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新型双靶标肿瘤外泌体生物传感器的开发

新型双靶标肿瘤外泌体生物传感器的开发

2024中国肿瘤标志物学术大会暨CACA整合肿瘤学高峰论坛暨第十七届肿瘤标志物青年科学家论坛暨中国肿瘤标志物产业创新大会

作者：黄峰梁君婷李锦柱陈慧芝周郁斌广东医科大学

研究目的:外泌体(exosomes)是由细胞内多囊泡体(MVE)与细胞膜融合释放到胞外具有脂质双分子层,直径分布在30到150 nm不等的囊泡。其携带着来自供体细胞许多重要生物分子,如蛋白质、核酸及脂质等,可作为细胞间通讯的重要载体,同时也可作... 详细信息

研究目的:外泌体(exosomes)是由细胞内多囊泡体(MVE)与细胞膜融合释放到胞外具有脂质双分子层,直径分布在30到150 nm不等的囊泡。其携带着来自供体细胞许多重要生物分子,如蛋白质、核酸及脂质等,可作为细胞间通讯的重要载体,同时也可作为多数疾病无创性液体活检的重要标志物,如肿瘤。本研究旨在开发一种新型双靶标肿瘤外泌体生物传感器,实现对肿瘤外泌体便捷、精准检测,为精准医疗及肿瘤诊断的液体活检提供参考。本报告聚焦于传感器开发中的关键元素——二苯乙烯分子的构建。材料与方法:传感器研究的总体路线为:同时联合外泌体特异性标志物适配体(AptESM)及肿瘤特异性标志物适配体(AptTSM),并结合二苯乙烯类化合物(Stilbenes, ST)构建基于荧光衰减的双靶标肿瘤外泌体生物传感器。本报告聚焦于二苯乙烯分子的构建,拟首先通过HECK等反应合成两端具有偶联活性基团的ST;另一方面,通过差速离心法提取肿瘤细胞外泌体;研究结果为构建基于荧光衰减信号的双靶标肿瘤外泌体传感器提供重要基础。结果:通过对外泌体的多维度表征,结果显示成功提取肿瘤外泌体;另一方面,质谱及核磁共振等数据表明成功合成两端具有偶联活性基团的ST。结论:本研究合成了两端具有偶联活性基团的ST,为构建基于荧光衰减信号的适配体传感器、用于双靶标肿瘤外泌体定性定量分析提供重要基础。

关键词：肿瘤标志物肿瘤外泌体荧光检测二苯乙烯分子

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工程化外泌体介导巨噬细胞清除肿瘤外泌体

中国生物工程杂志 2022年第6期42卷 1-11页

作者：王璐陈梦丽何芳项建尹斌成叶邦策华东理工大学生物反应器国家重点实验室上海200237 浙江工业大学药学院长三角绿色制药协同创新中心杭州310032 石河子大学化学化工学院石河子832003

目的:通过膜表面修饰改造技术构建工程化外泌体(engineered exosomes,enExos),并以此介导巨噬细胞特异性清除膜表面富含表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的肿瘤外泌体。方法:利用表面展示技术获得膜表面展示趋... 详细信息

目的:通过膜表面修饰改造技术构建工程化外泌体(engineered exosomes,enExos),并以此介导巨噬细胞特异性清除膜表面富含表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的肿瘤外泌体。方法:利用表面展示技术获得膜表面展示趋化因子(chemokine 8,CXCL8)的外泌体,同时在其磷脂双分子层上修饰EGFR核酸适配体制备工程化外泌体;纳米颗粒跟踪和纳米粒度电位分析enExos的尺寸、电位;CCK-8试剂盒检测细胞活力;透射电子显微镜观察enExos与高表达EGFR的肿瘤外泌体的特异性结合;荧光成像技术及流式细胞术分析探究enExos靶向趋化巨噬细胞吞噬高表达EGFR的肿瘤外泌体。结果:成功构建膜表面展示EGFR与CXCL8的工程化外泌体,enExos可以特异性识别并捕获高表达EGFR的肿瘤外泌体,同时利用其趋化因子CXCL8特异性靶向巨噬细胞膜表面趋化因子受体CXCR1/CXCR2,刺激巨噬细胞对肿瘤外泌体的捕获及清除。结论:工程化外泌体促进了特定肿瘤外泌体的清除,为后续深入研究工程化外泌体抑制癌症转移的作用奠定基础,并期望为癌症转移治疗提供新的研究方向。

