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MDR1表达抑制剂的筛选及其肿瘤耐药逆转作用研究

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MDR1表达抑制剂的筛选及其肿瘤耐药逆转作用研究

作者：徐士峰东北师范大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的世界性疾病,其发病率仍在逐年上升。医疗技术的快速发展使得某些类型肿瘤患者的整体生存率得到了显著提高,然而由于肿瘤干细胞的存在,使得长期暴露于化疗药物所致应激环境中的肿瘤细胞逐渐产生耐药,从... 详细信息

恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的世界性疾病,其发病率仍在逐年上升。医疗技术的快速发展使得某些类型肿瘤患者的整体生存率得到了显著提高,然而由于肿瘤干细胞的存在,使得长期暴露于化疗药物所致应激环境中的肿瘤细胞逐渐产生耐药,从而导致治疗失败,化疗耐药已成为抗肿瘤治疗中不容忽视的一个重大问题。近年来的研究发现,肿瘤细胞能够对结构与药理机制完全不同的化疗药物产生广泛的耐药作用,从而导致临床治疗失败。目前,MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)介导的肿瘤多药耐药作用被证实可以通过屏蔽其药物外排泵功能来有效逆转耐药。因此,下调其表达及功能可以逆转肿瘤多药耐药,进而增加肿瘤对化疗药物的敏感性。本论文以MDR1启动子为靶标,建立MDR1表达抑制剂筛选模型,之后对600余种天然小分子化合物进行筛选,筛选出毒性较小,抑制效果更好的MDR1抑制剂。并探讨了目标化合物对耐药细胞的耐药逆转作用,具体如下。***1表达抑制剂的筛选及鉴定为了寻找潜在的可抑制MDR1表达的化合物,将本实验室前期已制备的含MDR1启动子的MDR1-luc质粒转染入HEK-293T细胞中,并用600多种天然小分子化合物分别进行处理,通过荧光素酶活性检测去判断这些化合物对MDR1转录的影响。结果发现,T2-70、T4-41、T5-17等化合物可明显抑制MDR1启动子的活性。2.耐药细胞耐药特性的鉴定采用了MCF-7/ADR耐药细胞系和MCF-7亲本细胞系作为实验细胞,为了验证亲本细胞和耐药细胞的耐药性,利用MTT法检测了不同浓度阿霉素处理48h后细胞的存活率,并且检测了阿霉素对两种细胞的IC50值。结果显示,在加入不同浓度的阿霉素后MCF-7/ADR细胞存活率明显高于MCF-7细胞,并且阿霉素对MCF-7/ADR细胞的IC50值也大于MCF-7细胞。3.T2-70对MDR1表达的影响为了确定T2-70对细胞内MDR1表达的影响,首先通过MTT法检测了化合物T2-70对MCF-7/ADR细胞和MCF-7细胞的无毒浓度。结果显示,当T2-70的浓度小于7μg/m L的剂量时对细胞活力几乎无影响,因此选择6μg/m L的浓度进行后续的实验。分别通过Real-time PCR和Western blot方法检测了T2-70对MDR1表达的影响。结果显示,T2-70可在m RNA和蛋白水平抑制MDR1的表达。4.T2-70对MCF-7/ADR耐药的逆转作用为了确定T2-70对肿瘤耐药性的逆转作用,首先通过MTT法检测了T2-70是否影响MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性,随后通过流式细胞术检测T2-70对细胞凋亡的影响。结果显示,T2-70可增强MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性。5.T2-70对MCF-7/ADR细胞内P-gp功能的影响为了检测T2-70对细胞内P-gp蛋白功能的影响,采用P-gp底物ADR与Rho-123两种染料检测了化合物对药物外排的影响,在荧光显微镜下观察细胞内的荧光强度。结果显示,在加入T2-70后,细胞内ADR与Rho-123的荧光积累明显增强。以上结果提示,T2-70降低了P-gp蛋白的药物外排泵作用,增加细胞内的药物浓度,从而增加肿瘤对化疗药物的敏感性。综上所述,本研究筛选得到了可抑制MDR1表达的化合物T2-70,可在细胞水平抑制P-gp蛋白的表达,并逆转肿瘤耐药,为肿瘤化疗增敏剂的研发提供了新的先导化合物。

关键词：肿瘤耐药药物筛选 MDR1 P-gp

薯蓣皂苷通过抑制P-gp表达并促进其降解逆转肿瘤耐药及EMT进程的研究

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薯蓣皂苷通过抑制P-gp表达并促进其降解逆转肿瘤耐药及EMT进程的...

