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肿瘤细胞膜/细菌膜融合脂质体的构建及其用于结直肠癌免疫治疗的研究

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肿瘤细胞膜/细菌膜融合脂质体的构建及其用于结直肠癌免疫治疗的...

作者：罗先金四川大学

学位级别：硕士

肿瘤免疫疗法是通过激活患者自身的免疫系统来识别和清除癌细胞的方法,相比于化疗,具有较高的特异性和较低的毒性,因此可以安全有效地消除肿瘤并防止肿瘤复发。肿瘤疫苗作为一种肿瘤免疫疗法已被广泛研究,其可以通过肿瘤相关抗原来激活... 详细信息

肿瘤免疫疗法是通过激活患者自身的免疫系统来识别和清除癌细胞的方法,相比于化疗,具有较高的特异性和较低的毒性,因此可以安全有效地消除肿瘤并防止肿瘤复发。肿瘤疫苗作为一种肿瘤免疫疗法已被广泛研究,其可以通过肿瘤相关抗原来激活肿瘤特异性的免疫反应,以达到杀伤、清除肿瘤细胞的目的。肿瘤细胞膜含有一系列完整的肿瘤相关抗原,其相比于亚单位疫苗,诱导免疫应答的能力更强,因此能够更有效清除肿瘤细胞。一款有效的疫苗不仅需要合适的抗原,往往还需要佐剂的参与。所以我们引入一种来源于细菌的双层膜囊泡(Double-layered membrane vesicles,DMVs)作为佐剂。DMVs含脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、外膜蛋白A(Outer membrane protein A,OmpA)、外膜蛋白F(Outer membrane protein F,OprF)等成分,是源于革兰氏阴性菌的一种双层脂质囊泡,可与肿瘤细胞膜融合。出于安全性的考虑,本文使用的DMVs均来源于减毒处理的革兰氏阴性菌VNP20009。淋巴结是免疫应答发生的主要场所,含有由不同类型的免疫细胞,如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK)和抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells,APCs)等。肿瘤引流淋巴结(Tumor drain lymph node,TDLN)由于靠近肿瘤,因此在刺激机体产生抗肿瘤免疫应答方面具有重要地位。研究表明,10nm～100nm的纳米载体具有较好的淋巴结靶向能力。据此,我们利用纳米载体将肿瘤细胞膜和佐剂共同递送到TDLN中,提高机体产生的抗肿瘤免疫应答。此外,肿瘤免疫微环境往往处于免疫抑制状态,所以我们在融合脂质体中载入PD-L1抑制剂JQ-1,以进一步提高肿瘤疫苗抗肿瘤的能力。在本课题中,我们设计了一种肿瘤细胞膜/细菌膜融合脂质体,并在脂质体表面吸附了铝盐佐剂。通过融合脂质体将抗原和佐剂共递送至TDLN,有效地诱导抗肿瘤免疫应答。首先,我们用薄膜水化法制备了粒径在100nm左右的脂质体,再用脂质体挤出器将脂质体、DMVs和肿瘤细胞膜挤压融合在一起,即可获得融合脂质体AMV。其水合粒径为95nm左右,电位为-3.65mv。载入JQ-1后得到AMVJ,用超高速离心法测出JQ-1的包封率为78.05%。接下来我们对制剂AMV,AMVJ进行了体外表征。首先,我们用透射电镜对制剂进行形态学表征,电镜下显示为50～70 nm的球形。SDS-PAGE电泳结果表明AMV、AMVJ中含有与游离组FreeMV相同的膜蛋白条带,红外光谱实验结果显示肽键相关峰吸光度明显增强,两者均证明AMV、AMVJ中膜蛋白的存在。为了验证两种膜蛋白是否融合,我们进行了共聚焦显微镜共定位的实验。用Did和Dio分别标记肿瘤细胞膜和细菌膜DMVs,并制备得到AMV。在共聚焦显微镜下观察到细胞中两种生物膜的共定位,表明我们成功制备了载有肿瘤细胞膜和细菌膜DMVs的融合脂质体。体外细胞学研究表明,制剂组毒性较低,且其被APCs摄取的效率显著性高于游离组。加入Al的AMV、AMVJ组的摄取效率相比MV、MVJ组有进一步提高,这可能是Al促进APCs摄取所导致。在小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)上的PD-L1表达实验中,AMVJ能显著性降低BMDC的PD-L1表达。随后,我们在C57BL/6小鼠上考察了AMV诱导抗原特异性体液和细胞免疫应答的能力。经过三次皮下免疫后,小鼠血清抗体测定结果表明:AMV能够显著提高血清中的IgG、IgG1、IgG2a的水平。脾细胞内因子染色结果显示,AMV免疫后能显著上调机体IL-4/CD4T、IFN-γ/CD8T、TNF-α/CD8T细胞比例,这些结果证明AMV能够刺激小鼠产生更强的体液免疫应答和细胞免疫应答。同时,我们还检测了AMVJ对荷瘤小鼠体内免疫指标的调节情况,结果显示AMVJ组能够显著性降低TDLN中APCs的PD-L1的表达,并显著提高瘤内活化的CD4T细胞、CD8T细胞比例。最后,我们在MC38结直肠癌异位模型小鼠上,直接考察融合脂质体AMV、AMVJ的肿瘤抑制效果。经过四次皮下给药后,AMV、AMVJ均能显著性抑制肿瘤的生长,并延长荷瘤小鼠的生存期。其中接受AMVJ治疗的小鼠肿瘤生长最缓慢,生存期得到显著性延长。综上所述,我们成功构建了用于结直肠癌免疫治疗的融合脂质体递送系统。一方面,利用Al、细菌DMVs、肿瘤细胞膜和脂质体融合形成新的融合脂质体,提高肿瘤细胞膜的抗原摄取效率,增加刺激免疫应答能力。另一方面,通过制剂的粒径优势可以靶向TDLN,进一步提升机体的免疫应答。此外,载入JQ-1后,还能降低APCs表面PD-L1的表达,并能显著性抑制小鼠肿瘤生长,延长小鼠的生存时间。此

