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肾脏类器官的研究及应用

肾脏病与透析肾移植杂志 2024年第3期33卷 245-253页

作者：王钢王谊晴梁菊(综述) 刘志红(审校) 东部战区总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心南京210016 浙江大学医学院

肾脏类器官领域的快速发展,为人类肾脏发育及肾脏疾病的研究提供了重要模型支持。肾脏类器官研究已从早期建立肾单位类器官为主,发展到输尿管胚芽/集合管类器官,从而可以更全面地模拟人类肾脏,使其更好地应用于肾脏发育模拟,疾病模型及... 详细信息

肾脏类器官领域的快速发展,为人类肾脏发育及肾脏疾病的研究提供了重要模型支持。肾脏类器官研究已从早期建立肾单位类器官为主,发展到输尿管胚芽/集合管类器官,从而可以更全面地模拟人类肾脏,使其更好地应用于肾脏发育模拟,疾病模型及药物筛选领域。此外,单细胞测序、多组学联用、基因编辑、器官芯片等新技术的交叉融合,使得对肾脏类器官的认识更全面和深入。本文将简介肾单位类器官以及输尿管胚芽/集合管类器官诱导方法、肾脏类器官细胞及结构鉴定优化、肾脏类器官的相关应用及改进措施。

关键词：肾脏类器官诱导方法疾病模型

肾脏类器官的研究进展及其在药物安全性评价中的应用

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临床肾脏病杂志 2024年第8期24卷 687-691页

作者：蒋小涵杨同金梁宁娟王岩滕晶晶安徽省疾病预防控制中心合肥230601

肾毒性是导致药物研发失败的原因之一,所以建立确定可靠的方法评价药物肾毒性是当前药物安全性评价急需解决的问题。最近,一种新型体外研究模型—类器官备受关注,可高度模拟体内组织、器官的功能结构,具有稳定的遗传特征。由于肾脏类器... 详细信息

肾毒性是导致药物研发失败的原因之一,所以建立确定可靠的方法评价药物肾毒性是当前药物安全性评价急需解决的问题。最近,一种新型体外研究模型—类器官备受关注,可高度模拟体内组织、器官的功能结构,具有稳定的遗传特征。由于肾脏类器官具备真实器官结构和功能,在药物肾毒性评价的研究中极具应用价值和发展潜力。因此,本文将对肾脏类器官的构建及其在药物安全性评价中的应用进行归纳总结,以期为肾脏类器官的药物毒性评估提供相关理论依据,帮助筛选相关药物的潜在不良反应。

关键词：肾脏类器官肾毒性药物安全性评价诱导多能干细胞

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肾脏类器官血管化的研究进展

老年医学研究 2022年第2期3卷 31-35页

作者：丁坤管勇孔峰赵升田山东大学山东济南250100 山东省立医院泌尿外科山东济南250021 山东第一医科大学附属省立医院泌尿外科山东济南250021

随着人口的老龄化,慢性肾脏病患病率的不断增加对医疗保健系统造成日益严重的负担。肾脏类器官具有肾脏再生的巨大潜力,但缺乏血管化成为其投入应用的阻碍,目前主要采用体内移植或体外培养促进血管化。体内移植依靠宿主来源的血管进入... 详细信息

随着人口的老龄化,慢性肾脏病患病率的不断增加对医疗保健系统造成日益严重的负担。肾脏类器官具有肾脏再生的巨大潜力,但缺乏血管化成为其投入应用的阻碍,目前主要采用体内移植或体外培养促进血管化。体内移植依靠宿主来源的血管进入类器官形成血管网络,尽管产生的血管尚不成熟,其仍是目前效果相对较好的血管化方案。体外培养方案则更为灵活:借助流体模拟肾脏发育的物理环境,从而促进类器官内部形成血管内皮网络;通过精确调整诱导过程的细胞信号通路,对肾单位进行节段化诱导,促使其向有利于产生血管的方向分化;引入生物材料如肾脏细胞外基质,利用其生化微环境促使血管内皮分化;3D打印技术通过直接构建血管实现高效“血管新生”,虽然目前仅能进行简单构型的打印,无法进行大体积血管化肾脏类器官的构建,但已经显示出巨大的发展潜力。

关键词：肾脏类器官血管化慢性肾脏病再生医学

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肾脏类器官研究进展及挑战

临床肾脏病杂志 2022年第6期22卷 516-520页

作者：马玉高爱民延安大学附属医院肾内科延安716000

肾脏疾病已成为全球日益严峻的公共卫生问题,迫切需要开发针对各种肾脏相关疾病的有效治疗方法。近年来,研究者提出的肾脏类器官是研究正常和病变肾脏相关疾病的重要工具,可用于疾病模型构建、治疗药物筛选和药物肾毒性检测,甚至未来有... 详细信息

肾脏疾病已成为全球日益严峻的公共卫生问题,迫切需要开发针对各种肾脏相关疾病的有效治疗方法。近年来,研究者提出的肾脏类器官是研究正常和病变肾脏相关疾病的重要工具,可用于疾病模型构建、治疗药物筛选和药物肾毒性检测,甚至未来有可能完成人类肾脏移植。本文将对哺乳动物胚胎肾发育过程、肾脏类器官构建、临床应用及目前存在挑战进行综述。

