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胆红素氧化酶的纯化及某些性质的研究

工业微生物 1991年第4期21卷 8-11页

作者：潘彬唐上华

胆红素氧化酶产生菌的选育及发酵工艺条件的研究

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食品与发酵工业 1997年第2期23卷 22-25,33页

作者：胡军杨军艳张继宏北京市发酵工业研究所北京100022

对胆红素氧化酶产生菌的菌和选育进行了研究。以科研室保藏菌种Mv9201为出发菌株，通过紫外线、硫酸二乙酯单独处理和复合诱变，从353株突变株中筛选出一株高产菌株MyrotheciumverrucariaMv9352，并对其产酶条件进行了研究。以20％的土... 详细信息

对胆红素氧化酶产生菌的菌和选育进行了研究。以科研室保藏菌种Mv9201为出发菌株，通过紫外线、硫酸二乙酯单独处理和复合诱变，从353株突变株中筛选出一株高产菌株MyrotheciumverrucariaMv9352，并对其产酶条件进行了研究。以20％的土豆汁（含0．25％的葡萄糖和蛋白胨）为发酵培养基，初始pH6～7，摇床转速为140～160r／min，24～26℃培养96h，酶活力可达4．0～4．5u／ml，比出发株的产酶能力提高近4．5倍。

关键词：胆红素氧化酶疣孢漆斑菌菌种选育发酵

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胆红素氧化酶凝胶电泳活性染色法

河北大学学报（自然科学版） 2008年第2期28卷 198-201页

作者：曾伟赵晓瑜倪志华河北大学生命科学学院河北保定071002

胆红素氧化酶能够特异地将胆红素氧化成胆绿素,利用酶与底物的这种特殊关系可以在凝胶上进行底物染色来直接显示酶的活性区带,这种方法称为胆红素氧化酶的活性染色法.这种活性染色可以采用胆红素直接溶入分离胶后电泳(胆红素-PAGE),也... 详细信息

胆红素氧化酶能够特异地将胆红素氧化成胆绿素,利用酶与底物的这种特殊关系可以在凝胶上进行底物染色来直接显示酶的活性区带,这种方法称为胆红素氧化酶的活性染色法.这种活性染色可以采用胆红素直接溶入分离胶后电泳(胆红素-PAGE),也可以在电泳后置于胆红素溶液中染色(PACE-胆红素).其中PAGE-胆红素方法在20 min后即在凝胶上出现深绿色的胆红素氧化酶条带,随着时间延长,凝胶上的绿色酶条带逐渐扩散,最终形成透明条带;而运用胆红素-PAGE的方法则在12 h后才能在凝胶上看见透明的胆红素氧化酶所在的条带.相比之下,前者更为简便、快速、灵敏.

关键词：活性染色胆红素氧化酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

疣孢漆斑菌产胆红素氧化酶条件优化及对染料脱色的研究

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北京林业大学学报 2010年第4期32卷 265-270页

作者：韩旭赵敏卢磊东北林业大学生命科学学院

疣孢漆斑菌代谢产生的胆红素氧化酶在环境保护等领域有较大的应用潜力。为了提高胆红素氧化酶的产量,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,研究培养基中C、N、金属离子及诱导剂对疣孢漆斑菌3.2190产酶的影响。结果表明,在产酶培养基中... 详细信息

疣孢漆斑菌代谢产生的胆红素氧化酶在环境保护等领域有较大的应用潜力。为了提高胆红素氧化酶的产量,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,研究培养基中C、N、金属离子及诱导剂对疣孢漆斑菌3.2190产酶的影响。结果表明,在产酶培养基中,葡萄糖和大豆蛋白胨为最适C源和N源,添加2mmol/L铜离子和0.1mmol/L的诱导剂均可以提高发酵液的酶活。正交试验得到的优化组合为:葡萄糖10g/L,大豆蛋白胨7.5g/L,CuSO41mmol/L,没食子酸0.1mmol/L,优化后发酵液酶活提高了3倍。初步纯化的胆红素氧化酶最适反应温度为40℃,最适pH值为7.5。在1000U/L的酶活下,只需50min就可以降解90%以上100mg/L的染料靛红,显示出胆红素氧化酶在染料废水处理中具有广阔的应用前景。