关键词：肿瘤细胞膜 DMVs 淋巴结靶向 APCs PD-L

肿瘤细胞膜杂化脂质体载紫杉醇靶向治疗黑色素瘤的研究

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肿瘤细胞膜杂化脂质体载紫杉醇靶向治疗黑色素瘤的研究

作者：李延延上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:构建以肿瘤细胞膜与透明质酸（Hyaluronic acid,HA）共杂化的脂质体为载体,负载抗肿瘤药物紫杉醇（Paclitaxel,PTX）,通过注射给药将PTX主动靶向递送至黑色素瘤病变部位,提高药物的生物利用度,从而增强药物的抗肿瘤功效。方法:通... 详细信息

目的:构建以肿瘤细胞膜与透明质酸（Hyaluronic acid,HA）共杂化的脂质体为载体,负载抗肿瘤药物紫杉醇（Paclitaxel,PTX）,通过注射给药将PTX主动靶向递送至黑色素瘤病变部位,提高药物的生物利用度,从而增强药物的抗肿瘤功效。方法:通过薄膜分散法制备载PTX脂质体,通过单因素实验筛选制剂处方。将HA以共价键方式接枝于二油酰磷脂酰乙醇胺（Dioleoyl Phosphoethanolamine,DOPE）分子上,再将该磷脂材料（HA-DOPE）插入脂质体的磷脂膜,形成HA修饰脂质体（HA-LS）。通过差速离心法提取纯化得到鼠源B16F10黑色素瘤细胞膜,与脂质体相融合,形成肿瘤细胞膜（Cancer cell membrane,CCM）杂化的脂质体（CCM/LS）,另以肿瘤细胞膜杂化HA-LS,即制备成肿瘤细胞膜与HA共杂化的脂质体（HA-CCM/LS）。通过体外培养的B16F10细胞摄取实验,优选了肿瘤细胞膜与脂质体的杂化方法,确定了肿瘤细胞膜和HA-DOPE的最佳用量。采用凝胶电泳和蛋白质印迹技术对膜蛋白进行表征。对空白纳米粒和载药纳米粒进行B16F10细胞毒性评价;利用流式细胞术和细胞内共定位实验检测B16F10对纳米粒的摄取能力。通过体外溶血实验进行纳米粒注射给药安全性考察;构建荷黑色素瘤裸鼠模型,考察纳米粒在荷瘤裸鼠的体内分布及抗肿瘤效果。结果:单因素考察优选的制剂处方与制备工艺为:胆固醇用量为2 mg/m L、水合温度为40℃、超声功率为97.5 W、超声时间为15 min、药脂比为1:15。制备得到的PTX-LS的粒径为149.77±4.35 nm,PDI为0.227±0.05,包封率为95.12±0.39%,载药量为5.14±0.47%。经FT-IR检测,确认成功合成了HA-DOPE;经肿瘤细胞膜杂化后,脂质体粒径减小,为131.57±1.21 nm,粒径分布更为均匀,其载药量与包封率分别为4.66±0.12%和93.45±3.00%;透射电镜下观察CCM/LS呈现双重膜结构。HA与肿瘤细胞膜的修饰并不会影响载体的包封率和载药量,但细胞膜的杂化改善了纳米粒的粒径分布和制剂的稳定性。凝胶电泳和蛋白质印迹技术验证了膜蛋白在杂化纳米粒上的保留。体外释放实验显示,经HA或/和CCM修饰后,脂质体中药物释放减慢。空白纳米载体对B16F10细胞无明显细胞毒性,载药纳米载体中肿瘤细胞膜的杂化以及透明质酸的修饰均可提高纳米给药系统杀伤B16F10黑色素瘤的能力。细胞对香豆素6（Coumarin 6,C6）标记的各制剂的摄取结果表明HA或CCM的修饰均能促进细胞摄取,而经CCM修饰的脂质体的肿瘤细胞内化作用显著高于仅以HA修饰组。体外溶血实验表明,各纳米制剂在2.5～100μg/m L的溶血率均低于20%,表明均具有良好的血液相容性。小动物活体成像实验显示,与未修饰LS相比,肿瘤细胞膜和/或HA修饰的LS均可较好地富集于肿瘤,具有良好的肿瘤靶向性。CCM/LS与HA-CCM/LS对在体黑色素瘤的抑制效果最好,对肿瘤组织中肿瘤细胞的诱导凋亡作用最显著,其次是HA-LS组与LS组,这与体外培养肿瘤细胞毒性实验结果一致。结合体外培养肿瘤细胞摄取与体内组织分布研究结果,证实经同源肿瘤细胞膜修饰后,脂质体具备很强的主动靶向肿瘤组织的性能,从而发挥较好的抗肿瘤效果。结论:以同源肿瘤细胞膜杂化的脂质体对肿瘤细胞表现出特异性粘附作用,增强了纳米载体的体内主动靶向肿瘤组织的能力,从而发挥了更强的肿瘤抑制效果。然而,HA与肿瘤细胞膜共修饰脂质体并未表现出更强的主动靶向作用,其原因有待于进一步研究。