作者：赵劲竹郑州大学

学位级别：硕士

背景肿瘤治疗最严峻的挑战之一就是克服肿瘤多药耐药(Multidrug-resistance,MDR)。临床上发现,肿瘤耐药可引起肿瘤的转移侵袭、复发及不良预后等。研究报道肿瘤耐药与ABC转运蛋白的表达及功能之间有着密切联系,特别是P-糖蛋白(P-gp/MDR1... 详细信息

背景肿瘤治疗最严峻的挑战之一就是克服肿瘤多药耐药(Multidrug-resistance,MDR)。临床上发现,肿瘤耐药可引起肿瘤的转移侵袭、复发及不良预后等。研究报道肿瘤耐药与ABC转运蛋白的表达及功能之间有着密切联系,特别是P-糖蛋白(P-gp/MDR1/ABCB1)高表达可以加快化疗药物的排出,降低药物在胞内浓度,从而影响治疗效果。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是临床上治疗癌症的一线药物,也是P-gp蛋白的底物。在P-gp高表达的肿瘤细胞中,长期使用紫杉醇,P-gp蛋白则会加快紫杉醇的外排,发生获得性耐药。肿瘤细胞耐药后,会促进上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transformation,EMT)进程,增强其转移侵袭能力。天然化合物薯蓣皂苷主要来源于穿龙薯蓣的活性成分,其抗肿瘤作用近年来广受关注。因此本研究旨在讨论薯蓣皂苷影响耐药细胞P-gp蛋白降解及下调其表达逆转紫杉醇耐药及抑制转移的机制研究,为临床解决肿瘤耐药问题提供有效策略。目的临床上对于中晚期食管癌及宫颈癌的治疗多以全身化疗为主,其中以铂类联合紫杉醇的抗肿瘤效果较好,不仅在一定时间内能使肿瘤缩小甚至短暂消失,而且能提高病人的生活质量,延长晚期病人的生存期。然而,长时间接受传统化疗药物或靶向药物治疗的复发或晚期患者,约90%的死亡都是由多药耐药(MDR)引起的,所以肿瘤多药耐药是肿瘤治疗所面临的一大挑战。薯蓣皂苷(Dio),一种天然的甾体皂苷,研究发现薯蓣皂苷具有免疫调节、抗炎、降血脂及抗艾滋病等药用价值,除此之外,薯蓣皂苷通过调控众多细胞内信号通路发挥抗肿瘤作用,包括抑制肿瘤细胞增殖、干扰转移侵袭及血管新生、促进肿瘤细胞的凋亡及诱导周期阻滞。研究表明薯蓣皂苷可以抑制TGF-β及下游信号通路诱导的EMT进程,从而抑制肺癌、乳腺癌及肝癌细胞的转移侵袭。Wang Lijuan等发现在人多药耐药白血病细胞,薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路下调P-gp蛋白表达来恢复抗肿瘤药物的活性等结果提示薯蓣皂苷可能是一种潜在的肿瘤化疗辅助药物,进而发挥逆转肿瘤耐药的作用。但是,目前薯蓣皂苷对耐药食管癌及宫颈癌细胞中P-gp表达的研究较少且不明确,因此本课题着重探究薯蓣皂苷对耐药细胞中P-gp蛋白表达的影响从而逆转肿瘤耐药的机制研究。研究目的:探究薯蓣皂苷通过促进P-gp蛋白降解逆转肿瘤耐药及抑制肿瘤侵袭转移的作用及其机制。具体研究工作分为三部分:第一部分:薯蓣皂苷逆转肿瘤耐药及其相关机制的研究。通过高浓度紫杉醇刺激法构建耐药细胞,进而检测紫杉醇对耐药细胞活力的影响及胞内P-gp蛋白的表达;利用相关实验检测薯蓣皂苷对耐药细胞P-gp外排功能及蛋白表达影响;最后进一步探讨薯蓣皂苷影响AKT/MAPKs/GSK3β通路后P-gp表达,及利用Co-IP实验进一步探讨薯蓣皂苷对P-gp泛素化降解的影响。结果证实:薯蓣皂苷通过抑制AKT/MAPK/GSK3β信号通路,可能减少P-gp蛋白的转录表达,同时薯蓣皂苷激活泛素-蛋白酶体系统,加快P-gp泛素化降解,共同下调P-gp在耐药细胞的表达,增强耐药细胞对紫杉醇的敏感性,逆转紫杉醇耐药。第二部分:薯蓣皂苷对探究薯蓣皂苷通过促进P-gp蛋白降解逆转肿瘤耐药及抑制肿瘤侵袭转移的作用及其机制。方法1.采用SRB实验检测不同浓度的紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶对耐药细胞TE-1/PTX及Hela/PTX的细胞活力影响并计算其半数抑制率(IC),计算两株耐药细胞对不同化疗药物的耐药指数;利用Western blotting实验检测亲本及其耐药细胞中P-gp蛋白的表达水平;年月日2.通过SRB实验检测薯蓣皂苷对亲本及耐药细胞增殖能力的影响;利用平板克隆实验检测薯蓣皂苷对耐药细胞克隆形成能力的影响;3.通过SRB实验考察薯蓣皂苷对逆转紫杉醇耐药能力的影响,并观察空白组、薯蓣皂苷组、紫杉醇组及联用组的细胞形态学变化;通过罗丹明123蓄积实验检测不同浓度薯蓣皂苷对亲本及耐药细胞中P-gp蛋白功能的影响;利用Western blotting实验检测薯蓣皂苷浓度梯度及时间梯度对耐药细胞P-gp蛋白表达的影响;4.采用Western blotting实验检测影响P-gp蛋白表达的AKT/MAPKs/GSK3β信号通路的相关蛋白,考察不同浓度薯蓣皂苷对其表达的影响;采用免疫共沉淀法(Co-IP)实验检测薯蓣皂苷对耐药细胞P-gp蛋白泛素化降解的影响;5.通过划痕实验以及Transwell实验检测不同浓度薯蓣皂苷对肿瘤耐药细胞迁移能力的影响。采用Western blotting实验检测不同浓度薯蓣皂苷对肿瘤耐药细胞中EMT相关蛋白表达的影响;6.建立Hela/PTX细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过瘤体积变化、瘤重及瘤组织的HE染色评价薯蓣皂苷

