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肿瘤酸度敏感PEG-PEI共聚物用于siRNA的靶向递送

肿瘤酸度敏感PEG-PEI共聚物用于siRNA的靶向递送

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作者：马晓慧山西大学

学位级别：硕士

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种序列特异性的基因调控机制,由双链RNA(ds RNA)触发,通过内源性micro RNA(mi RNA)或人工合成的小干扰RNA(siRNA)等核酸分子来抑制基因的表达。RNA干扰已经成为癌症治疗的一种有效手段,可以抑制几乎... 详细信息

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种序列特异性的基因调控机制,由双链RNA(ds RNA)触发,通过内源性micro RNA(mi RNA)或人工合成的小干扰RNA(siRNA)等核酸分子来抑制基因的表达。RNA干扰已经成为癌症治疗的一种有效手段,可以抑制几乎任何基因。然而,裸露的siRNA分子量和体积大、不能有效穿透细胞膜、对核酶敏感、容易被肾脏快速清除、容易引起免疫原性和脱靶效应,严重阻碍了其在肿瘤治疗中的应用。因此,研究者们开发了各种各样的递送载体用于siRNA的有效递送。其中,阳离子聚合物可以结合并压缩核酸分子形成稳定的纳米复合物,并且具有卓越的转染能力,已成为目前应用最广泛的非病毒类基因载体。本课题选用具有高转染效率的金标准阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI),对其进行聚乙二醇(PEG)化修饰,得到共聚物PEG-PEI,静电吸附针对S100A4的siRNA,获得稳定的PEG-PEI@siS100A4纳米复合物,并在细胞水平对其抗肿瘤活性进行验证。本课题主要包括以下三部分研究内容:(1)化学合成PEG-PEI共聚物,通过GPC、FTIR、H NMR等技术对其分子量和结构进行表征,证实PEG-PEI共聚物合成成功。H NMR结果表明PEG-PEI共聚物中苯甲酸亚胺键在弱酸性条件下(p H 6.5)会发生断裂,使得PEG从PEG-PEI共聚物上脱落下来,证明该共聚物具备良好的p H响应能力。选用人结肠癌细胞株HCT116和人卵巢癌细胞株SKOV3作为研究对象,通过MTT实验对PEG-PEI的载体毒性进行了检测,表明PEG的引入降低了PEI的细胞毒性,改善了其生物相容性。(2)凝胶阻滞实验证实当N/P达到5:1时,PEG-PEI共聚物即可完全络合siRNA,粒径和电位结果均表明PEG-PEI@siRNA纳米复合物制备成功。复合物与含10%和50%血清的培养基孵育72 h后,siRNA条带未见明显降解,说明该纳米复合物具有良好的血清稳定性,可以显著延长siRNA的循环时间。利用Cy5标记的siRNA构建纳米复合物,通过高分辨活细胞成像系统和流式细胞仪检测HCT116和SKOV3细胞对纳米复合物的摄取,结果表明:在p H 6.5条件下,该纳米复合物可将siRNA高效递送至细胞内,两种肿瘤细胞中均检测到强烈的红色荧光信号,细胞对纳米复合物的摄取显著增加。其次,通过荧光定量PCR和Western blotting技术在m RNA水平和蛋白水平证明该纳米复合物在弱酸性条件下显著下调了S100A4的表达。(3)首先,通过Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染色、Ed U染色和CFDA-SE标记检测PEG-PEI@siS100A4纳米复合物对SKOV3细胞增殖的抑制效应,结果表明:该纳米复合物在弱酸性条件下显著抑制了SKOV3细胞的增殖。其次,Annexin V-FITC/PI双染结果表明,在弱酸性条件下,PEG-PEI@siS100A4纳米复合物处理组细胞凋亡率显著增加。再者,Western blot分析表明,p H 6.5条件下,PEG-PEI@siS100A4纳米复合物处理组中细胞增殖标志蛋白Ki67及PCNA表达显著下调,促凋亡蛋白p53表达明显上调,表明该纳米复合物通过抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤效应。最后,细胞划痕实验和Transwell实验证实,PEG-PEI@siS100A纳米复合物以p H依赖的方式显著抑制了SKOV3细胞的迁移。综上,我们通过酸度敏感基团苯甲酸亚胺键连接PEG和PEI,得到PEG-PEI共聚物,络合针对S100A4的siRNA,构建纳米复合物PEG-PEI@siS100A4。该策略有助于解决“PEG窘境”,提高纳米复合物的稳定性和对肿瘤细胞的转染效率,对于实现siRNA在体内的稳定、高效传输具有非常重要的意义。

关键词：肿瘤酸度敏感 PEG-PEI共聚物 siRNA S100A4 靶向递送

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