蛋白Flic的可溶性表达与免疫原性分析

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动物医学进展 2022年第11期43卷 22-26页

作者：夏中秋陈宇婧岳凯管翠翠杜恩岐姚伦广南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南南阳473061 河南省畜禽保健品工程技术研究中心河南南阳473061 杨凌凯瑞生物科技有限公司陕西杨凌712100 西北农林科技大学陕西杨凌712100

采用PCR扩增出猪回肠炎胞内劳森氏菌的鞭毛蛋白基因Flic(LI0710),再将目的基因和Msyb标签插入原核表达载体pET-28a,构建表达质粒pET28a-Msyb-Flic。然后将测序正确的质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,0.5 mmol IPTG诱导阳性菌株进行... 详细信息

采用PCR扩增出猪回肠炎胞内劳森氏菌的鞭毛蛋白基因Flic(LI0710),再将目的基因和Msyb标签插入原核表达载体pET-28a,构建表达质粒pET28a-Msyb-Flic。然后将测序正确的质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,0.5 mmol IPTG诱导阳性菌株进行蛋白表达,采用超声破碎仪破碎菌体收集蛋白。最后使用NI柱摸索纯化条件获得目的蛋白,采用Western blot检测蛋白特异性,免疫小鼠检测抗体水平。结果表明,获得了可溶性表达的胞内劳森氏菌鞭毛蛋白Flic(LI0710),用Flic(LI0710)蛋白免疫小鼠后能产生较高水平的特异性抗体,表达蛋白与小鼠胞内劳森氏菌抗血清可发生特异性反应。结果为胞内劳森氏菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词：胞内劳森氏菌鞭毛蛋白原核表达纯化

猪增生性肠炎诊断方法的初步建立及胞内劳森氏菌LI0065基因的克隆与表达

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猪增生性肠炎诊断方法的初步建立及胞内劳森氏菌LI0065基因的克隆...

作者：李啟皓湖南农业大学

学位级别：硕士

猪增生性肠炎是由胞内劳森菌引起的一种接触性传染性疾病,以肠道增生为主要特征,其临床症状表现为腹泻、日增重量下降、生长缓慢等,病理变化主要为肠道出血、肠壁增粗、肠粘膜增厚,隐窝上皮细胞增生。该病传播范围广,发病率高,呈世界流... 详细信息

猪增生性肠炎是由胞内劳森菌引起的一种接触性传染性疾病,以肠道增生为主要特征,其临床症状表现为腹泻、日增重量下降、生长缓慢等,病理变化主要为肠道出血、肠壁增粗、肠粘膜增厚,隐窝上皮细胞增生。该病传播范围广,发病率高,呈世界流行性趋势,严重影响猪场经济效益。本研究旨在建立一套能在临床上高效、准确、快速检测猪增生性肠炎的诊断方法;并实现对劳森氏菌基因L10065的克隆与表达。1、采集湖南省规模化猪场腹泻猪的粪便进行处理,对其进行DNA抽提、目的片段巢式PCR扩增及扩增条件的优化,然后通过敏感性、特异性、重复性实验及临床样本的检测验证此方法的可行性。对巢式PCR检测为阳性的猪进行剖检,取其小肠做成石蜡切片,进行HE染色与改良银染,分析其组织病理学变化。结果成功扩增出大小为263bp目的片段,与劳森菌全序列比对同源性高达99%。临床检测阳性率达25%,检测稳定可靠、重复性好、特异性高;HE染色发现小肠绒毛内杯状细胞明显减少甚至消失,改良银染发现小肠隐窝的非正常融合,且隐窝上皮细胞胞浆内可见疑似长杆状或弯曲杆状胞内劳森氏菌的扎堆生长。2、本实验扩增的目的片段L10065全长750bp,共编码249个氨基酸,编码蛋白分子量为29.2KD。生物信息学分析发现,L10065编码的蛋白具有不稳定性,为非信号肽,预测可能是参与细胞信号传导的膜受体蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳鉴定L10065编码的蛋白为可溶性蛋白。

关键词：猪增生性肠炎胞内劳森氏菌巢氏PCR 原核诱导表达

猪胞内劳森氏菌LAMP、PCR快速检测方法的建立及应用

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猪胞内劳森氏菌LAMP、PCR快速检测方法的建立及应用

作者：罗露四川农业大学

学位级别：硕士

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于猪感染胞内劳森氏菌引起的一种传染性肠道出血性的消耗性疾病,1931年Bieste和Sohwarce首次报道了该病,1974年Rowland等证实了该病,该病现已成为世界上流行最广的猪病之一。... 详细信息

