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骨形成蛋白家族成员2、7对小鼠胚胎肝干细胞分化的体外研究

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解放军医学杂志 2013年第4期38卷 260-264页

作者：陈聪康权罗庆迭小红田雯重庆儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室、儿科学重庆市重点实验室、重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地、重庆医科大学附属儿童医院肝胆外科 400014

目的探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第... 详细信息

目的探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第1、4、7天通过检测荧光素酶报告基因读数,在第7天通过细胞免疫荧光染色,观察肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达情况;并在第4、7、10天通过PAS染色、尿素氮合成功能检测,观察诱导后HP14.5向肝细胞方向的分化成熟度。结果 BMP2组、HGF组荧光素酶读数较GFP对照组明显上升;免疫荧光染色显示,诱导7d后BMP2组、HGF组细胞质内表达肝细胞特有的ALB,而GFP对照组几乎无表达;糖原染色可见BMP2组、HGF组胞质存在紫红色颗粒,呈阳性反应;尿素合成功能检测显示BMP2组、HGF组培养液中尿素氮随时间而升高。BMP7组诱导后,细胞免疫荧光染色、荧光素酶活性、PAS染色和尿素合成检测均呈阴性或弱阳性反应。结论 BMP2具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞分化的作用,并初步具备肝细胞的合成分泌功能,而BMP7对其无诱导作用。

关键词：骨形态发生蛋白质类胚胎肝干细胞细胞分化重组腺病毒

Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用

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细胞与分子免疫学杂志 2013年第12期29卷 1277-1280页

作者：张锡峰胡代曦芦永良冯涛黄佳祎重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室重庆400016

目的研究Wnt3a对ELSC14.5小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体系统(Ad-GFP-Wnt3a)转入小鼠ELSC14.5细胞,以Ad-GFP组为空白对照组,Ad-wnt3a组为实验组。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blo... 详细信息

目的研究Wnt3a对ELSC14.5小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体系统(Ad-GFP-Wnt3a)转入小鼠ELSC14.5细胞,以Ad-GFP组为空白对照组,Ad-wnt3a组为实验组。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测Wnt3a及凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Mcl-1的mRNA和蛋白的表达;Hoechst33258染色法结合annexin-PE/7-ADD法检测细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3a在ELSC14.5细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3a能高效感染ELSC14.5细胞。与对照组相比,抗凋亡因子Bcl-2、mcl-1的mRNA和蛋白的表达显著升高(P细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的细胞数量很少,细胞凋亡率降低。结论 Wnt3a通过上调Bcl-2家族中抗凋亡因子和下调促凋亡因子来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,延长其生存。

关键词：胚胎肝干细胞抗凋亡 Wnt3a

分泌性卷曲相关蛋白3影响小鼠胚胎肝干细胞体外成熟分化的实验研究

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华中科技大学学报（医学版） 2011年第3期40卷 268-273页

作者：贺引蒋昌科何昀冯涛毕杨重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室重庆400014 重庆市第九人民医院儿科重庆400700 重庆医科大学附属永川医院儿科重庆402160

目的检测不同发育阶段的肝组织中Wnt信号拮抗因子分泌性卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related pro-tein,SFRP)的表达,并探讨SFRP3对胚胎肝干细胞体外成熟分化的影响。方法分离胚胎12.5 d至出生后4周共9个阶段的小鼠肝组织,RT-PCR检测... 详细信息

目的检测不同发育阶段的肝组织中Wnt信号拮抗因子分泌性卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related pro-tein,SFRP)的表达,并探讨SFRP3对胚胎肝干细胞体外成熟分化的影响。方法分离胚胎12.5 d至出生后4周共9个阶段的小鼠肝组织,RT-PCR检测5种SFRPs在肝组织及胚胎肝干细胞14.5(embryonic liver stem cells,ELSC)中的表达水平。腺病毒SFRP3感染小鼠胚胎肝干细胞,地塞米松(dexamethasone,Dex)联合肝细胞生长因子(hepatic growthfactor,HGF)诱导肝细胞分化,诱导后第3、6、9、12天检测白蛋白启动子荧光素酶报告基因(ablumin promoter-GaussiaLuciferase,ALB-GLuc)活性,诱导后第12天,RT-PCR和Western blot检测肝脏相关基因表达,PAS染色检测糖原合成功能。结果 SFRP1、4、5在不同阶段肝组织中的表达无明显差异,SFRP2和SFRP3只在胚胎期肝组织中表达,随后很快消失。ELSC14.5细胞中,SFRP2高表达而SFRP3表达很低。Dex联合HGF可有效诱导ELSC14.5细胞的体外成熟分化,与对照组相比,SFRP3过表达可降低成熟肝细胞标志白蛋白(albumin,ALB)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase,TAT)、载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(UDP-glucuronosyl transferase,UGT1A)的水平,增强肝干细胞标志Delta蛋白(Delta-like protein,DLK)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)的表达,并抑制糖原合成功能。结论 SPRF3在肝脏发育过程中表达水平迅速降低,并显著抑制胚胎来源的肝干细胞体外成熟分化,其下调可能是肝脏发育和肝细胞成熟分化的一个重要因素。