关键词：肾脏病肾脏类器官再生医学

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肾脏类器官的建立及其应用

肾脏病与透析肾移植杂志 2020年第6期29卷 550-556页

作者：吴杭迪王钢(综述) 刘志红(审校) 浙江大学医学院杭州310058 东部战区总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所

近年来,类器官作为区别于传统二维细胞以及模式动物的一种全新研究手段开始受到学术界的关注,并开始在肾脏疾病领域应用。本文将对近期肾脏类器官的诱导方法,模型建立及其在疾病研究、药物有效性及肾毒性检测以及再生医学领域的应用进... 详细信息

近年来,类器官作为区别于传统二维细胞以及模式动物的一种全新研究手段开始受到学术界的关注,并开始在肾脏疾病领域应用。本文将对近期肾脏类器官的诱导方法,模型建立及其在疾病研究、药物有效性及肾毒性检测以及再生医学领域的应用进行综述。

关键词：肾脏类器官诱导方法应用

利用人多能诱导性干细胞构建肾脏类器官相关研究

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利用人多能诱导性干细胞构建肾脏类器官相关研究

作者：姜珊山东大学

学位级别：硕士

研究背景:近年来,终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的临床患病率逐年提高,据美国肾脏病数据系统数据,美国ESRD年患病率为每百万人中有2023.6例人,其主要治疗方法为肾脏移植和透析治疗。尽管近年来相关治疗技术进步较大,但透析... 详细信息

研究背景:近年来,终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的临床患病率逐年提高,据美国肾脏病数据系统数据,美国ESRD年患病率为每百万人中有2023.6例人,其主要治疗方法为肾脏移植和透析治疗。尽管近年来相关治疗技术进步较大,但透析患者的死亡率仍然很高;而肾移植肾源紧缺是当前难题,且肾脏移植存在免疫排斥反应,需终生治疗。为突破肾脏替代治疗的局限性,肾脏再生成为研究热点。随着对干细胞研究的不断深入及再生医学的不断发展,应用干细胞进行肾脏再生为终末期肾病患者带来新的希望。干细胞(Stem Cell,SC)是一类具有自我复制功能的多潜能性细胞,在一定的条件下,具有多向地分化形成多种功能性细胞的潜能。随着对干细胞研究的不断深入,干细胞相关的应用范围已涉及了到医学的许多领域。目前,人体的胚胎干细胞已经完全能够实现体外培养过程,包括在体外进行鉴别、分离、纯化、扩增等过程,并且其己经完全可以作为种子的细胞进行下一步的定向分化和培养,已成功培养出人的组织和器官。随着先进的干细胞技术的发展及其对于衍生组织器官的广泛应用,将对一些疾病提供潜在的治疗方法手段及全新的治疗技术,1999年美国《科学》杂志把干细胞的研究列入了排在全球十大基因组测序技术和克隆技术之前的全球十大科学成果中之一。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)可以定向分化成为大多数类型的细胞,并有潜力用于修复受损组织。然而,使用ESCs存在伦理问题,因为这些细胞来自早期胚胎的内细胞团,在此过程中细胞团被破坏。相反,iPSCs可以通过上调多能因子从分化的细胞中生成,因此,iPSCs有望为再生医学提供大量难以获得的细胞资源。涉及iPSCs的再生医学研究进展显著,其治疗方法已经开始进行临床试验。此外,患者来源的诱导多能性干细胞有可能产生与疾病相关的特化细胞和相关的类器官,帮助研究人员了解相关疾病潜在的病理生理学。再生医学已越来越成为国内外学者关注的焦点,当前肾脏类器官培育己成为研究新热点,目前已取得突破性的研究进展。由于肾脏结构上和功能上的高度复杂性,肾脏类器官与正常的人肾脏还存在很大差距。首先,肾脏类器官体内移植得到的血管化是来自宿主的细小血管,无法形成成熟的血管网络,缺少功能性的血管灌流系统;其次,尽管肾脏类器官培育能产生肾小球细胞,但肾小球的过滤功能,尿液的排除无法实现。目前,肾脏类器官的体外培养过程并无统一规定的标准,我们在总结多个肾脏类器官诱导方案的基础上,同时针对上述问题,本实验将通过以下研究方法达到提高类肾器官体外诱导成熟度,促进类肾器官体外诱导过程中细胞更好的分化,获得结构更加丰富的类肾器官。研究目的:人诱导性多能干细胞(Human Induced pluripotent stem cells,hiPSCs)由于其扩增性及对发育信号的可塑性,可以诱导分化成肾脏细胞,从而模拟人类遗传肾脏疾病的发病过程。为准确了解肾脏发育过程和肾脏疾病发病机制,并最终能为治疗终末期肾病(End Stage Renal Diseases,ESRD)提供新的治疗思路,本实验将在体外利用人多能诱导性干细胞(hiPSCs)制备肾脏类器官,同时优化肾脏类器官体外培育体系,之后进行体内移植实验,从而进一步促进肾脏类器官在体内发育成熟。研究方法:***于体外诱导成肾脏类器官,具体为hiPSCs种植于T25培养瓶中,当细胞汇集到一定细胞密度后,开始依次加入CHIR99021、FGF9、肝素(Heparin)定向诱导分化因子,于体外进行至少18天的诱导过程,包括2D平面培养6天,及3D立体诱导12天,最终获得初具肾脏结构及功能特点的类肾组织。2.在进行上述方法构建肾脏类器官的同时,利用hiPSCs来源的肾元细胞进行肾脏类器官的培育,在前期培养基础上,优化肾脏类器官体外培养方案,体外诱导效率相对提高。hiPSCs-肾元细胞是从人多能干细胞(hiPSCs)分化而来的肾元祖细胞(Renal Progenitor Cells,NPC),利用hiPSCs-肾元细胞进行体外诱导、分化,最终获得肾脏类器官。3.为进一步促进肾脏类器官的成熟,我们将肾脏类器官消化成细胞团的形式,将其注射进入小鼠的肾皮质内,移植后3周开始,将体内类肾器官取出进一步鉴定。目的是研究肾皮质内微环境对肾脏类器官的影响,以及肾脏类器官消化成细胞团后,是否能在体内进一步分化、发育,得出相应结论。研究结果:1.利用hiPSCs培养肾脏类器官培育期间,根据对平面培养时的细胞观察所见,加入诱导因子后的细胞生长密度及形态上均有明显变化。在转3D培养后的第三天开始镜下观察细胞团中出现类似管状结构,并逐渐增多、成