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于猪感染胞内劳森氏菌引起的一种传染性肠道出血性的消耗性疾病,1931年Bieste和Sohwarce首次报道了该病,1974年Rowland等证实了该病,该病现已成为世界上流行最广的猪病之一。虽然,猪增生性肠炎引l起的死亡率不高,但由于其主要发病为慢性型,使得患病猪生长缓慢,饲料利用率和平均日增重明显下降,淘汰率上升,导致猪场经济损失严重。一些养猪业发达的国家和地区,由于饲料中抗生素的禁用或限用,导致猪增生性肠炎发病率逐年上升。在我国,临床猪增生性肠炎疑似病例有逐渐增多的趋势,但我国对猪增生性肠炎的研究还处于起步阶段,缺乏对该病的流行病学调查,因此开发快速准确的临床检测方法对于该病的研究具有重要的意义。本试验根据引物设计原理,针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列分别设计了PCR和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)特异性引物,通过对PCR方法退火温度的优化,LAMP方法的反应温度、反应时间、内外引物比例、dNTP浓度、镁离子浓度、甜菜碱的优化,确定其最优反应条件后成功建立了胞内劳森氏菌的PCR和LAMP两种检测方法。灵敏度实验结果表明建立的PCR方法可检出的拷贝数为103个,LAMP方法可检出的拷贝数为10’个；特异性试验表明,PCR方法和LAMP方法对***、Salmonella、PEDV、PRV扩增结果均为阴性,且这两种方法稳定性和重复性良好。LAMP反应产物还可进行可视化检测,阳性反应产物在自然光下出现明显浑浊,加入SYBR Green Ⅰ染料后,在紫外灯照下,阳性反应管发出绿色荧光,而阴性反应管无荧光现象出现。应用本试验建立的PCR和LAMP两种方法检测从四川部分规模化养猪场采集的114份粪便样本,其中60份样本(52.6%)利用PCR和LAMP检测方法均检出为阳性,13份样本(11.4%)利用LAMP检测方法检出为阳性,PCR检测方法检出为阴性,41份样本(36.0%)利用PCR和LAMP检测方法均检出为阴性。应用FIRSTtest试剂盒进行复核检测,PCR检测方法的符合率为76.0%,LAMP检测方法的符合率为92.4%,LAMP检测方法具有更高的灵敏度。胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠炎造成的死亡率不高,但是对猪场的经济造成较大的损失,且该病目前在我国感染率较高。本试验所建立的PCR和LAMP两种方法具有快速简便的特点,且LAMP方法不需要复杂的仪器设备,反应条件简便,成本较低,适用于实验室和现场快速检测。本试验建立的PCR和LAMP方法为胞内劳森氏菌的检测提供了一定的参考。

关键词：胞内劳森氏菌 PCR LAMP 检测

猪胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与初步应用

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猪胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建...

作者：刘磊广西大学

学位级别：硕士

本研究以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板,通过PCR和Nested-PCR的方法扩增出胞内劳森氏菌四个抗原候选蛋白(即外膜蛋白OMP1022、外膜蛋白OMP0902、外膜蛋白OMP1024和表面脂蛋白SLP0235)的基因序列,并分别构建T-A克隆质粒,再亚克隆... 详细信息

本研究以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板,通过PCR和Nested-PCR的方法扩增出胞内劳森氏菌四个抗原候选蛋白(即外膜蛋白OMP1022、外膜蛋白OMP0902、外膜蛋白OMP1024和表面脂蛋白SLP0235)的基因序列,并分别构建T-A克隆质粒,再亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中得到原核表达质粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、 pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235,酶切鉴定及序列测定表明,重组表达质粒构建正确。将原核表达质粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、 pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235转入宿主表达菌BL-21(DE3)中,IPTG诱导表达,重组蛋白1022和0902获得表达,而重组蛋白1024和0235末表达或表达量过低。分两段扩增OMP1024,得到1024a和1024b,并构建得到原核表达质粒pET32a-OMP1024a和pET32a-OMP1024b,转入宿主表达菌BL-21(DE3)中,经IPTG诱导后均得到表达。Western-blot证实重组蛋白1022、0902、1024a和1024b均有较好的抗原性。重组蛋白1022为可溶性表达,其余以包涵体的形式得到表达。Ni2+亲和层析法进行纯化获得纯化蛋白。Western-blot验证纯化复性后重组蛋白的抗原性,结果显示均具有良好的抗原性,其中重组蛋白1024b的抗原性最强。以纯化后的重组蛋白1024b作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,优化后确定最佳反应条件为：抗原包被浓度为0.5μg/mL,37℃包被2h;血清稀释40倍,37℃反应1h;二抗稀释8000倍,37℃反应30min;TMB底物室温显色10min。用优化好的ELISA反应条件检测20份阴性血清,确定阴阳性临界值为0.321。血清吸附试验、交叉反应试验和竞争性抑制试验证明LI-1024b间接ELISA具有很好的特异性。利用建立好的LI-1024b间接ELISA检测采自广西部分地区不同年龄段猪群的648份临床血清,有436份为阳性,总阳性率为67.3%。其中南宁、柳州、桂林、贵港和玉林地区猪群的阳性率分别为52.7%、81.1%、76.5%、68.0%和71.8%。哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪和公猪的阳性率分别为50%、30.8%、61.9%、92.4%和88.6%。