关键词：紫杉醇脂质体透明质酸肿瘤细胞膜黑色素瘤靶向

仿生层状MoOx纳米片的构建及其抗肿瘤作用研究

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仿生层状MoOx纳米片的构建及其抗肿瘤作用研究

作者：刘冬竹山东大学

学位级别：硕士

具有成像、药物递送和光热治疗(PTT)功能的二维(2D)纳米材料的开发和应用在生物医学领域具有广阔的前景。为了克服化疗药物生物利用度低和单一疗法效果较差的问题,本课题研究了一种磷脂修饰、肿瘤细胞膜包覆、负载化疗药物7-乙基-10-羟... 详细信息

具有成像、药物递送和光热治疗(PTT)功能的二维(2D)纳米材料的开发和应用在生物医学领域具有广阔的前景。为了克服化疗药物生物利用度低和单一疗法效果较差的问题,本课题研究了一种磷脂修饰、肿瘤细胞膜包覆、负载化疗药物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的多功能纳米制剂,该制剂具有高光热吸收和生物降解性,可实现肿瘤部位的精准递送。MoOx在近红外辐射下产生的热量可以导致肿瘤组织的局部“燃烧”并破坏蛋白质和DNA,同时诱导免疫原性细胞死亡(ICD)产生抗原和损伤相关分子模式(DAMP)。化疗药物SN38不仅可以诱导ICD,与光热剂诱导的ICD起协同作用,共同诱导DAMP和树突状细胞(DC)成熟。还可以诱导Ⅰ型干扰素的产生和STING通路的激活,促进后续多种免疫细胞的激活并缓解肿瘤的免疫抑制环境。本实验首先通过一锅水热法合成了氧化钼,并在强超声作用下将其剥离成单层氧化钼纳米片。通过旋转蒸发法使用蛋黄卵磷脂对纳米片进行改性,磷脂修饰赋予了强疏水性纳米片在水性介质中良好的分散性和稳定性。将空白纳米片和SN38在水和DMSO的混合溶液中搅拌以获得载药纳米片,由于2D纳米材料的比表面积大,该纳米片对疏水性药物SN38具有高负载能力(42.5%)。将制备的4T1肿瘤细胞膜和脂质修饰的载药纳米片混合搅拌并超声得到MoOx@M-SN38,包覆的4T1肿瘤细胞膜具有的免疫逃逸和同源靶向性质使药物有效地在肿瘤部位积聚。对MoOx@M进行表征,证明其为片层结构,粒径、电位分别为81 nm和-22.5 mV。MoOx@M在水性介质中分散稳定且在较高浓度下溶血率低于5%,表明其体内注射的稳定性和安全性。纳米片光热升温性能、光热稳定性和重复性良好,光热转化效率27.2%,光热性能良好。在不同pH的介质中降解速度和体外释放的考察实验中,MoOx@M-SN38在中性介质缓慢降解,酸性较为稳定。这种性质有助于纳米片蓄积在肿瘤并缓慢释放药物。而到达正常组织的纳米片可以较快被代谢,减少对非靶向部位的毒副作用。MoOx@M-SN38的体外抗肿瘤效果评估以4T1乳腺癌细胞为模型。细胞毒性实验、细胞凋亡、活死细胞染色和线粒体膜电位实验证明了 MoOx@M-SN38对癌细胞有效杀伤作用。细胞摄取实验表明MoOx@M-SN38中肿瘤细胞膜的修饰使其靶向肿瘤能力增强。细胞周期试验结果表明其对S期的细胞周期阻滞作用,通过抑制细胞分裂抑制4T1肿瘤细胞增殖。CRT外翻和HMGB1释放实验结果证明了 MoOx@M-SN38的光热作用和SN38均有效诱导ICD并激活免疫,缓解肿瘤免疫抑制。划痕实验中MoOx@M-SN38的化疗与光热的联合治疗显著抑制了肿瘤迁移。体内抗肿瘤研究以4T1荷瘤小鼠为模型。体内分布实验证明了 MoOx@-IR780良好的肿瘤蓄积能力。体内光热实验中肿瘤部位蓄积的MoOx@M在光照激发下快速升温达到最高47℃,有效致使肿瘤热消融。体内抗原发性肿瘤和肺转移实验结果表明,MoOx@M-SN38+NIR组对原发性肿瘤(抑制率为88%)和肺转移有明显的抑制作用。对于免疫应答情况的研究,MoOx@M-SN38+NIR组淋巴结DCs成熟度最高(30%),表明除了 SN38激活STING通路外还通过光热作用杀伤肿瘤细胞,产生肿瘤相关抗原(TAA),诱导DC成熟,进而促进更高水平的免疫应答。肿瘤和脾脏浸润的Ths、CTLs数量明显增加,M2和Treg比例显著下调。同时MoOx@M-SN38+NIR组肿瘤切片荧光染色表现出了明显的CRT和P-STING上调,证明通过ICD和STING通路激活显著缓解了免疫抑制,表现出显著的肿瘤抑效作用。综上,本实验构建了肿瘤细胞膜包覆的MoOx纳米片用于SN38的肿瘤靶向递送,实现了 PTT和化疗的结合,具有良好的应用前景。