关键词：胚胎肝干细胞分化抑制分泌性卷曲相关蛋白3 Wnt信号拮抗因子

肌成纤维细胞促进小鼠胚胎肝干细胞的增殖和分化

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中国细胞生物学学报 2014年第7期36卷 927-933页

作者：谢言杜文俊李德卫重庆医科大学附属第一医院肝胆外科重庆400016

移植细胞的增殖和分化需要微环境支持。作为最重要的微环境成分,肌成纤维细胞在肿瘤的生长过程中发挥着重要作用。该实验Hepa1-6肿瘤细胞上清液在体外激活成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,探讨肌成纤维细胞上清对小鼠胚胎肝干细胞(embryon... 详细信息

移植细胞的增殖和分化需要微环境支持。作为最重要的微环境成分,肌成纤维细胞在肿瘤的生长过程中发挥着重要作用。该实验Hepa1-6肿瘤细胞上清液在体外激活成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,探讨肌成纤维细胞上清对小鼠胚胎肝干细胞(embryonic hepatic stem cells,EHSCs)HP14.5增殖和分化的影响。实验将EHSCs HP14.5分为三组:DMEM培养液处理组(DMEM组)、成纤维细胞上清液处理组(CMFb组)及肌成纤维细胞上清液处理组(CMAFb组)。MTT法绘制三组HP14.5细胞生长曲线图,免疫荧光法及Real-time PCR法检分别测白蛋白(albumin,ALB)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)的蛋白及mRNA表达情况,PAS染色法检测糖原合成状况。MTT法检测显示,CMAFb组胚胎肝干细胞增殖明显速度较其他两组快。免疫荧光染色及Real-time PCR结果显示,HP14.5培养5 d后,CMAFb组ALB和CK18的蛋白及mRNA表达水平以及糖原合成水平显著高于CMFb组及DMEM组,而AFP蛋白和mRNA表达水平明显降低。该实验表明,Hepa1-6激活的成纤维细胞能促进胚胎干肝细胞的增殖以及分化为有功能的成熟肝细胞。

关键词：肌成纤维细胞胚胎肝干细胞白蛋白细胞角蛋白18 甲胎蛋白

胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化临床疗效观察

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吉林医学 2013年第26期34卷 5335-5336页

作者：陆长春蔺咏梅韩洁丁敏侠陕西省汉中市汉中3201医院感染性疾病科陕西汉中723000 陕西省汉中市汉中3201医院功能科陕西汉中723000

目的:观察胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化的临床疗效和安全性。方法:将48例失代偿期肝硬化患者随机分为治疗组22例和对照组26例,均使用保守基础治疗,治疗组同时使用胚胎肝干细胞移植术(采用介入方法分别1/3注入脾脏,2/3注入肝脏),1次/4... 详细信息

目的:观察胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化的临床疗效和安全性。方法:将48例失代偿期肝硬化患者随机分为治疗组22例和对照组26例,均使用保守基础治疗,治疗组同时使用胚胎肝干细胞移植术(采用介入方法分别1/3注入脾脏,2/3注入肝脏),1次/4周,每次细胞数1.0×108,共3次。治疗24周后评价两组临床疗效及Child-Pugh评分情况。结果:治疗组胚胎肝干细胞对失代偿期肝硬化肝功能复常显示良好治疗效应,临床症状有不同程度改善。治疗组总有效率为86.4%,对照组为73%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组显效率13.6%,明显高于对照组的0%(P胚胎肝干细胞治疗失代偿期肝硬化对临床症状的改善和肝功能恢复有较好治疗作用,短期安全性可控,远期尚需临床进一步观察。

关键词：胚胎肝干细胞失代偿期肝硬化疗效观察

Hepa 1-6介导成纤维细胞促进胚胎肝细胞的增殖和分化

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Hepa 1-6介导成纤维细胞促进胚胎肝细胞的增殖和分化

作者：谢言重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：肌成纤维细胞上清液配置成的条件培养基，处理胚胎肝干细胞，诱导其增殖分化。探讨激活后的成纤维细胞是否可以促进胚胎肝细胞分化为有功能的成熟肝细胞，拟为激活的成纤维细胞与胚胎肝细胞联合移植提供理论依据。方法：用Hepa1-... 详细信息