关键词：胆红素氧化酶疣孢漆斑菌培养基优化染料脱色

胆红素氧化酶诱导产生、分离纯化及对染料降解的研究

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胆红素氧化酶诱导产生、分离纯化及对染料降解的研究

作者：韩旭东北林业大学

学位级别：硕士

疣孢漆斑菌代谢产生的胞外胆红素氧化酶(EC.1.***.3.5)是一种含铜的多酚氧化酶,能氧化胆红素和多种漆酶底物,在环境保护领域有较大的应用潜力。本文对疣孢漆斑菌产胆红素氧化酶的发酵条件和胞外胆红素氧化酶的纯化及其对染料脱色等方面进... 详细信息

疣孢漆斑菌代谢产生的胞外胆红素氧化酶(EC.1.***.3.5)是一种含铜的多酚氧化酶,能氧化胆红素和多种漆酶底物,在环境保护领域有较大的应用潜力。本文对疣孢漆斑菌产胆红素氧化酶的发酵条件和胞外胆红素氧化酶的纯化及其对染料脱色等方面进行了研究。探索疣孢漆斑菌的最佳培养条件为：发酵培养时间4天、培养温度26℃、培养基初始pH6.0、孢子液稀释度10-3、250 mL的三角瓶装100 mL发酵液、土豆汁浓度20%时菌体产酶最佳。采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究培养基中C源、N源、金属离子及诱导剂对疣孢漆斑菌产酶的影响。结果表明在产酶培养基中,葡萄糖和大豆蛋白胨为最适C源和N源,添加2 mmol/L铜离子和0.1 mmol/L的诱导剂均可以提高发酵液的酶活。正交实验得到的优化组合为：葡萄糖10g/L,大豆蛋白胨7.5 g/L,CuSO41 mmol/L,没食子酸0.1 mmol/L,优化后发酵液酶活提高了3倍。经过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤等一系列纯化步骤从350 mL粗酶液中得到2.43 mg纯化的胆红素氧化酶,最终纯化倍数为3.12,总活力回收率为27.92%。由SDS-PAGE电泳图片计算得出纯酶的分子量为68.1kDa, Native PAGE电泳图片是单一条带,所得的纯酶具有较高的纯度。Native PAGE电泳中ABTS染色和胆红素染色说明纯酶可以氧化两种底物,靛红染色表明纯酶可以有效地使染料靛红脱色。纯酶的N端氨基酸序列和飞行质谱(MALDI-TOF-MS)的结果与已报道疣孢漆斑菌的N端氨基酸序列完全一致,N端氨基酸序列为VAQISPQYPMFTVPL。纯酶用胆红素为底物测得最适反应pH7.5,最适反应温度为40℃;以ABTS为底物最适pH为3.4;纯酶25℃时在pH7.5～8.0的缓冲液中保温1 h较稳定;最适pH下纯酶在40℃以下保温1 h酶活较稳定。纯化后的胆红素氧化酶能催化氧化胆红素和ABTS两种底物,但对胆红素的亲和性较好,氧化速度也更快。1 mmol/L半胱氨酸、10 mmol/L的NaN3和1mmol/L二硫疏糖醇对胆红素氧化酶活力有强烈的抑制。大多数金属离子对酶反应具有抑制作用或影响效果不明显,但铜离子可以提高酶活力。共培养体系表明疣孢漆斑菌可以降解多种染料。疣孢漆斑菌对染料靛红的降解过程是生物吸附(菌体吸附)和生物降解(酶降解)共同作用的结果,液体培养7天靛红的脱色率达到90%以上。初步纯化的胆红素氧化酶可以在30℃～50℃、pH5.5～9.5和靛红浓度在50mg/L～200 mg/L的条件下有效地降解靛红。初步纯化的胆红素氧化酶在1000 U/L的酶活下只需50 min就可以降解90%以上100 mg/L的染料靛红,显示出胆红素氧化酶在染料废水处理中具有广阔的应用前景。

关键词：疣孢漆斑菌胆红素氧化酶培养基优化纯化染料脱色

胆红素氧化酶及其变异体在胆红素血症评价中的应用(英文)

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第一军医大学学报 2005年第11期25卷 1337-1340页