关键词： P-gp 泛素肿瘤耐药薯蓣皂苷 EMT

肿瘤微环境中不同细胞来源外泌体对肿瘤耐药的影响及中医药干预研究

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上海中医药大学学报 2022年第2期36卷 1-8页

作者：卫真真季青朱惠蓉上海中医药大学附属曙光医院上海201203

外泌体是一种大小在40~160 nm的细胞外囊泡。在复杂的肿瘤微环境中,无论是肿瘤细胞还是各种基质细胞都会分泌特定的外泌体,并且肿瘤细胞通常会释放比普通细胞更多的外泌体。在肿瘤的发生发展中,外泌体通过自身携带的细胞因子介导细胞间... 详细信息

外泌体是一种大小在40~160 nm的细胞外囊泡。在复杂的肿瘤微环境中,无论是肿瘤细胞还是各种基质细胞都会分泌特定的外泌体,并且肿瘤细胞通常会释放比普通细胞更多的外泌体。在肿瘤的发生发展中,外泌体通过自身携带的细胞因子介导细胞间通讯,影响肿瘤的转移、生长以及肿瘤细胞耐药性的传递等。通过探讨肿瘤微环境中肿瘤细胞、内皮细胞、间充质干细胞、肿瘤干细胞、肿瘤相关成纤维细胞及免疫细胞等不同细胞来源的外泌体与肿瘤耐药的关系,分析中药通过外泌体影响肿瘤耐药的相关研究,进一步阐述外泌体在肿瘤诊断和治疗中的研究前景,以期通过多种手段逆转肿瘤多药耐药,为患者带来新的治疗希望。