关键词：光热免疫 2D无机纳米材料化疗肿瘤细胞膜

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生物膜水凝胶预防性肿瘤疫苗的研究

生物膜水凝胶预防性肿瘤疫苗的研究

作者：聂鑫鑫山东大学

学位级别：硕士

肿瘤疫苗旨在通过激活机体免疫系统以预防肿瘤发生发展或治疗已有肿瘤,具有降低肿瘤发病率和改善预后的潜力,因而具备极高的研究价值和广阔的临床应用前景。使用预防性肿瘤疫苗对健康机体进行免疫接种是一种有效且具有高经济效益的策略... 详细信息

肿瘤疫苗旨在通过激活机体免疫系统以预防肿瘤发生发展或治疗已有肿瘤,具有降低肿瘤发病率和改善预后的潜力,因而具备极高的研究价值和广阔的临床应用前景。使用预防性肿瘤疫苗对健康机体进行免疫接种是一种有效且具有高经济效益的策略,可以减少肿瘤发生从而缓解肿瘤治疗带来的沉重经济负担,然而目前预防性肿瘤疫苗的免疫激活效果有待提升。高效激活细胞毒性T细胞(CTL)需要确保向幼稚T细胞传递三种信号:抗原信号、共刺激信号和细胞因子信号;同时,充足的抗原暴露对于刺激免疫系统和建立免疫记忆非常重要,而疫苗在注射后往往被快速清除,个体通常需要接受多次注射以确保引起免疫记忆,由此引起的疼痛和依从性差是疫苗使用中的一个重要问题。基于以上背景,本课题设计了一种基于生物膜的水凝胶肿瘤疫苗E64@O-MHCM,有望实现长效的免疫激活和高效的体内滞留,以减少疫苗注射次数并改善肿瘤疫苗的免疫效果。肿瘤疫苗的凝胶骨架(O-MHCM)是由修饰甘露糖的杂化生物膜(MHCM)与氧化海藻酸钠(OSA)通过席夫碱键相连制备的,其中杂化生物膜(HCM)由肿瘤细胞膜(TCM)与细菌外膜囊泡(OMV)融合制备,随后被DSPE-PEG-甘露糖修饰;在凝胶亲水腔中负载了蛋白酶抑制剂E64。TCM作为疫苗的抗原来源,其保留了肿瘤细胞全部的表面抗原,在被树突状细胞(DC)呈递后可以刺激免疫系统产生多种肿瘤特异性CTL。OMV含有多种衍生自母体细菌的病原体相关分子模式(PAMP),可以与DC表面的模式识别受体(PRR)结合,因而具有强烈的免疫原性,能够促进DC成熟和细胞因子分泌,是一种有效的佐剂。蛋白酶抑制剂E64作用于DC溶酶体以抑制其对抗原的无效降解,在和肿瘤抗原共同使用时可以提高DC对抗原的交叉呈递效率。甘露糖修饰是为了与DC表面的甘露糖受体结合以实现更好的靶向。以上几种组分的协同使用全面增强了向幼稚T细胞传递的抗原信号、共刺激信号和细胞因子信号。而将MHCM与OSA反应制备凝胶因子,以构筑凝胶骨架,可以使携带肿瘤抗原与佐剂的MHCM随着凝胶的逐渐降解被缓慢释放出来,在单次皮下接种后为机体提供稳定充足的抗原刺激,避免了疫苗在注射后的快速清除并减少了疫苗给药次数。本课题研究内容如下:(1)首先,根据先前报道的方法,通过探头超声破碎和多次离心等步骤从小鼠肿瘤组织提取了 TCM,通过超速离心从大肠杆菌E.coli DH5α的培养上清中提取了 OMV。将TCM和OMV混合后通过超声和共挤出的方法制备HCM,通过搅拌等方式修饰DSPE-PEG-甘露糖,从而制备MHCM;将OSA与MHCM避光搅拌,MHCM表面的胺基与OSA的醛基发生席夫碱反应,制备O-MHCM;最后将O-MHCM溶液与E64溶液混合制备了肿瘤疫苗E64@O-MHCM。共聚焦实验证实了两种膜材料的成功融合;动态光散射结果表明HCM、MHCM和O-MHCM的平均水合粒径分别为183.3 nm、210.6 nm和310.6 nm;成胶试验证实E64@O-MHCM溶液在加入CaCl2后可转变为凝胶;通过SEM电镜观察E64@O-MHCM凝胶的微观结构,其具有网状多孔结构;通针性实验说明E64@O-MHCM溶液具有一定的流动性,可用于注射使用;体外释放结果表明E64@O-MHCM凝胶能够持续缓释抗原和佐剂;皮下降解结果表明该制剂在皮下注射后能够成胶,且在16天内逐渐降解。(2)通过CCK-8法测试了 E64@O-MHCM对小鼠成纤维细胞L929的毒性,结果证明该肿瘤疫苗对正常细胞安全无毒。将骨髓来源的树突状细胞(BMDC)与E64@O-MHCM共孵育,并通过流式细胞术检测以探究制剂的体外免疫刺激效果:测定了BMDC表面成熟标志物CD80和CD86,结果证实E64@O-MHCM具有促进DC成熟的能力;通过测定SIINFEKL-H-2Kb+CD11c+细胞的比例,证实制剂E64@O-MHCM可以有效提高DC的交叉呈递效率;ELISA法对细胞因子分泌量的检测表明该制剂可以促进DC分泌IL-6、IL-12和TNF-α。此外,T细胞增殖实验证明E64@O-MHCM通过作用于DC显著增强了 T细胞的活化增殖。(3)随后在小鼠体内测定了 E64@O-MHCM凝胶的滞留效果、免疫效果、预防肿瘤效果、治疗肿瘤效果和生物安全性。体内滞留实验证实E64@O-MHCM在注射后可在体内长期滞留。对健康小鼠单次皮下注射E64@O-MHCM,然后通过流式细胞术检测淋巴结中的DC、T细胞以及脾脏T细胞,结果显示接种疫苗后小鼠淋巴结中DC成熟的比例和交叉呈递抗原的效率均有所提高,并且淋巴结和脾脏中活化T细胞的数量增加。对健康小鼠单次接种E64@O-MHCM,在21天后使用4T1肿瘤细胞攻击小鼠,观察小鼠肿瘤生长情况,结果表明使用E64@O-MHCM预先免疫可明显减缓肿瘤生长,即该疫苗具有良好的预防效果;预防试验结束后通过流式检测了肿瘤浸润CTL和脾脏浸润CTL,与生理