关键词：工程化外泌体肿瘤外泌体表皮生长因子受体白细胞介素-8 吞噬

基于响应型DNA纳米结构的新型肿瘤外泌体检测方法构建及应用研究

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基于响应型DNA纳米结构的新型肿瘤外泌体检测方法构建及应用研究

作者：朱镜儒济南大学

学位级别：硕士

外泌体是含有特定蛋白、核酸以及脂质的一类细胞外囊泡。研究发现,癌细胞产生的外泌体作为一种细胞间通讯方式,能够促进细胞生长,增加肿瘤的侵袭性和转移性。近年来,液体活检作为一种非侵袭性的筛查方法广受关注,外泌体作为其潜在的生... 详细信息

外泌体是含有特定蛋白、核酸以及脂质的一类细胞外囊泡。研究发现,癌细胞产生的外泌体作为一种细胞间通讯方式,能够促进细胞生长,增加肿瘤的侵袭性和转移性。近年来,液体活检作为一种非侵袭性的筛查方法广受关注,外泌体作为其潜在的生物标志物,在癌症诊断和治疗方面具有较强的临床应用前景。由于外泌体表面蛋白并不是完全异质性的,导致不同来源外泌体之间具有相同的蛋白标志物,因此外泌体的准确检测仍然是一个巨大的挑战。此外,分析外泌体表面蛋白种类与表达水平,发掘潜在肿瘤标志物的蛋白组合,有助于癌症的早期诊断和预后治疗。本论文以DNA纳米结构,结合等温核酸扩增技术及CRISPR/Cas系统构建了两种检测外泌体的新型生物传感器,本文研究的内容如下:第一部分:提出了一种无需复杂分离纯化外泌体的特异性检测分析方法,该方法通过双滚环扩增构建DNA水凝胶,对细胞上清液中的外泌体进行捕获,最大程度降低对外泌体的损伤,实现样品免分离纯化;接下来释放的外泌体通过双特异性识别结合,引发CHA反应,形成大量的ds DNA可作为CRISPR/Cas12a的目标物,激活其独特的反式切割活性,切割荧光探针,实现目标物的特异灵敏检测。另外,该策略仅通过更换适配体序列就可实现不同来源外泌体的检测,从而获得蛋白图谱。该方法具有免分离纯化、操作简便、实验周期短等优势,有望成为早期疾病诊断、精确分析外泌体亚群的有力工具。第二部分:流式细胞仪是一种对单颗粒如外泌体、细胞等进行多参数统计和定量分析的仪器,能够实现200 nm以上颗粒的检测,而外泌体尺寸太小,传统的流式细胞仪无法完成其准确检测。因此构建了一种RCA介导的流式细胞术检测方法,可实现外泌体快速检测和表面蛋白分析。在肿瘤源性外泌体存在时,两条带有适配体序列的单链与外泌体蛋白结合,双识别邻近介导连接探针的产生,形成圆形模板触发RCA,其产物为富G序列,可形成G-四链体,嵌入荧光基团,产生放大的荧光信号实现荧光检测。由于RCA发生在外泌体表面,一定程度上增加了检测颗粒的尺寸,使其达到流式检测的要求,为癌症诊断提供了一种新思路。理论上,通过改变蛋白识别序列便能分析不同外泌体表面蛋白,因此该方法具有实现高通量检测的潜力。

关键词：肿瘤外泌体 DNA纳米结构等温核酸扩增 CRISPR/Cas系统

肝肾组织培养微流控芯片的构建及其在肿瘤外泌体器官趋向性研究中的应用

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肝肾组织培养微流控芯片的构建及其在肿瘤外泌体器官趋向性研究中...