作者：张雷张晓罗智颖华南理工大学化工系生物制药研究室河南省南阳市第一人民医院小儿科河南南阳473000 华南理工大学附属医院广东广州510640

目的探讨胆红素氧化酶中配位氨基酸对保持酶活性的重要性和酶促反应的动力学,并评价胆红素氧化酶突变体能否作为一种更好的高胆红素血症的诊断试剂。方法胆红素氧化酶突变体I402G和C457S通过聚合酶链反应获得,并经氨基酸序列测定加以证... 详细信息

目的探讨胆红素氧化酶中配位氨基酸对保持酶活性的重要性和酶促反应的动力学,并评价胆红素氧化酶突变体能否作为一种更好的高胆红素血症的诊断试剂。方法胆红素氧化酶突变体I402G和C457S通过聚合酶链反应获得,并经氨基酸序列测定加以证实。钌搀杂的突变体C457S通过变异体与钌配合物的直接反应得到。研究了重组胆红素氧化酶及其变异体的光谱学性质,以及重组胆红素氧化酶和变异体I402G的酶促反应的动力学。结果变异体I402G和C457S被成功的表达和纯化。变异体I402G表现出较低的活性(1.67U/mg),C457S则完全失去了活性(0U/mg),但是钌搀杂的突变体C457S表现出较高的活性(5.50和6.42U/mg)。光谱学实验结果表明I402G突变体在较低的pH时第一类铜呈+1价态,即还原态;突变体C457S中失去第一类铜,使得突变体无法保持完整的活性中心,从而失去了酶活性。酶促反应的动力学实验显示重组胆红素氧化酶和变异体I402G动力学参数kcat分别为235.8min-1和6.9min-1,说明重组胆红素氧化酶具有很高的催化能力。结论配位的氨基酸对保持重组胆红素氧化酶及其变异体活性中心的完整性和酶活性具有重要的意义。重组胆红素氧化酶远比突变体I402G和C457S的活性高,说明突变体I402G和C457S不适合作为诊断试剂。钌搀杂有助于在突变体C457S中形成新的完整的活性中心,从而产生酶活性。

关键词：胆红素胆红素氧化酶聚合酶链反应高胆红素血症

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胆红素氧化酶的制备及应用

胆红素氧化酶的制备及应用

作者：曾伟河北大学

学位级别：硕士

胆红素氧化酶(bilirubin-oxidase,简写为BOD, EC.1.***.3.5)是一种临床诊断用酶,通过它检测人体内胆红素水平可判断是否患有肝脏等疾病。本实验以露湿漆斑菌(Myrothecium roridum, MTR)为原材料,经过冷冻干燥浓缩,DEAE-Sepharose阴离子交... 详细信息

胆红素氧化酶(bilirubin-oxidase,简写为BOD, EC.1.***.3.5)是一种临床诊断用酶,通过它检测人体内胆红素水平可判断是否患有肝脏等疾病。本实验以露湿漆斑菌(Myrothecium roridum, MTR)为原材料,经过冷冻干燥浓缩,DEAE-Sepharose阴离子交换层析对MTR BOD进行了分离纯化,获得电泳纯。实验测定其分子量约为51kD、等电点为4.5,希夫试剂染色证明其为糖蛋白。这些生化特性都与疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria, MV) BOD不同,而且稳定性更佳。根据Genbank中MVBOD基因和多酚氧化酶的保守区序列设计简并引物,利用PCR从MTR的染色体DNA中扩增得到长度为1.2kb的基因片段。通过序列比对,MTR BOD与MVBOD基因相似性可达95.35%。本实验还建立了一活性染色法,该方法通过BOD能够特异地将胆红素氧化成胆绿素的原理,利用酶与底物的特异反应,可以在凝胶上进行底物染色来直接显示酶的活性区带。这种活性染色可以采用胆红素直接溶入分离胶后电泳(胆红素-PAGE),也可以在电泳后置于胆红素溶液中染色(PACE-胆红素)。其中PAGE-胆红素方法在20min后即在凝胶上出现深绿色的BOD条带,随着时间延长,凝胶上的绿色酶条带逐渐扩散,最终形成透明条带;而运用胆红素-PAGE的方法则在12h后才能在凝胶上看见透明的BOD所在的条带。相比之下,前者更为简便、快速、灵敏。利用MTR BOD,测定人血清总胆红素,胆红素浓度为0-70μg/mL的范围内线性基本保持良好,初步证明MTR BOD具有临床应用前景。

关键词：露湿漆斑菌胆红素氧化酶离子交换层析分离纯化活性染色基因