关键词：水凝胶肿瘤疫苗肿瘤细胞膜细菌外膜囊泡

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细胞膜修饰纳米药物载体的制备与抗肿瘤研究

细胞膜修饰纳米药物载体的制备与抗肿瘤研究

作者：谭海华侨大学

学位级别：硕士

化疗是恶性肿瘤治疗的有效手段之一。但是,化疗药物对肿瘤细胞产生强力的杀伤效力的同时,通常也会因为它的非特异性分布,会对机体的正常组织器官造成损害。纳米药物的设计和研发大大提高了药物传递效率,增强了对肿瘤的作用效果,也为克... 详细信息

化疗是恶性肿瘤治疗的有效手段之一。但是,化疗药物对肿瘤细胞产生强力的杀伤效力的同时,通常也会因为它的非特异性分布,会对机体的正常组织器官造成损害。纳米药物的设计和研发大大提高了药物传递效率,增强了对肿瘤的作用效果,也为克服化疗面临的诸多问题提供了可能。然而,血液循环对纳米药物的快速清除,使得纳米药物在肿瘤部位的积累量仍然较低。因此,设计一种能够规避免疫系统,提高肿瘤部位药物积累量的纳米载药系统具有重要意义。本文设计了合成了两种纳米材料,并使用细胞膜进行修饰,以提高对肿瘤的治疗效果。主要内容如下:1.红细胞膜修饰聚多巴胺纳米载药体系经过红细胞膜修饰的纳米微粒,具有抗巨噬细胞吞噬的作用,从而可以增加纳米药物在机体中的循环时间,并能够通过滞留效应积累在肿瘤部位。我们制备了经红细胞膜修饰并装载有DOX和ICG的聚多巴胺纳米(PDA@RBCM/ICG/DOX)。使用TEM、SDS-PAGE和Western blot对PDA@RBCM表面的蛋白进行表征,结果表明红细胞膜已经修饰到了PDA纳米颗粒表面。并进一步对PDA@RBC/DOX/ICG的光热性能、光动力作用、免疫逃逸能力和抗肿瘤能力进行了研究。2.肿瘤细胞膜修饰PB-M@PDA纳米载药体系我们制备了经肿瘤细胞膜修饰并装载有ICG的聚多巴胺普鲁士蓝二氧化锰纳米(PB-M@PDA)颗粒,即PB-M@P@CCM/ICG纳米颗粒。所获得的PB-M@P@CCM/ICG纳米颗粒具有能够与肿瘤微环境中过量的HO反应的特性,催化HO分解为O,提高纳米药物的光动力作用。并且使用肿瘤细胞膜对纳米微粒修饰可以提高纳米药物对肿瘤的靶向性,增加纳米药物对肿瘤的治疗效应。通过TEM、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和荧光共定位的方式对肿瘤细胞膜修饰的PB-M@PDA纳米进行表征,从而证实了肿瘤细胞膜已经修饰到PB-M@PDA纳米颗粒表面。并进一步研究了PB-M@P@CCM/ICG的光动力作用、靶向能力、催化HO产生O的能力和抗肿瘤能力。结论:1.红细胞膜伪装聚多巴胺纳米载药体系PDA@RBC/DOX/ICG纳米具有良好的光动力作用,在激光照射下,很快就可以达到杀死肿瘤细胞的临界温度(42.6℃)。并且,经过红细胞修饰之后,PDA@RBC/DOX/ICG纳米颗粒具有一定的免疫逃逸能力。通过细胞毒性实验,验证了红细胞膜修饰的聚多巴胺在一定浓度范围内不会对细胞产生毒性。PDA@RBC/DOX/ICG纳米颗粒在抗肿瘤实验中表现出了光动力与化疗的协同作用。2.肿瘤细胞膜修饰PB-M@PDA纳米载药体系制备的PB-M@P@CCM/ICG纳米颗粒可以催化HO,产生O,这可以改善肿瘤微环境,又可以增强光动力作用。并且制备的纳米药物具有良好的光动力效果,经过肿瘤细胞膜修饰后,表现出对Hela细胞的同源靶向。对其细胞毒性进行研究,在未进行激光光照时,在一定浓度范围内并不会表现出细胞毒性,而经过激光照射后,表现出强烈的抗肿瘤效应。