作者：田鸿竹大连医科大学

学位级别：硕士

目的:构建基于微流控芯片的肝肾组织培养技术平台,进而在该平台上研究肿瘤细胞外泌体在肿瘤转移中的作用。材料和方法:本实验采用常规紫外光刻胶技术制备SU-8模板,灌注聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),获得微流控芯片的膜片... 详细信息

目的:构建基于微流控芯片的肝肾组织培养技术平台,进而在该平台上研究肿瘤细胞外泌体在肿瘤转移中的作用。材料和方法:本实验采用常规紫外光刻胶技术制备SU-8模板,灌注聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),获得微流控芯片的膜片,打孔后使用预聚物热固化的方法完成膜片与多孔膜的封接,夹具夹紧备用。本实验所用细胞包括人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)、乳腺癌(Breast cancer,BC)细胞系MDA-MB-231和MCF7,分别使用ECM、L-15、DMEM/F12培养液进行培养。微流控芯片组织培养池底部用1:8的Matrigel(BD公司)包被后接种HUVEC,待细胞生长达到紧密连接,使用分子量为10 k Da的FITC-Dextran评价其渗透性。实验动物选取1周龄SD大鼠,麻醉后取大鼠的肝和肾组织,使用徕卡活组织振动切片机VT1200S制备直径5 mm厚度250μm的精密组织切片(Precision-cut Tissue Slices,PTS)本文中包括精密肝切片(Precision-cut Liver Slices,PLS)、精密肾切片(Precision-cut Kidney Slices,PKS),置于微流控芯片组织培养池内培养。采用注射泵驱动微通道内的培养液以0.75μL/min恒定流速对PTS进行灌流培养24 h后将培养的PLS、PKS各分为两组,一组用Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色,直接鉴定PTS内的细胞活性;另外一组多聚甲醛固定,OCT包埋,苏木精和伊红染色检查组织结构的完整性,使用Ki67抗体进行免疫荧光染色考察细胞的增殖能力,CXCL12抗体进行免疫荧光染色检测PTS趋化因子分泌功能。采用培养0 h的PTS作为对照组。收集MDA-MB-231和MCF7细胞培养48 h的培养基,采用商品化外泌体提取试剂盒Total Exosome Isolation分别提取两种细胞分泌的外泌体。透射电镜成像观察外泌体形态。蛋白质印迹法(Western Blot,WB)鉴定外泌体蛋白表达,具体检测指标包括CD63、CD81、Hsp70、CXCR4、GAPDH。将PKH67标记的MDA-MB-231外泌体加入PTS培养微流控芯片内,与PTS共孵育30 min、60 min,之后考察外泌体的组织趋向性。动物实验选取2周龄的SD大鼠,鼠尾静脉注射PKH67标记的MDA-MB-231外泌体(10μg),24 h后麻醉大鼠,取肝、肾组织,多聚甲醛固定,OCT包埋,制备冰冻切片,DAPI染色,检查外泌体的组织趋向性。利用ELISA试剂盒分别检测PLS、PKS的CXCL12分泌量。外泌体组织趋向抑制实验选取CXCR4受体拮抗剂AMD3100,使用梯度浓度的AMD3100与MDA-MB-231外泌体孵育过夜,然后将外泌体加入PTS培养微流控芯片通道内与组织培养池内的PTS共孵育,考察外泌体的肝趋向性抑制情况。动物实验选取2周龄SD大鼠,在10μg/100μL荧光标记MDA-MB-231外泌体稀释液体系中,加入AMD3100使其终浓度达2μg/m L后共孵育过夜,鼠尾静脉注射,24 h后麻醉大鼠,取肝和肾组织检查外泌体的组织趋向性。结果:本研究构建的PTS培养微流控芯片从下向上依次为:下层PDMS膜片,蚀刻有微通道;聚碳酸酯膜,布满8μm孔径的微孔;中间层PDMS膜片,有2个组织培养池;顶层PDMS膜片,用于封闭组织培养池;整体使用夹具夹紧备用。将大鼠的肝和肾组织制成直径5 mm、厚度250μm的PTS,在PTS培养微流控芯片的培养池内灌流培养24 h。与体外培养0 h的对照组PTS相比较,Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色显示两种PTS内的细胞均保持良好的活性,活性率达90%以上;HE切片显示两种PTS均保持完整的组织结构;Ki67染色结果显示PTS内的细胞保持良好的增殖能力;CXCL12染色结果显示PTS保有趋化因子分泌功能。这部分结果提示基于微流控芯片的PTS培养,至少在24 h内可以维持PTS的细胞活性、组织形态结构、细胞增殖能力和趋化因子分泌功能。进而,我们基于该微流控芯片考察了肿瘤细胞外泌体的组织趋向性。从MDA-MB-231和MCF7细胞培养液中分离获得外泌体,电镜检查结果显示外泌体为标准茶托状双层膜结构,WB结果显示外泌体表达典型的标志物,如CD63、CD81、Hsp70蛋白等。基于微流控芯片的外泌体组织趋向性实验结果显示,与肾组织比较,MDA-MB-231外泌体(p外泌体(p<0.01)具有明显的肝趋向性,且高转移细胞MDA-MB-231比低转移细胞MCF7的