关键词：猪增生性肠炎胞内劳森氏菌抗原候选蛋白原核表达间接ELISA 血清学调查

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胞内劳森氏菌的致病机理及猪增生性肠病防治

猪业观察 2020年第4期 23-24页

作者：牛连信雷霆郭秀香河南省滑县农业农村局动物卫生监督所北京市京牧生物滑县分公司河南省滑县道口镇第一初级中学

引言:胞内劳森氏菌是一种胞内专性厌氧菌,可感染猪引起小肠和大肠出现增生坏死病变,病猪日增重减少,饲料转化率降低甚至导致病猪死亡。目前对胞内劳森氏菌的发病机理有了较深层次的了解,但部分机制以及相关毒力基因的作用尚不明确。本... 详细信息

引言:胞内劳森氏菌是一种胞内专性厌氧菌,可感染猪引起小肠和大肠出现增生坏死病变,病猪日增重减少,饲料转化率降低甚至导致病猪死亡。目前对胞内劳森氏菌的发病机理有了较深层次的了解,但部分机制以及相关毒力基因的作用尚不明确。本文对胞内劳森氏菌的致病机制研究以及猪增生性肠炎病的防治进行论述,为胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠病的机制和防控提供参考。

关键词：猪增生性肠炎饲料转化率猪日增重胞内劳森氏菌毒力基因致病机理致病机制专性厌氧菌

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胞内劳森氏菌lsaA基因克隆与序列分析

福建畜牧兽医 2015年第6期37卷 18-20页

作者：陈玉红郑新添李晓华戴爱玲龙岩学院福建省预防兽医学与兽医生物技术重点试验室福建龙岩364000

目的:克隆并分析胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis,LI)lsa A基因,为研究该基因提供基础。方法:根据已发表的LI基因组序列,设计2条引物,提取猪回肠黏膜的LI基因组,并用PCR技术扩增lsa A基因,将其克隆、测序,进行序列同源性、蛋白... 详细信息

目的:克隆并分析胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis,LI)lsa A基因,为研究该基因提供基础。方法:根据已发表的LI基因组序列,设计2条引物,提取猪回肠黏膜的LI基因组,并用PCR技术扩增lsa A基因,将其克隆、测序,进行序列同源性、蛋白抗原性预测等分析。结果:扩增出与702 bp引物相符的基因片段,与Gen Bank的序列同源性为98.4%,该基因编码的蛋白预计具有良好的抗原性。结论:胞内劳森菌las A基因的成功克隆为增生性肠炎的防控提供研究基础。

关键词：胞内劳森氏菌 lsaA基因序列分析抗原预测

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猪肠道粘膜胞内劳森氏菌的分离与检测

龙岩学院学报 2012年第5期30卷 55-60页

作者：尹会方杨小燕张新平郑新添林志黄伟彬龙岩学院福建龙岩364012 福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心(龙岩中心) 福建龙岩364000 福建农林科技大学福建福州350002

通过对猪增生性肠炎阳性病例肠粘膜进行处理、过滤、分离出胞内劳森氏菌,分别运用抗酸染色、Giemsa染色、银染和PCR检测,并设增生性肠炎弱毒疫苗为阳性对照。结果表明,在显微镜下都能观察到这三种不同染色方法染色的胞内劳森氏菌,且PCR... 详细信息

通过对猪增生性肠炎阳性病例肠粘膜进行处理、过滤、分离出胞内劳森氏菌,分别运用抗酸染色、Giemsa染色、银染和PCR检测,并设增生性肠炎弱毒疫苗为阳性对照。结果表明,在显微镜下都能观察到这三种不同染色方法染色的胞内劳森氏菌,且PCR检测均为阳性,与弱毒疫苗阳性对照结果一致。结论:成功分离并鉴定出劳森氏菌,为进一步研究其培养特性和病原学研究奠定了基础。

关键词：胞内劳森氏菌分离检测

猪胞内劳森氏菌GXNN株4个抗原性候选基因抗原性分析

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广西农业科学 2010年第1期41卷 62-65页

作者：肖爱欢谢丽华廖承球兰家暖李茂宁侯韶毅陆仕勇黄伟坚广西大学动物科学技术学院南宁530005 梧州市动物疫病预防控制中心广西梧州543002 广西农垦国有金光农场南宁530042

参考GenBank上已发表的胞内劳森氏菌相关蛋白序列,设计了4对引物,分别扩增了4个抗原性候选基因(3个外膜蛋白基因和1个表面脂蛋白基因),并将4个抗原性候选基因构建好原核表达载体后进行原核表达、SDS-PAGE电泳和Western blotting分析。SD... 详细信息

参考GenBank上已发表的胞内劳森氏菌相关蛋白序列,设计了4对引物,分别扩增了4个抗原性候选基因(3个外膜蛋白基因和1个表面脂蛋白基因),并将4个抗原性候选基因构建好原核表达载体后进行原核表达、SDS-PAGE电泳和Western blotting分析。SDS-PAGE电泳检测初步确定重组融合蛋白pET32a-LI0902、pET32a-LI1022能够进行表达,分别得到53、37kDa的条带;Western blotting分析则初步确定pET32a-LI1022具有抗原性。研究结果首次验证胞内劳森氏菌外膜蛋白基因是否具有抗原性,为诊断试剂盒及基因工程疫苗的研制提供理论基础。

关键词：胞内劳森氏菌抗原性候选基因 SDS-PAGE电泳 Western blotting 猪