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小鼠胎肝基质细胞体外扩增骨髓来源的LTC-IC

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生物工程学报 2003年第4期19卷 450-455页

作者：苑春慧刘兵吴英张毅毛宁军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室北京100850

基质细胞是胎肝造血微环境的主要成分 ,参与造血干祖细胞的自我更新、增殖分化的调控。为了研究小鼠胎肝基质细胞在造血微环境中的功能 ,采用转染SV40大T抗原基因的方法建立了小鼠胚胎期第 12 5天 (Embry onicday 12 5 ,E12 5d)胎... 详细信息

基质细胞是胎肝造血微环境的主要成分 ,参与造血干祖细胞的自我更新、增殖分化的调控。为了研究小鼠胎肝基质细胞在造血微环境中的功能 ,采用转染SV40大T抗原基因的方法建立了小鼠胚胎期第 12 5天 (Embry onicday 12 5 ,E12 5d)胎肝基质细胞系A4、B3 ,并进一步鉴定基质细胞系的一般细胞生物学特性和造血支持功能。结果 :A4、B3为细胞形态、生长行为以及表面分子表达不同细胞系 ,二者均可维持骨髓源长期培养启动细胞 (Long termculture initiatingcell,LTC IC)至少 4周并且有不同程度的扩增LTC IC能力 ,其中B3扩增LTC IC的能力是A4的8 3倍。外源性细胞因子组合SCF +IL 3 +IL 6+Epo在本实验体系中不影响LTC IC数量的维持和扩增。暗示E12 5d胎肝造血微环境中基质细胞的功能是不同的。

关键词：小鼠胎肝基质细胞体外扩增骨髓 LTC-IC 造血器官

小鼠胎肝基质细胞系MFLC克隆的建立、鉴定及细胞因子分泌

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中华微生物学和免疫学杂志 1997年第1期17卷 43-46页

作者：刘倩刘祝公张国荣陈慰峰北京医科大学免疫学系

用体外长期培养的方法建立了小鼠胎肝基质细胞系ＭＦＬＣ，此细胞系是以上皮细胞为主的混合细胞系，能分泌多种细胞因子。为精确分析胎肝基质细胞在Ｔ细胞发育中的作用，对此细胞系进行了克隆化培养，共获得１１个克隆。对这些克隆进行... 详细信息

用体外长期培养的方法建立了小鼠胎肝基质细胞系ＭＦＬＣ，此细胞系是以上皮细胞为主的混合细胞系，能分泌多种细胞因子。为精确分析胎肝基质细胞在Ｔ细胞发育中的作用，对此细胞系进行了克隆化培养，共获得１１个克隆。对这些克隆进行角蛋白染色、倍增时间测定、染色体检查以及ＩＬ－６、趋化因子分泌水平的检测，结果表明，这些克隆在细胞学特性以及细胞因子的分泌上均有差异。

关键词：胎肝基质细胞细胞系白细胞介素6 克隆干细胞

小鼠胎肝基质细胞系MFLC自发分泌多种细胞因子

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实验生物学报 1997年第4期30卷 355-361页

作者：刘倩刘祝公陈慰峰张平夏庞学文钱晓萍北京医科大学免疫学系北京100083

在无外源刺激条件下,我室所建小鼠胎肝基质细胞系MFLC可自发分泌多种类型细胞因子,其中IL-6及化学趋化因子水平较高,GM-CSF水平较低,但未检测到IL-3及IL-7活性。此细胞上清对小鼠骨髓造血干细胞有明显的促集落形成效应,并呈现剂量依赖关... 详细信息

在无外源刺激条件下,我室所建小鼠胎肝基质细胞系MFLC可自发分泌多种类型细胞因子,其中IL-6及化学趋化因子水平较高,GM-CSF水平较低,但未检测到IL-3及IL-7活性。此细胞上清对小鼠骨髓造血干细胞有明显的促集落形成效应,并呈现剂量依赖关系,所形成的集落以CFU-GMM及CFU-GM为主;此细胞上清还促进5-Fu耐受小鼠骨髓造血干细胞的集落形成,提示上清中存在SCF样活性成份。上述结果表明,MFLC的建立有利于分析干细胞在胎肝内如何向pro-T细胞分化发育的机理并有利于阐明细胞因子网络调节在其中的作用。

关键词：胎肝基质细胞自发分泌细胞因子集落

人胎肝基质细胞培养上清液中造血生长因子的分析

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中国应用生理学杂志 1990年第3期6卷 214-218页

作者：赵士富劳妙芬吴祖泽北京放射医学研究所

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d... 详细信息

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d之久。培养过程中,对不同时间收集的培养上清液进行测试的结果表明,这些贴壁细胞可以不断地释放多种造血活性物质。在100d培养过程中,上清液中始终都可以检出CFU-S增殖刺激物活性。培养第24天的上清液中还可检出BPF和GM-CSF活性。这些造血活性物质对CFU-S的生理状态和祖细胞的增殖与分化有着深刻的影响。但是在培养上清液中未检出IL-3样活性物质。