关键词：肿瘤微环境外泌体肿瘤耐药作用机制干预研究

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神经鞘脂代谢在肿瘤耐药中的研究进展

华夏医学 2023年第2期36卷 168-173页

作者：朱彩玉廖思聪金俊飞桂林医学院附属医院广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室广西桂林541001 桂林医学院附属医院广西神经鞘脂代谢相关疾病基础研究重点实验室广西桂林541001 桂林医学院附属医院中美健康与疾病脂质研究中心广西桂林541001

肿瘤耐药是肿瘤患者在使用抗肿瘤药物治疗过程中难以避免的问题,并严重影响肿瘤患者的生存质量和疾病预后。因此,探索肿瘤耐药机制和寻找降低肿瘤耐药新举措已成为亟需解决的重要科学难题。神经鞘脂是一类具有生物活性的脂质,越来越多... 详细信息

肿瘤耐药是肿瘤患者在使用抗肿瘤药物治疗过程中难以避免的问题,并严重影响肿瘤患者的生存质量和疾病预后。因此,探索肿瘤耐药机制和寻找降低肿瘤耐药新举措已成为亟需解决的重要科学难题。神经鞘脂是一类具有生物活性的脂质,越来越多的研究表明神经鞘脂代谢异常可能参与肿瘤耐药调控。本文通过综述神经鞘脂及相关代谢酶在肿瘤耐药方面的作用及相关机制,为阐明肿瘤耐药机制提供新思路,进而为临床预防和降低肿瘤耐药提供新策略。

关键词：神经鞘脂肿瘤耐药神经酰胺

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线粒体靶向铱(Ⅲ)配合物克服肿瘤耐药

大学化学 2022年第3期37卷 43-50页

作者：熊凯陈禹计亮年巢晖中山大学化学学院生物无机与合成化学教育部重点实验室广州510006

以顺铂代表的金属铂类药物在临床抗肿瘤治疗取得了巨大的成功,但铂类药物的毒副作用和耐药性很大程度上限制了其临床使用范围及疗效。以结构稳定、具有独特三维立体构型的铱(Ⅲ)配合物为构筑单元,可以有效跳出传统铂类药物的局限。线粒... 详细信息

以顺铂代表的金属铂类药物在临床抗肿瘤治疗取得了巨大的成功,但铂类药物的毒副作用和耐药性很大程度上限制了其临床使用范围及疗效。以结构稳定、具有独特三维立体构型的铱(Ⅲ)配合物为构筑单元,可以有效跳出传统铂类药物的局限。线粒体科学是当今化学、生命科学及分子医学最为活跃的交叉前沿研究领域之一。作为可预见的治疗靶点,线粒体靶向抗肿瘤试剂在克服肿瘤耐药、治疗肿瘤中具有十分突出的优势。本文中,结合铂类化疗药物耐药机制,同时以本课题组近年工作为基础,简要介绍具有线粒体靶向的环金属铱(Ⅲ)配合物克服肿瘤耐药研究进展。

关键词：环金属铱(Ⅲ)配合物线粒体靶向顺铂肿瘤耐药

MicroRNA-128与肿瘤耐药性及预后的研究进展

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生命的化学 2022年第3期42卷 571-578页

作者：张玉领陈培江苏护理职业学院淮安223005

内源性非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控多种细胞功能和生物过程,如细胞增殖、凋亡和分化等,被认为是一种新的基因表达调节因子。组织特异性的miRNAs正在成为癌症诊断的候选基因,常用来作为肿瘤早期诊断与预后的评价指标。MiRNA-128的... 详细信息

