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胚胎败育型荔枝胚胎发育异常的显微及亚显微观察

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河南农业大学学报 2006年第2期40卷 194-197页

作者：张健吕柳新叶明志福建农林大学生命科学学院福建福州350002 福建农林大学园艺学院福建福州350002

对胚胎败育型荔枝“绿荷包”与胚胎发育正常型荔枝“乌叶”胚胎发育的基本过程进行了观察比较,显微结构及亚显微结构表明,“绿荷包”胚胎发育过程中存在胚胎在胚囊外发育及内珠被细胞败育的异常现象,而“乌叶”胚胎发育过程中各个部分... 详细信息

对胚胎败育型荔枝“绿荷包”与胚胎发育正常型荔枝“乌叶”胚胎发育的基本过程进行了观察比较,显微结构及亚显微结构表明,“绿荷包”胚胎发育过程中存在胚胎在胚囊外发育及内珠被细胞败育的异常现象,而“乌叶”胚胎发育过程中各个部分结构均表现正常.

关键词：荔枝胚胎败育显微结构亚显微结构

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少籽西瓜内源激素含量变化与胚胎败育的关系

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西北农业学报 2007年第3期16卷 184-187页

作者：薛志强徐道娜张勇马建祥杨建强侯沛张显西北农林科技大学园艺学院陕西杨凌712100

以西瓜材料F011、M05以及两者的F1代（少籽）为试材,采用间接酶联免疫测定技术,比较了3个西瓜材料果实发育过程中内源激素,IAA、GA3、ABA和iPAs的含量变化,对少籽西瓜种子败育的成因进行了分析.结果表明,F1果实中IAA、GA3、ABA和iPAs的... 详细信息

以西瓜材料F011、M05以及两者的F1代（少籽）为试材,采用间接酶联免疫测定技术,比较了3个西瓜材料果实发育过程中内源激素,IAA、GA3、ABA和iPAs的含量变化,对少籽西瓜种子败育的成因进行了分析.结果表明,F1果实中IAA、GA3、ABA和iPAs的含量变化异常于亲本,IAA、GA3和iPAs在球形胚期相对亏损达到30%～70%,而ABA的含量最高值则为亲本同期的2倍,显著富足.同时,3个材料IAA/ABA、ABA/GA3和ABA/iPAs的比值变化趋势差异明显,说明内源激素动态变化及它们之间的比例平衡与西瓜胚胎败育有着密切联系.

关键词：少籽西瓜内源激素胚胎败育

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菊花胚胎败育相关基因的克隆与功能鉴定

菊花胚胎败育相关基因的克隆与功能鉴定

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作者：赵静雅南京农业大学

学位级别：硕士

菊花(Chrysanthemum grandiflorum)原产我国,品种丰富,色彩多变,形态各异,具有较高的观赏价值和经济价值。生产上经常采用远缘杂交的方法,利用野生菊中的优良抗性性状来对具有良好观赏性状的栽培菊进行品种改良。然而在此过程中,胚胎败... 详细信息