关键词：微流控芯片精密组织切片肿瘤外泌体器官趋向性 CXCL12/CXCR4生物轴

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肿瘤外泌体的提取与鉴定

现代肿瘤医学 2018年第20期26卷 3341-3344页

作者：叶冬熳于韬中国医科大学肿瘤医院辽宁省肿瘤医院超声科辽宁沈阳110042

外泌体是由各种细胞产生的囊泡样结构,包含蛋白质、脂质、遗传物质如mRNA、miRNA等,能参与到肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中。外泌体对于肿瘤的早期诊断、治疗、预后检测均有重要的作用。根据其生物学特性,外泌体可以在体液中检测到,... 详细信息

外泌体是由各种细胞产生的囊泡样结构,包含蛋白质、脂质、遗传物质如mRNA、miRNA等,能参与到肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中。外泌体对于肿瘤的早期诊断、治疗、预后检测均有重要的作用。根据其生物学特性,外泌体可以在体液中检测到,本文就外泌体的收集、提取及鉴定外泌体的方法进行概述。

关键词：肿瘤外泌体外泌体提取外泌体鉴定

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肿瘤外泌体在癌症中的功能相关性研究进展

黑龙江医学 2023年第14期47卷 1786-1789,F0003页

作者：段慧明广西中医药大学科学实验中心·广西中医基础研究重点实验室广西南宁530200

外泌体是一种由细胞分泌到胞外的大小为30~150 nm的膜囊泡,它们可将含有的各种生物活性物质运送到受体细胞,介导复杂的细胞间通讯,以维持正常生理机能,或引发严重的疾病进展,其中肿瘤分泌的外泌体在癌症中起着关键作用,可以改变局部和... 详细信息

外泌体是一种由细胞分泌到胞外的大小为30~150 nm的膜囊泡,它们可将含有的各种生物活性物质运送到受体细胞,介导复杂的细胞间通讯,以维持正常生理机能,或引发严重的疾病进展,其中肿瘤分泌的外泌体在癌症中起着关键作用,可以改变局部和全身微环境,本研究主要介绍肿瘤外泌体在癌症发展中的五个方面的作用,包括肿瘤的增殖耐药、肌成纤维细胞分化、血管生成、转移以及免疫。

关键词：肿瘤外泌体癌症功能

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肿瘤外泌体检测新策略研究

肿瘤外泌体检测新策略研究

2022CCTB中国肿瘤标志物学术大会暨中国整合肿瘤学大会暨第十六届肿瘤标志物青年科学家论坛暨中国肿瘤标志物产业创新大会

作者：梁君婷朱晓娴陈慧芝周清周郁斌广东医科大学广州中医药大学

研究目的:外泌体(exosomes)是一种由细胞分泌的、具有脂质结构的细胞外微囊泡,包含蛋白质、脂质、核酸等生物分子,存在于各种体液中。外泌体可携带供体细胞中的一些物质,被认为是细胞间通讯和物质交换的重要载体,可通过直接或间接的形... 详细信息