关键词：胎肝基质细胞上清液造血生长因子

小鼠胎肝基质细胞造血刺激因子体外生物活性研究

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中国应用生理学杂志 1994年第3期10卷 242-245页

作者：胡维明陈家佩陶来宝齐淑华赵士富北京放射医学研究所

本实验对基质细胞造血刺激因子－１（ＳＨＦ－１）的体外生物活性进行了研究。结果表明，ＳＨＦ－１可刺激小鼠骨髓ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｍｉｘ集落的形成，它产生的这些广泛造血刺激作用是其自身所具活性的... 详细信息

本实验对基质细胞造血刺激因子－１（ＳＨＦ－１）的体外生物活性进行了研究。结果表明，ＳＨＦ－１可刺激小鼠骨髓ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｍｉｘ集落的形成，它产生的这些广泛造血刺激作用是其自身所具活性的直接影响。正常小鼠骨髓细胞与ＳＨＦ－１在体外孵育４ｈ，其中ＣＦＵ－Ｓ的自杀率可提高约１０％，显示它对造血干细胞也有诱导增殖作用。

关键词：胎肝基质细胞造血刺激因子活度

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胎肝-骨髓程序移植提高移植效果

辐射研究与辐射工艺学报 2000年第1期18卷 7-11页

作者：项莺松杨如俊杨平蔡建明闵锐第二军医大学放射医学研究室上海200433

为进一步提高骨髓移植效果。以昆明种小鼠急性放射病为模型，进行了胎肝－骨髓程序移植（ＦＬ－ＢＭＳＴ）后小鼠活存及造血重建、急性移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）的研究。胎肝－骨髓程序移植１ｘ１０６个骨髓细胞时，于照射后第１... 详细信息

为进一步提高骨髓移植效果。以昆明种小鼠急性放射病为模型，进行了胎肝－骨髓程序移植（ＦＬ－ＢＭＳＴ）后小鼠活存及造血重建、急性移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）的研究。胎肝－骨髓程序移植１ｘ１０６个骨髓细胞时，于照射后第１７ｄ外周血白细胞、骨髓有核细胞计数接近正常，ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｆ、ＣＦＵ－Ｓ已达正常；ＧＶＨＤ较一次骨髓移植组轻；活存率达６０％，显著高于一次骨髓移植组。胎肝-骨髓程序移植既充分利用了每次腾出的“龛位”（Ｎｉｃｈｅ），又通过移植胎肝基质细胞改善了“龛位”，增加了“龛位”，从而增加了干、祖细胞的植入并加快增殖分化，减少了移植细胞数，提高了移植效果；是一种较好的移植新方法。

关键词：骨髓移植胎肝基质细胞造血干细胞

不同造血微环境对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响

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中南大学学报（医学版） 2007年第6期32卷 992-996页

作者：赵惠萍赵海军林戈周菂刘天成卢光琇中南大学生殖与干细胞工程研究所

目的:通过观察人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化诱导效率,探讨不同造血微环境对造血发生的影响。方法:本实验诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞的方法采用两步法:先用细胞因子培养形成5d... 详细信息

目的:通过观察人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化诱导效率,探讨不同造血微环境对造血发生的影响。方法:本实验诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞的方法采用两步法:先用细胞因子培养形成5d的拟胚体,然后再模拟体内造血发生的微环境,分别用人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞诱导拟胚体10d,通过流式细胞术检测细胞的flk,CD34和CD45表面抗原表达情况,观察3种基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响。结果:5d拟胚体与卵黄囊基质细胞接触培养10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别1.80%±0.56%,1.30%±0.14%,1.05%±0.63%;与胎肝基质细胞接触培养10d生成的细胞表达为flk,CD34,CD45百分率分别为34.0%±25.45%,38.4%±24.8%,72.6%±25.7%;与骨髓基质细胞接触培养10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为2.50%±1.48%,3.20%±0.56%,1.65%±0.21%;5d拟胚体自发分化10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为0.30%±0.07%,0.65%±0.07%,0.15%±0.07%。与自发分化10d比较,3种基质细胞与5d拟胚体接触培养,均能够促进拟胚体向造血细胞的分化,且胎肝基质细胞诱导的效率显著优于其他两种基质细胞(P(0.05)。结论:与卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞比较,胎肝基质细胞更有利于诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化。

关键词：胚胎干细胞造血细胞卵黄囊基质细胞胎肝基质细胞骨髓基质细胞

体外诱导人脐带血造血干细胞分化为脱核红细胞及功能鉴定的实验研究

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体外诱导人脐带血造血干细胞分化为脱核红细胞及功能鉴定的实验研...