内源性非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控多种细胞功能和生物过程,如细胞增殖、凋亡和分化等,被认为是一种新的基因表达调节因子。组织特异性的miRNAs正在成为癌症诊断的候选基因,常用来作为肿瘤早期诊断与预后的评价指标。MiRNA-128的异常表达与多种肿瘤发生、发展密切相关,预示miRNA-128有望成为肿瘤治疗的新靶点。癌细胞耐药性是影响肿瘤治疗效果的关键原因之一。本文就miRNA-128与肿瘤耐药性的关系、作用机制,以及其对肿瘤患者生存时间的影响进行综述,以期为肿瘤治疗提供新思路。

关键词： miRNA-128 肿瘤耐药预后抑癌基因

组学技术在肿瘤耐药领域的研究进展:从单组学到多组学联合应用

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中南大学学报（医学版） 2021年第6期46卷 620-627页

作者：孙泽恩刘玉洁欧阳倩颖刘昭前刘英姿中南大学湘雅医院临床药理研究所长沙410008 中南大学临床药理研究所湖南省遗传药理学重点实验室长沙410078

耐药是癌症治疗面临的主要难题,明确肿瘤耐药机制和寻找新的药物靶点有重要的临床意义。多组学主要包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、影像组学等。近年来,肿瘤耐药研究从单组学到多组学联合,取得了飞速的发... 详细信息

耐药是癌症治疗面临的主要难题,明确肿瘤耐药机制和寻找新的药物靶点有重要的临床意义。多组学主要包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、影像组学等。近年来,肿瘤耐药研究从单组学到多组学联合,取得了飞速的发展,显著加快了肿瘤新的药物靶点的发现。

关键词：肿瘤耐药基因组学表观基因组学转录组学蛋白质组学代谢组学影像组学

Hedgehog信号通路参与肿瘤耐药机制研究的最新进展

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中国药科大学学报 2016年第3期47卷 259-266页

作者：黄少良赵丽郭青龙吴玉林中国药科大学江苏省肿瘤发生与干预重点实验室南京210009 中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室南京210009 中国药科大学生理学教研室南京210009

Hedgehog信号通路调控肿瘤增殖、周期调控、侵袭转移等生理过程,维持着肿瘤的发生与发展。研究发现Hedgehog信号通路在多种耐药肿瘤的异常激活,进一步研究证实该通路通过激活靶基因以及与其他通路相互作用等方式介导了肿瘤耐药。因此,He... 详细信息

Hedgehog信号通路调控肿瘤增殖、周期调控、侵袭转移等生理过程,维持着肿瘤的发生与发展。研究发现Hedgehog信号通路在多种耐药肿瘤的异常激活,进一步研究证实该通路通过激活靶基因以及与其他通路相互作用等方式介导了肿瘤耐药。因此,Hedgehog信号通路已然成为逆转肿瘤耐药的重要靶点。本文就Hedgehog信号通路传导途径及近年来在肿瘤耐药机制研究中的现状作一综述。

关键词： Hedgehog信号通路肿瘤耐药靶点进展

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DNA甲基化异常与肿瘤耐药

遗传 2014年第5期36卷 411-419页

作者：司鑫鑫孙玉洁江苏省人类功能基因组学重点实验室南京医科大学基础医学院细胞生物学系南京210029

肿瘤耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因,其产生机制复杂多样,是多种因素共同作用的结果。近年来,表观遗传改变在肿瘤耐药中的作用日益受到关注。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在调节基因表达和维持基因组稳定性中扮演着重要角色... 详细信息

肿瘤耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因,其产生机制复杂多样,是多种因素共同作用的结果。近年来,表观遗传改变在肿瘤耐药中的作用日益受到关注。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在调节基因表达和维持基因组稳定性中扮演着重要角色。原发性或获得性耐药的肿瘤细胞大多伴随DNA异常甲基化,越来越多的证据显示,DNA甲基化异常是肿瘤细胞耐药表型产生的重要机制。文章就DNA甲基化异常与肿瘤细胞耐药的关系及相关作用机制进行了综述。

关键词：肿瘤耐药 DNA甲基化基因组稳定性基因表达