关键词：纳米药物红细胞膜免疫逃逸肿瘤细胞膜靶向

双模态仿生纳米分子探针用于光热联合声动力及增效免疫治疗的研究

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双模态仿生纳米分子探针用于光热联合声动力及增效免疫治疗的研究

作者：林晓红重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针的制备、表征及基本性能检测目的制备一种乳腺癌细胞膜包覆的载血卟啉单甲醚/超顺磁性氧化铁的仿生纳米分子探针（CHINPs）,检测其表征、光热性能及活性氧产生性能。方法1.纳米粒的制备及表征:通... 详细信息

第一部分乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针的制备、表征及基本性能检测目的制备一种乳腺癌细胞膜包覆的载血卟啉单甲醚/超顺磁性氧化铁的仿生纳米分子探针（CHINPs）,检测其表征、光热性能及活性氧产生性能。方法1.纳米粒的制备及表征:通过化学裂解及反复冻融法提取乳腺癌4T1细胞膜,然后以双乳化法联合挤压法制备癌细胞膜（Cancer cell membrane,CCM）包被的载血卟啉单甲醚（Hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）及超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic iron oxide,SPIO）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic acid-glycolic acid copolymer,PLGA）仿生纳米粒作为分子探针（CHINPs）。光学显微镜及激光共聚焦显微镜（Laser confocal microscope,CLSM）下观察其形态,以透射电镜（transmission electron microscope,TEM）分析其结构;通过马尔文粒径仪检测其粒径、电位;采用紫外分光光度法及电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma massspectrometry,ICP-MS）分别检测纳米粒中HMME及SPIO含量,并计算包封率和载药量;采用蛋白质凝胶电泳（protein gel electrophoresis,SDS-PAGE）检测纳米粒携带蛋白的情况,验证其细胞膜包被效果。2.纳米粒的基本性能:检测不同浓度的CHINPs在808 nm激光仪激发下的光热性能及光热稳定性;以单线态氧探针（singlet oxygen sensor green,SOSG）验证纳米粒产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）的性能;以2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）检测纳米粒在细胞水平ROS的产生性能。结果1.纳米粒的表征:采用挤压法及双乳化法所制备的纳米粒CHINPs呈浅棕色,光镜及激光共聚焦显微镜下可见纳米粒分散性良好,大小均一,形态规则,透射电镜下可见纳米粒呈球形“核壳结构”。马尔文粒径仪测得CCM、HINPs及CHINPs的粒径分别为337.8±6.4 nm,198.9±1.4 nm和228.1±6.2 nm,Zeta电位分别为-20.5±0.4 m V,-10.7±1.3 m V和-19.3±0.6 m V;血卟啉单甲醚的包封率为82.12%,载药量为3.16%。超顺磁性氧化铁包封率为89.21%,载药量为1.83%。SDS-PAGE结果显示CHINPs与CCM、4T1细胞裂解液具有几乎相同的蛋白谱。2.纳米粒的基本性能:CHINPs在808nm激光激发下具有良好的光热转换性能及稳定性;经SOSG探针检测,CHINPs在超声辐照下可产生ROS;DCFH-DA探针检测到CHINPs与细胞孵育后经超声辐照可产生大量的ROS。结论本研究成功制备出乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针（CHINPs）,该分子探针具有良好的光热及产生活性氧的性能。第二部分乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针同源靶向性评估及光声/磁共振双模态成像研究目的体外观察CHINPs靶向同源乳腺癌4T1细胞的能力,探讨其体外PAI及MRI效果;建立Babl/c小鼠原位乳腺癌模型,观察CHINPs体内靶向同源肿瘤及体内PAI及MRI效果,进而评估其作为双模态造影剂的体内成像能力。方法1.CHINPs体外同源靶向及光声、磁共振成像:将非靶向HINPs及靶向CHINPs分别和乳腺癌4T1细胞共孵育1h、2h、3h、4h后,在激光共聚焦显微镜及流式细胞学检查下观察4T1细胞吞噬纳米粒的情况。同时,将非靶向HINPs及靶向CHINPs分别与其他肿瘤细胞（MDA-MB-231细胞,MG63细胞,B16F10细胞）及巨噬细胞RAW264.7孵育4h后,在激光共聚焦显微镜及流式细胞学检查下观察CHINPs被不同肿瘤细胞的吞噬及逃逸巨噬细胞吞噬的情况。将不同浓度的CHINPs分别置入凝胶孔模型及2ml EP管中,观察其在激发波长为725nm时增强光声成像的效果及在磁共振成像系统下的成像效果,并对信号强度进行定量分析。2.CHINPs体内同源靶向及光声、磁共振成像:建立Babl/c小鼠原位乳腺癌模型,通过尾静脉分别注射Di R标记的HINPs或CHINPs,于不同时间点（注射前,注射后1h,3h,6h,24h及48 h）进行小鼠活体荧光成像,然后以成像系统软件测量小鼠肿瘤区域荧光信号值,评估CHINPs靶向肿瘤的性能。同时于注射纳米粒24 h后,处死小鼠,取肿瘤和重要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行离体组织荧光成像,并进一步通过ICP-MS定量分析CHINPs的组织分布情况。通过荷瘤小鼠尾静脉