菊花(Chrysanthemum grandiflorum)原产我国,品种丰富,色彩多变,形态各异,具有较高的观赏价值和经济价值。生产上经常采用远缘杂交的方法,利用野生菊中的优良抗性性状来对具有良好观赏性状的栽培菊进行品种改良。然而在此过程中,胚胎败育的现象常有发生。本人所在实验室研究者们从细胞学、形态学水平以及高通量测序等方面对远缘杂交胚胎败育现象进行了研究。本论文在前人研究的基础上,分析了miRNA调控胚胎败育的机理;通过克隆胚胎发育相关基因CmERF12并构建植物表达载体,对其表达特性、亚细胞定位及转录激活活性等进行了研究;构建了‘雨花落英’高效再生和遗传转化体系,并获得转基因菊花,为后续基因功能鉴定提供了基础;通过异源转化拟南芥,初步揭示了胚胎败育的分子机理。主要研究结果如下:1.以栽培型地被菊‘雨花落英’为母本,四倍体菊花脑为父本进行杂交,取授粉后12 d及18 d正常和败育的胚胎进行高通量测序,得到差异表达的基因和miRNA。通过Blast 比对和功能注释,初步确定了 unigene、miRNA及其靶基因的功能,并利用荧光定量法验证了它们在胚胎发育过程中的表达差异。结果表明,在定量验证的12个基因中,有9个基因在NE18表达量最高,如Dof,WRI1,2S,OLE等;转录因子NAP在NE18表达量最低,在AE18表达量最高;与乙烯响应相关的转录因子ERF12在败育胚胎中(AE18)表达量明显高于正常胚胎。在定量验证的12个miRNA中,有 7 个在 AE18 中表达量最高,如 miR169b、miR159a 和 miR858b;miR167c-3p 在NE18中表达量最高;miR414在NE12中表达量最高。靶基因的表达受到miRNA的负调控,在9个靶基因中,转录因子WRKY48和NAC在AE18中表达量最高,而在NE12中相对表达量最低;一些与生长素和ATP合成相关的基因在AE18中表达下调。胚胎发育是一个复杂的过程,受到多种基因、miRNA的共同调控。2.对‘雨花落英’与四倍体菊花脑杂交后得到的胚胎转录组数据进行分析,筛选出在胚胎发育不同时期差异表达的基因CmERF12。设计特异引物,以‘雨花落英’为材料,通过普通PCR方法克隆得到其CDS序列:全长336bp,编码112个氨基酸;编码的CmERF12蛋白与拟南芥中AtERF12蛋白相似度较高。组织特异性表达分析,发现CmERF12基因在败育胚胎及茎中表达量较高。构建了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)融合表达载体,基因枪法转化洋葱表皮细胞。亚细胞定位分析显示CmERF12定位在细胞核中。构建了酵母效应质粒pDEST-GBKT7-CmmERF12,并进行转录激活活性验证,结果显示,CmERF12均不具有转录激活活性。3.采用叶盘法,以‘雨花落英’叶片为外植体,通过调节激素配比,研究不同比例的6-BA和NAA对叶盘再生的影响,从而筛选出叶片离体再生最高效快速的体系。结果表明:组培苗不同苗龄以及外源植物激素配比对‘雨花落英’叶盘再生都具有显著的影响。当组培苗苗龄为30 d时,其叶片再生率明显高于苗龄为25 d和40 d的组培苗叶片。继代培养40 d后的组培苗在各类再生培养基上的再生频率均低于65%;苗龄为25 d的组培苗叶片,虽然在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基上再生率达到80%,高于30d的组培苗,但是在培养后期,再生芽出现不同程度的玻璃化,因此不适合以此作为‘雨花落英’再生条件。以苗龄为30 d的组培苗幼嫩叶片为外植体,调节6-BA和NAA的比例,发现当6-BA浓度一定时,增加NAA的浓度,则不定芽的再生率提高;当6-BA的浓度提高到3.0 mg/L时,叶盘再生率下降,并且再生芽出现不同程度的玻璃化现象。综合各项指标,发现当用于实验的组培苗苗龄为30 d,再生培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.8 mg/L时,叶盘再生率最高,达91.11%,同时平均芽数高达5.90。4.在获得最佳再生培养基的基础上,通过筛选潮霉素、羧苄青霉素的浓度,探索预培养、延迟培养等遗传转化条件对转化效率的影响,并通过调整培养条件,使玻璃化苗恢复为正常苗,最终初步建立了‘雨花落英’遗传转化体系,获得转基因菊花。结果表明:‘雨花落英’叶盘对潮霉素的反应较为敏感,潮霉素叶盘筛选的最适选择压为8-10 mg/L,生根筛选最适浓度为11 mg/L;羧苄青霉素对农杆菌有较强的抑制作用,在本试验中,设置延迟培养基中羧苄青霉素最适浓度为400 mg/L,此时愈伤长势良好,且农杆菌被完全抑制;潮霉素和羧苄青霉素均采取逐步降低选择压的方法,以降低对叶盘的影响。‘雨花落英’最优的遗传转化组合为:预培养2 d,侵染7 m