作者：王若永中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

血细胞输注和造血干细胞移植是临床上治疗严重创伤、恶性血液性疾病、重症再生障碍性贫血、免疫缺陷综合征、地中海贫血等疾病的有效手段。目前血源紧张报道非常普遍,因输血引起的疾病传播严重威胁着人们的健康,在献血志愿者之外寻求安... 详细信息

血细胞输注和造血干细胞移植是临床上治疗严重创伤、恶性血液性疾病、重症再生障碍性贫血、免疫缺陷综合征、地中海贫血等疾病的有效手段。目前血源紧张报道非常普遍,因输血引起的疾病传播严重威胁着人们的健康,在献血志愿者之外寻求安全、可靠、充足、有效的血液来源是从事输血研究工作的科研人员的职责和追求。干细胞领域的研究给人们提供了一个潜在血液替代来源的选择。干细胞具有自我更新和高度分化潜能,可以通过细胞分裂产生表型与基因型完全相同的子细胞以维持自身群体大小,同时又可以进一步分化产生至少一种类型高度分化的子细胞。造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSCs)一直以来是科学家们研究的重要领域之一,很多有关干细胞特性和应用的探讨都是从HSCs深入和拓展的。由于HSCs在机体的比例很低且体外扩增及干性维持困难,其数量成为限制体外诱导成熟红细胞应用的瓶颈。但作为血细胞发育过程中一个关键环节,HSCs对于研究红细胞的定向分化具有非常重要的意义。随着干细胞研究及其相关领域生物学技术的快速发展,尤其是以ES细胞为启动细胞的HSCs工程为临床输血和干细胞的移植带来了新希望。ES细胞具有理论上无限的自我更新和分化为机体所有类型细胞的能力,以ES为启动细胞可使我们可以获得足够的早期造血干/祖细胞进行诱导,从源头上解决体外由人造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSCs)诱导红细胞种子细胞总量不足的问题。由hES细胞诱导红细胞是一个复杂的过程,有许多关键性技术问题需要解决,包括:hES细胞在培养过程中的干性维持,hES细胞向造血干细胞特异性诱导分化及其效率的提高;造血干细胞向红细胞特异性分化体系的优化;红细胞的脱核成熟及功能鉴定;诱导获得的红细胞的安全性评价等。针对如上问题,我们首先建立了一个体外诱导脐带血造血干/祖细胞向红系细胞特异性分化的方法,并通过与特定饲养层细胞共培养,最终得到了脱核的红细胞。与此同时,我们还鉴定了诱导产生的红细胞部分功能和安全性,并在此基础之上,以hES细胞为启动细胞的进行了造血诱导的初步探索,得到了一定比例的造血干细胞,为最终由hES细胞诱导成熟的红细胞奠定了技术基础。本课题研究内容由以下三部分组成。第一部分脐带血造血干细胞的分离、红系诱导分化及脱核首先,我们采用了免疫磁珠分选法,从脐带血单个核细胞(mononuclear cells, MNCs)分离出脐带血HSCs,分离的HSCs占单个核细胞比例为0.82.86%,与文献报道的相当,流式细胞术鉴定其纯度在90%以上。我们采取了无血清悬浮培养体系将HSCs向红系特异性诱导。诱导体系内添加了包括干细胞因子(stem cell factor,SCF)、促红细胞生成素(Erythropoietin,Epo)、类胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor I,IGF-1)以及地塞米松(Dexamethasone,DXM)等功能成分。通过7天的诱导,可获得500%的红系祖细胞,在诱导10天之后,红系细胞的比例可达90%。经显微镜下形态及生长状态观察、瑞氏——吉姆萨染色、流式细胞术检测细胞表面标志和细胞周期、半固体克隆、RT-PCR检测红系相关基因的表达等方法对其红系分化的效果进行了评估。结果表明,我们实验中所建立的这一方法可以特异性的诱导脐带血造血干细胞向红系细胞定向分化。造血微环境在红细胞的脱核过程中发挥重要作用,而基质细胞则是造血微环境中发挥这种作用的关键的成分之一。人胚胎第91周,造血中心转移至肝脏。肝脏是胎儿时期主要的造血器官,以红系造血为主。处于这一阶段的胎肝组织对于造血特别是红系发育具有非常重要的意义。经患者知情同意,我们分离14周龄的人胎肝基质细胞,RT-PCR结果表明,此细胞表达多种促进造血发育的基因,同时还表达TGF-β等促进红细胞成熟的基因。我们以其作为饲养层细胞与红系祖细胞共培养诱导脱核。检测结果表明,在共培养条件下,红系细胞继续分化成熟,晚期红细胞表面标志的表达90%以上,较之于共培养之前显著增加。而瑞氏——吉姆萨染色后观察到的脱核红细胞则直观的证明了本体系可使红系细胞脱核成熟。第二部分诱导分化的红系细胞的功能鉴定血红蛋白(Hb)是红细胞的主要成分,同时也是红细胞运输氧气的功能分子。Hb是红细胞行使功能的结构基础,携氧能力是红细胞行使功能的具体体现。本部分实验中,我们对红细胞气体运输功能进行了检测。随着培养时间的延长,血红蛋白在总蛋白中的比例由诱导之初几乎没有表达升至第5天的2%,第10天6%,之后维持在一个相对稳定的水平,经共培养之后第8天升至10%。说明共培养体系可增加Hb含量,促进细胞的成熟。与此同时,我们以P50仪检测了红系细胞的携氧能力,这一方法也是评价其他红细胞代用

关键词：造血干细胞胎肝基质细胞共培养红系祖细胞脱核红细胞胚胎干细胞