关键词：肿瘤细胞膜分子探针 HMME SPIO ROS 同源靶向光声成像磁共振成像双模态成像声动力治疗光热治疗免疫治疗细胞膜

内质网膜包裹脂质体靶向递药系统治疗乳腺癌的初步研究

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内质网膜包裹脂质体靶向递药系统治疗乳腺癌的初步研究

作者：刘鑫龙西南大学

学位级别：硕士

细胞膜包裹递药系统是将内源性细胞膜材料包裹在载药纳米粒子表面,可完整保留细胞膜原有表达的功能性蛋白,并承继相应的生物学功能。因此,使细胞膜包裹递药系统具有良好的生物相容性和靶向特异性。近年来细胞膜包裹递药系统的研究,主要... 详细信息

细胞膜包裹递药系统是将内源性细胞膜材料包裹在载药纳米粒子表面,可完整保留细胞膜原有表达的功能性蛋白,并承继相应的生物学功能。因此,使细胞膜包裹递药系统具有良好的生物相容性和靶向特异性。近年来细胞膜包裹递药系统的研究,主要集中在红细胞、巨噬细胞以及肿瘤细胞等的细胞外膜包裹的递药系统。然而,细胞还含有细胞内膜系统,其不仅与细胞外膜组成相同,且可赋予递药系统更丰富的生物学功能。为此,本课题利用纳米载药系统表面的负电荷与细胞膜内外不对称电荷的相互作用,以DSPE-mPEG修饰的脂质体PLip作为内核纳米载体,分别构建由内质网膜(Endoplasmic reticulum membrane,ER)包裹脂质体ER@PLip和肿瘤细胞膜(Cancer cell membrane,CM)包裹脂质体CM@PLip。将ER@PLip与CM@PLip的体内外功能和乳腺癌治疗效果进行比较和评价,考察ER@PLip作为新型细胞膜包裹肿瘤靶向递药系统的可行性。相比CM@PLip,ER@PLip作为一种新型细胞内膜包裹递药系统表现出以下特征:(1)内质网膜作为膜面积最大的细胞内膜系统,使ER膜材料具有较高的提取产率,有效地降低了ER@PLip制备成本;(2)ER膜所表达的CD47蛋白和肿瘤表面粘附分子蛋白,使ER@PLip具有体内长循环和肿瘤主动靶向功能;(3)ER@PLip可与PD-1/PD-L1阻断多肽针对乳腺癌发挥协同药效;(4)ER膜表面钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的表达,可促进肿瘤免疫微环境的正向调控,提高肿瘤免疫治疗效果。第一部分进行了内质网包裹脂质体(ER@PLip)的构建及表征。首先从小鼠乳腺癌4T1细胞中,分别提取得到ER膜和CM膜材料。以磷脂含量作为衡量单位提取产率的标准,发现ER膜提取产率是CM膜的2.48倍。通过Western blot实验对两种细胞膜材料肿瘤表面粘附蛋白和CD47蛋白表达情况进行分析,发现两种细胞膜材料均表达肿瘤表面粘附蛋白(EpCAM、N-cadherin)和CD47蛋白,证实ER膜在主要功能性蛋白表达方面与CM膜并无明显差异。CRT蛋白Elisa定量分析,发现ER膜的CRT蛋白表达量明显高于CM膜材料,表明ER膜材料可能在CRT蛋白介导的肿瘤免疫微环境调控能力方面存在优越性。使用微型脂质体挤出器制备了ER@PLip,粒径为138 nm左右。通过对比ER@PLip制备前后表面电位变化、透射电镜观察壳-核结构以及细胞膜材料与内核脂质体荧光共定位实验,证实ER膜材料成功包裹在PLip表面。通过SDS-PAGE实验,证实ER@PLip基本承继了ER膜的功能性蛋白。第二部分开展了ER@PLip体外生物学功能评价。分别以巨噬细胞RAW264.7和小鼠乳腺癌细胞4T1为细胞摄取模型,考察了ER@PLip体外逃逸巨噬细胞吞噬和肿瘤主动靶向功能。实验结果证实ER@PLip可逃逸巨噬细胞识别和吞噬作用,并对4T1细胞具有特异性靶向能力。此外,溶酶体荧光共定位实验证实ER@PLip较CM@PLip和PLip可更好地逃逸溶酶体降解。以依托泊苷(Vepeside,VP16)作为模型药物,制备了载药脂质体ER@PLip/VP16,稳定性实验显示ER@PLip/VP16在72 h内稳定性良好。体外释放实验发现ER@PLip/VP16相比PLip/VP16,释放速率明显降低。MTT药效实验中,ER@PLip/VP16可有效抑制4T1细胞增殖。体外溶血实验中,ER@PLip/VP16可以有效降低VP16的溶血作用。第三部分考察了ER@PLip体内长循环和肿瘤靶向功能。药代动力学实验结果显示ER@PLip/VP16以及CM@PLip/VP16的体内循环时间较PLip/VP16显著延长。以4T1乳腺癌荷瘤小鼠作为动物模型,动物活离体成像以及肿瘤组织荧光切片结果显示,ER@PLip与CM@PLip在肿瘤部位荧光蓄积强度相近,并显著高于PLip组。组织分布实验对肿瘤靶向功能进一步定量分析,实验结果与小鼠活离体成像结果相近。除此之外,还发现ER@PLip/VP16和CM@PLip/VP16在肝肾脾等代谢组织中含量显著低于PLip组,进一步证实内源性细胞膜材料的外部包裹作用,可有效降低肝脾等网状内皮系统对制剂清除。综上,ER@PLip由于ER膜材料表面CD47蛋白以及肿瘤表面粘附蛋白的表达,使其具有可与CM@PLip/VP16媲美的体内长循环和肿瘤主动靶向功能,已展现出其作为新型细胞膜包裹肿瘤靶向递药系统的潜力。第四部分评价了ER@PLip与免疫检查点阻断多肽PPA-1联合治疗乳腺癌疗效及体内安全性。以4T1乳腺癌荷瘤小鼠作为治疗模型,并设定不同治疗组。肿瘤生长曲线结果显示,ER@PLip/VP16组抑瘤率为73.38%,在单一治疗组中抑瘤效果最明显,且ER@PLip/VP16+PPA-1联合治疗组的抑瘤率可达87.52%,在所有治疗