研究目的:外泌体(exosomes)是一种由细胞分泌的、具有脂质结构的细胞外微囊泡,包含蛋白质、脂质、核酸等生物分子,存在于各种体液中。外泌体可携带供体细胞中的一些物质,被认为是细胞间通讯和物质交换的重要载体,可通过直接或间接的形式调控细胞的功能和生物学行为。研究表明,外泌体参与肿瘤疾病的发展进程,可作为肿瘤的无创液体活检中重要的标志物,其分析检测方法的建立具有重要意义。本研究旨在开发一种动力学型荧光生物传感器,对肿瘤外泌体进行便捷、快速的分析检测。材料与方法:本研究通过"一步法"制备动力学型生物传感器;另一方面,通过经典超高速冷冻离心法提取肿瘤外泌体。通过生物传感器与肿瘤外泌体的特异性结合,在一定波长的光激发下,收集其荧光变化信号,进而计算其表观荧光动力学参数,从而实现外泌体的检测并进行定性定量分析。结果:表征数据显示动力学型生物传感器和肿瘤外泌体已成功制备。该传感器性能考察结果表明,其对肿瘤外泌体具有较好的响应,表观荧光衰减动力学参数变化较为明显,有一定检测外泌体的能力。进一步研究表明,该传感器在肿瘤外泌体的检测中具有有较好的线性关系及检测限。结论:本研究构建了一种用于肿瘤外泌体检测的基于荧光动力学的生物传感器。该生物传感器对外泌体表现出较好的检测效果,有望成为一种用于肿瘤疾病早期诊断和进程监测的液体活检新方法。

关键词：荧光衰减生物传感器肿瘤外泌体肿瘤标志物

基于适配体结构变化和HCR信号放大的肿瘤外泌体的电化学检测

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基于适配体结构变化和HCR信号放大的肿瘤外泌体的电化学检测

中国化学会第十四届全国电分析化学学术会议

作者：张卉郭群群蔡称心南京师范大学化学与材料科学学院

外泌体(exosomes)是由细胞分泌的、大小为30-150 nm的细胞外囊泡,它们存在于多种体液中。肿瘤外泌体是癌症液体活检的重要检测物,对其进行快速和灵敏的检测对癌症的早期诊断和治疗监控具有极其重要的意义。本研究中,我们以CCRF-CEM肿瘤... 详细信息

外泌体(exosomes)是由细胞分泌的、大小为30-150 nm的细胞外囊泡,它们存在于多种体液中。肿瘤外泌体是癌症液体活检的重要检测物,对其进行快速和灵敏的检测对癌症的早期诊断和治疗监控具有极其重要的意义。本研究中,我们以CCRF-CEM肿瘤细胞来源的外泌体为模型,利用核酸适配体特异性结合外泌体膜上的细胞膜蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)蛋白所引起的结构变化,并结合核酸外切酶辅助循环及HCR信号放大,实现了对其高灵敏度的电化学检测。在最佳条件下,对CCRF-CEM外泌体的线性检测范围为4×10-1.6×10particles/μL,检测限为500 particles/μL,与其它方法相比,我们设计的方法具有较高的灵敏度和检出限,另外,利用该方法,可以检测其他含有PTK7蛋白的肿瘤外泌体。

关键词：肿瘤外泌体电化学适配体 HCR

引物交换反应辅助的肺癌外泌体电化学分析新方法研究

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引物交换反应辅助的肺癌外泌体电化学分析新方法研究

作者：沙玲君上海大学

学位级别：硕士

肺癌是仅次于乳腺癌的高发恶性肿瘤,也是全球癌症死亡的首要原因。为了克服影像学筛查在早期诊断中的技术局限性,液体活检已经成为肺癌诊断领域关注的新发展方向,而肺癌外泌体是其中颇具潜力的生物标志物之一。研发准确且灵敏的肺癌外... 详细信息