目的：肌成纤维细胞上清液配置成的条件培养基，处理胚胎肝干细胞，诱导其增殖分化。探讨激活后的成纤维细胞是否可以促进胚胎肝细胞分化为有功能的成熟肝细胞，拟为激活的成纤维细胞与胚胎肝细胞联合移植提供理论依据。方法：用Hepa1-6上清液，体外激活提取的成纤维细胞，收集普通成纤维细胞上清及激活后的肌成纤维细胞上清，分别配置成两组条件培养液（CMFb和CMAFb）。HP14.5胚胎肝细胞培养分为三组：DMEM普通培养液处理组（DMEM组）、CMFb培养液处理组（CMFb组）及CMFAb培养液处理组（CMAFb组）。免疫荧光法检测成纤维细胞α-SMA的蛋白表达情况;MTT法测定三组HP14.5胚胎肝干细胞细胞生长情况并绘制曲线图;免疫荧光法及Real-Time PCR法分别检测三组HP14.5胚胎肝细胞中白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白18（CK18）等肝细胞特殊标记物的蛋白及mRNA表达情况，PAS糖原染色法检测三组HP14.5胚胎肝细胞中糖原分泌的功能情况。结果：免疫荧光法显示Hepa1-6肝癌细胞上清液在体外能将成纤维细胞激活为以α-SMA为特殊标志物的活化成纤维细胞;MTT法检测结果显示CMFAb组胚胎肝细胞增殖速度较其他两组更快。免疫荧光染色及Real-Time PCR结果显示，三组HP14.5在分别培养5天，CMFAb组ALB和CK18的蛋白及mRNA表达水平以及糖原合成水平显著高于CMFb组及DMEM组，而DMEM组胚胎肝细胞AFP的蛋白和mRNA表达水平明显高于CMFb组和CAFAb组胚胎肝细胞。显示CMFAb组HP14.5胚胎肝细胞分化成有功能的肝细胞能力强于CMFb组和DMEM组。结论：成纤维细胞Hepa1-6肿瘤细胞上清液在体外激活为肌成纤维细胞;激活后的肌成纤维细胞能刺激胚胎肝细胞增殖并转分化为以ALB及CK18为特殊标记物的成熟肝细胞，糖原染色显示，肝肝细胞分化后有相关成熟肝细胞的功能。该结果为提高移植肝细胞的长期生存和促进其分化为成熟肝细胞的能力提供了一定的理论基础。

关键词：肌成纤维细胞胚胎肝干细胞白蛋白细胞角蛋白18 甲胎蛋白

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肝干细胞研究进展

第二军医大学学报 2017年第4期38卷 493-500页

作者：陆炼于兵胡以平第二军医大学基础部细胞生物学教研室上海200433

肝干细胞是具有自我更新能力和分化为成熟肝细胞与胆管上皮细胞的双向分化潜能的原始细胞。肝干细胞不仅参与了肝脏的稳态维持、损伤修复和肝再生,而且在肝脏疾病的细胞治疗、人工生物肝及肝导向基因治疗中有着巨大的应用潜能。本文对... 详细信息

肝干细胞是具有自我更新能力和分化为成熟肝细胞与胆管上皮细胞的双向分化潜能的原始细胞。肝干细胞不仅参与了肝脏的稳态维持、损伤修复和肝再生,而且在肝脏疾病的细胞治疗、人工生物肝及肝导向基因治疗中有着巨大的应用潜能。本文对几种主要类型的肝干细胞及它们的来源、分子标志物等进行了综述。

关键词：干细胞胚胎肝干细胞成体肝干细胞肝再生

具有双向分化潜能的鼠胎肝干细胞的分离、培养及鉴定

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重庆医学 2016年第12期45卷 1666-1669页

作者：于黎明陈姝何松重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010 重庆医科大学附属第二医院血液科 400010

目的优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞（LSC）的方法,并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞（FLSC）,以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定FLSC的增殖,通过添加二甲... 详细信息

目的优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞（LSC）的方法,并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞（FLSC）,以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定FLSC的增殖,通过添加二甲基亚砜（DMSO）和HGF等诱导干细胞分化。结果分离后的FLSC 24h内贴壁,卵圆形,排列紧密,1~2周内活化,CD133、CD49f、EPCAM的阳性率分别为（97.95±1.21）%、（92.71±3.49）%、和（50.73±3.45）%,表达甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK19）;诱导分化后糖原染色（PAS）法染色可见红色糖原颗粒,表达清蛋白（ALB）、肝细胞核因子4α（HNF-4α）。结论联合密度梯度离心和差异性贴壁法成功分离FLSC,分离后的FLSC干性强,增殖能力强,具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。

关键词：胚胎肝干细胞离心法,梯密度细胞,培养的细胞分化