关键词：内质网膜肿瘤细胞膜递药系统肿瘤免疫微环境抗肿瘤

基于肿瘤细胞膜的仿生纳米药物投递系统研究进展

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武汉大学学报（医学版） 2020年第6期41卷 944-948页

作者：王江团麦泽森丁晓雯周浩桐王媛张文婷黄清花金花广东医科大学医学技术学院广东东莞523808 广东医科大学药学院广东东莞523808

随着纳米科技的发展,纳米载药传输系统已被广泛用于肿瘤的诊断和治疗。而基于肿瘤细胞膜的仿生纳米药物投递系统,综合了纳米药物高度靶向性与肿瘤细胞生物相容性的特点。通过模拟癌细胞膜的微观结构及作用机制构建的智能仿生纳米载体,... 详细信息

随着纳米科技的发展,纳米载药传输系统已被广泛用于肿瘤的诊断和治疗。而基于肿瘤细胞膜的仿生纳米药物投递系统,综合了纳米药物高度靶向性与肿瘤细胞生物相容性的特点。通过模拟癌细胞膜的微观结构及作用机制构建的智能仿生纳米载体,具有提高药物的靶向性、促进药物免疫逃逸的优越性,为各种肿瘤治疗提供了可能性,且在与饥饿疗法或光热疗法等的联合治疗策略中表现出良好的治疗效果。本文就基于肿瘤细胞膜的仿生纳米药物投递系统的特点及用途进行综述。

关键词：肿瘤细胞膜仿生纳米药物联合治疗纳米药物投递系统混合膜

双功能融合膜纳米粒子水凝胶的制备及其抗肿瘤疗效评价

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肿瘤综合治疗电子杂志 2023年第3期9卷 120-128页

作者：邵镜伊柯耀华陶亚萍岑兰奇刘芹刘宝瑞南京中医药大学鼓楼临床医学院肿瘤中心南京210008 南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心南京210008 中国药科大学南京鼓楼医院肿瘤中心南京210008

目的制备双功能融合膜纳米粒子海藻酸盐水凝胶(fusion membrane nanoparticles/alginate,FM-NPs/ALG),在H22小鼠肝癌皮下瘤术后复发模型中评价其预防肿瘤复发的疗效并初步探究其免疫机制。方法分别提取H22肿瘤细胞膜(tumor cell membran... 详细信息

目的制备双功能融合膜纳米粒子海藻酸盐水凝胶(fusion membrane nanoparticles/alginate,FM-NPs/ALG),在H22小鼠肝癌皮下瘤术后复发模型中评价其预防肿瘤复发的疗效并初步探究其免疫机制。方法分别提取H22肿瘤细胞膜(tumor cell membrane,TM)和草分枝杆菌细菌膜(Mycobacterium phlei membrane,MM),在脂质体挤出器上制备成粒径约为100 nm的融合膜,并将其负载于海藻酸盐(alginate,ALG)水凝胶中构成FM-NPs/ALG,在H22小鼠肝癌皮下瘤术后复发模型中以生理盐水作为对照组,观察FM-NPs/ALG延缓肿瘤复发的疗效,并使用流式细胞术等探究可能的抗肿瘤免疫机制。结果成功制备了TM和MM的融合膜纳米粒子(fusion membrane nanoparticles,FM-NPs),平均粒径为87.4 nm。体外实验表明,与对照组相比,FM-NPs使树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化的比例提高了约3.4倍。动物实验证实FM-NPs/ALG治疗能显著延缓肿瘤复发,在30 d内小鼠的平均肿瘤体积仅为对照组的17.3%;流式细胞术显示,FM-NPs/ALG能显著促进肿瘤引流淋巴结中DCs的活化,从而提高肿瘤浸润性T淋巴细胞(tumor-infiltrating T lymphocytes,TILs)的比例。治疗期间,小鼠的体重、重要器官脏器和肝肾功能等各项指标均在正常范围内。结论FM-NPs/ALG可以有效促进TILs的比例,延缓H22肝癌皮下瘤切除术后的复发并延长荷瘤小鼠的生存期,且该治疗方式具有良好的安全性。

关键词：海藻酸盐水凝胶肿瘤细胞膜草分枝杆菌细菌膜融合膜纳米粒子肿瘤免疫治疗