肺癌是仅次于乳腺癌的高发恶性肿瘤,也是全球癌症死亡的首要原因。为了克服影像学筛查在早期诊断中的技术局限性,液体活检已经成为肺癌诊断领域关注的新发展方向,而肺癌外泌体是其中颇具潜力的生物标志物之一。研发准确且灵敏的肺癌外泌体分析新方法对于提高肺癌早期诊断的准确性和及时性具有重要的意义。核酸扩增反应是分子生物学中常用的体外扩增技术,凭借其高扩增能力与和高灵敏性的电化学检测技术结合,可以显著提升肿瘤外泌体电化学检测的灵敏性。引物交换反应是近年来新兴的核酸扩增技术,其以DNA催化发夹作为模板促发DNA循环扩增反应,可以在短时间内产生大量的特定DNA产物。因此,在本论文中,我们以引物交换反应为基础,结合成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas12a)催化的循环切割反应,显著提升了电化学检测信号并依此提出了两种肺癌外泌体定量分析的新方法。主要工作内容如下:1.基于引物交换反应的PD-L1阳性肺癌外泌体电化学分析新方法研究非小细胞肺癌是肺癌中最为常见的类型之一,占所有肺癌病例的80%以上。肺癌外泌体表面的程序性死亡配体1(PD-L1)因为可以抑制T细胞的活性,与非小细胞肺癌的病程进展密切相关,因此,PD-L1阳性的肺癌外泌体成为了一类新兴的肺癌液体活检标志物,用于非小细胞肺癌患者的早期诊断和实时监测。在这部分工作中,PD-L1阳性的肺癌外泌体首先被PD-L1抗体功能化的磁珠捕获,其后,进一步结合胆固醇功能化的催化发夹DNA,引发级联信号放大反应。级联信号放大反应从催化发夹DNA触发的引物交换反应开始,其产生的大量延伸产物可以激活Cas12a蛋白的反式切割活性。随后,Cas12a催化的随机切割反应促发了亚甲基蓝标记的DNA信号链降解反应,释放了其末端具有电活性的亚甲基蓝分子。最后,游离的亚甲基蓝分子被富集到葫芦[7]脲功能化的石墨电极表面,产生适用于PD-L1阳性肺癌外泌体定量分析的电化学信号。电化学分析结果表明,该方法在PD-L1阳性肺癌外泌体分析方面具有较高的灵敏度和特异性,线性检测范围为10至10个外泌体/毫升,检测限低至708个外泌体/毫升。同时,此方法能够在临床血清样本中有效检测PD-L1阳性的肺癌外泌体的水平变化,而且获得的电化学信号强度与肺癌病程发展呈正相关,有望用于监测非小细胞肺癌患者的病程发展。2.引物交换反应辅助的肺癌外泌体双信号电化学分析新方法研究液体活检作为一种无创或微创的非侵入疾病诊断手段,可以在一定条件下提高疾病诊断的准确率。然而,由于外泌体分泌可能受到生理或病理环境中各种因素的影响,肺癌外泌体的分泌水平存在个体差异,因而外泌体液体活检在肺癌精准诊断中可能有所局限。在这部分工作中,我们制备了两种DNA探针:一种是胆固醇修饰的DNA探针,其可以通过疏水作用插入外泌体膜;另一种是与PD-L1抗体连接的核酸-抗体探针,其可以通过特异性免疫识别与外泌体表面的PD-L1结合。同时,通过使用两种量子点(如Cd S和Pb S)分别标记DNA探针并富集相应的DNA产物,可以产生对应于总外泌体量和外泌体PD-L1水平的电化学双信号。借助电化学信号的比值可以表征外泌体分泌的个体差异,从而更加准确地在外泌体水平反映PD-L1表达状况,进一步提高肺癌患者早期筛查和分期的有效性。电化学分析结果表明,该方法可以在较宽外泌体浓度范围(10至10个外泌体/毫升)检测肺癌外泌体。当用于分析肺癌患者的临床样品时,电化学比值信号在肺癌早期筛查和分期方面表现出更好的评估准确性。

关键词：肺癌肿瘤外泌体引物交换反应 CRISPR-Cas12a 电化学检测