关键词：菊花胚胎败育 miRNA 基因表达再生和遗传转化 CmERF12

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四倍体刺槐胚胎败育及其挽救技术研究

四倍体刺槐胚胎败育及其挽救技术研究

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作者：贺佳玉北京林业大学

学位级别：硕士

以四倍体刺槐胚珠和成熟种胚为材料,探讨了胚胎发育、败育与内源激素含量变化的关系,以及成熟种胚的变异和生理生化特性,并通过离体组织培养技术进行了挽救。结果表明: (1)四倍体刺槐幼胚在授粉后10d和100d时败育现象明显,败育率可达60%... 详细信息

以四倍体刺槐胚珠和成熟种胚为材料,探讨了胚胎发育、败育与内源激素含量变化的关系,以及成熟种胚的变异和生理生化特性,并通过离体组织培养技术进行了挽救。结果表明: (1)四倍体刺槐幼胚在授粉后10d和100d时败育现象明显,败育率可达60%～70%,30d时败育率最低,仅为27%,败育主要发生在前期和后期。由胚珠横径和重量生长曲线看出:生长旺盛期出现在花后15d到50d,直至55d基本趋缓。 (2)整个发育过程中,正常胚珠中ABA、IAA、GA3含量5d时达到峰值,随后呈下降趋势,但IAA和GA3含量在30～70d有所回升,败育胚珠中ABA含量在胚胎发育后期持较高水平,IAA和GA3含量则降到最低点。败育胚珠中ABA/(IAA+GA3)始终高于正常胚珠。 (3)对不同胚龄的幼胚进行离体培养挽救试验,结果表明:荚果用70%乙醇浸泡60s,灭菌效果最佳,污染率降至9.4%;胚珠的适宜离体培养时期为授粉后30d,即败育率最低和胚珠生长最旺盛时期,萌动率为47.7%;适宜萌动培养基为Nitsch+6-BA 0.5mg/L+ IBA 2mg/L +GA3 0.5mg/L,萌动率最高达63.6%;幼胚诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+ 2,4-D 3.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L,诱导率为38.6%;较好的分化培养基为MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 3.0mg/L,初步诱导出了不定芽,分化率最高为16%;愈伤组织切片结果表明,四倍体刺槐幼胚愈伤组织的增殖生长以内起源为主。 (4)四倍体刺槐种子有胚率在37.77%,归纳为6类畸形胚,畸形种胚率92.31%,;四倍体和二倍体刺槐种胚在可溶性蛋白含量、丙二醛含量、过氧化物酶活性及种胚活力方面存在明显差异,而且种胚萌发的条件与其密切相关。通过倍性鉴定发现有活力的实生胚仍然是四倍体。 (5)对成熟种子和种胚进行了离体培养挽救试验,结果表明:经10%H2O2 24h、5mg/L GA3 6h、7mg/L NAA 6h,处理后接种到MS或1/2MS培养基上,平均萌发率为5.5%、最高达6.0%。成熟种胚接种到培养基上,7d后有小部分种子胚萌发。

关键词：四倍体刺槐胚胎败育内源激素胚离体培养挽救

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荔枝胚胎败育与胚珠内源激素关系的研究

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热带作物学报 2000年第3期21卷 34-38页

作者：陈伟吕柳新叶陈亮叶明志福建农业大学植物生物学教研室 350002 福建农业大学园艺系福州350002

研究了绿荷包（胚胎完全败育品种）和乌叶（胚胎发育正常品种）荔枝胚珠中内源激素和胚胎发育的关系，结果表明：绿荷包胚珠中ＡＢＡ含量与ＡＢＡ／（ＩＡＡ、ＧＡ１＋３）和ＡＢＡ／（ＺＲｓ＋ＤＨＺＲｓ＋ｉＰＡｓ）比值在胚胎败育发... 详细信息

研究了绿荷包（胚胎完全败育品种）和乌叶（胚胎发育正常品种）荔枝胚珠中内源激素和胚胎发育的关系，结果表明：绿荷包胚珠中ＡＢＡ含量与ＡＢＡ／（ＩＡＡ、ＧＡ１＋３）和ＡＢＡ／（ＺＲｓ＋ＤＨＺＲｓ＋ｉＰＡｓ）比值在胚胎败育发生时期保持较高水平，ＩＡＡ、ＧＡ１＋３和ＣＴＫ含量则在花后７ｄ迅速下降，并在败育期处于较低水平。乌叶胚珠中ＡＢＡ含量在花后７ｄ即急剧下降，其含量与以上２个比值在各个胚胎发育阶段均始终明显低于绿荷包，但前者的ＩＡＡ、ＧＡ１＋３和ＣＴＫ含量在胚胎发育早期则远高于后者，其中尤以ＣＴＫ含量差异显著。ＺＲｓ、ＤＨＺＲｓ和ｉＰＡｓ含量有不同变化特点，对胚胎败育亦有不同影响。

关键词：荔枝胚珠胚胎败育内源激素

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作者：李元苏州大学

学位级别：硕士

成熟胚是植株个体的雏形,胚胎发育是形成植株的基础。多年来,科学家们对影响植物胚胎发生的基因展开了广泛的研究,其中的一些基因与胚胎早期形态建成相关。在鉴定这些基因的过程中发现了至少250个胚缺陷基因（embryo-defective genes, E... 详细信息

成熟胚是植株个体的雏形,胚胎发育是形成植株的基础。多年来,科学家们对影响植物胚胎发生的基因展开了广泛的研究,其中的一些基因与胚胎早期形态建成相关。在鉴定这些基因的过程中发现了至少250个胚缺陷基因（embryo-defective genes, EMBs）为胚正常发育所不可或缺。这些基因的功能各异,分别参与细胞生长、代谢、转运、转录和翻译等过程。为了研究影响胚胎发育过程基因的功能,本研究从拟南芥T-DNA插入突变体库中分离到了一个种荚中有1/4胚胎败育的突变体,命名为ed1（ embryo defective 1）,ED1功能缺失引起胚胎在早期球形胚阶段停止发育,最终败育。此外,ed1突变体除了胚胎分裂异常,胚乳也有异常,胚乳核数目减少,体积增大,胚乳核分裂中停滞于中期。用染色体步行的方法我们扩增T-DNA插入的侧翼序列发现T-DNA插入在At4g24900的第4个内含子上。ED1编码一个功能未知的蛋白,氨基酸序列分析表明它含有类似C2H2的结构域。在植物中是保守的,由于ed1是胚胎致死的突变体,我们无法得到纯合突变体植株,所以该基因突变对植物体生长发育的影响仍不清楚。我们对这一未知功能的蛋白进行表达模式分析,发现其主要表达于幼嫩的叶片、种荚和成熟植株叶柄,花柄,茎等微管组织部位;在胚珠中的胚胎和胚乳均有广泛表达,这一结果与ED1在胚胎和胚乳中的表达与其参与胚胎和胚乳发育的功能相吻合。在对其转录水平进行分析时发现其至少有九种不同的转录本。用GFP融合蛋白做亚细胞定位发现ED1基因定位在细胞核。最后用酵母双杂交的方法筛选互作的蛋白,初步筛选到了14个蛋白,其中有ACT12、MYB7、MPK18、ubiquitin 10等蛋白,这一结果还有待验证。以上这些结果表明,拟南芥ED1基因突变导致胚胎和胚乳发育异常进而造成胚胎败育,说明ED1基因在拟南芥胚胎发育的早期发育过程中起着重要作用。

关键词：胚胎发生胚乳发育拟南芥胚胎败育

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