关键词：肾脏再生人多能诱导性干细胞肾元细胞肾脏类器官肾皮质内注射

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利用人诱导多能干细胞构建肾脏类器官的研究

利用人诱导多能干细胞构建肾脏类器官的研究

作者：杜枭航山东大学

学位级别：硕士

研究背景:干细胞(StemCell,SC)是生物体内各种成熟细胞的始祖细胞。近年来,干细胞越来越多地应用于类器官的研究。所谓类器官研究是指,利用合理设计的诱导方案,在3D环境中,将某种类型的干细胞向某个器官方向诱导,从而获得与人体某脏器... 详细信息

研究背景:干细胞(StemCell,SC)是生物体内各种成熟细胞的始祖细胞。近年来,干细胞越来越多地应用于类器官的研究。所谓类器官研究是指,利用合理设计的诱导方案,在3D环境中,将某种类型的干细胞向某个器官方向诱导,从而获得与人体某脏器的结构甚至是功能相似的类器官组织。类器官研究已经应用于药物毒性检测、遗传病研究等领域,但该研究的最终目的应该是用于人体病变脏器的替换。肾脏在高等生物体内主要起清除多余水分和有毒物质的作用,以调节生物体的内环境稳态。近年来,终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的发病率逐年提高,而血液透析和肾移植作为目前主要的医学手段,各自存在一定的缺陷。如果能够制备具有功能的肾脏类器官,将其应用于临床,则很有希望解决该问题。在各种干细胞中,胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)具有最高的多能性,虽然目前的研究水平可以从人类胚胎或生殖腺中获得ESC,但该做法存在严重的伦理性问题,且缺乏多样性,临床应用前景不佳。作为其替代方案,有研究者将Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四个因子用基因载体导入人成纤维细胞内,获得了同样具有高度多能性的人类诱导多能干细胞(human Induced Pluripotent Stem Cell,hIPSC),而后者目前已经大量应用于肾脏类器官的相关研究。目前肾脏类器官的制备方案并无统一标准,我们在总结多个肾脏类器官制备方案的基础上,通过不断摸索和改进,设计了一套完整的肾脏类器官制备方案,最终获得肾脏类器官。研究目的:在体外利用hIPSC构建肾脏类器官。研究方法:首先由前文所述方法获得hIPSC,种植于培养瓶内进行2D培养,在培养获得一定细胞密度后,先后加入CHIR99021、FGF9因子对其进行为期6天的2D平面诱导;随后将细胞团转入Transwell小室内进行为期12天的3D立体诱导,最终获得肾脏类器官。我们在第1/3/6/11/18天于光镜下拍摄细胞状态图片,在上述时间点收集细胞内的蛋白,用于不同分化阶段标记物的检测,并将最终获得的肾脏类器官制作为石蜡切片,进行HE染色和免疫组化鉴定。研究结果:跟踪拍摄的光镜图片显示,2D平面培养下,加入生长因子后的hIPSC集落形成明显减少,其开始分散生长;在后续的3D立体培养中,类肾器官内部开始分化出管状结构。对第18天收获的肾脏类器官进行石蜡切片-HE染色,同样证明了此时肾脏类器官中有大量管状结构出现。进一步对管状结构进行的ECAD/PAX2/GATA3三种标记物的免疫组化鉴定发现,管状结构高度表达PAX2,低度表达ECAD,部分表达GATA3。对第1/3/6天收集的蛋白进行的数个标记物检测提示,随着诱导方案的进行,hIPSC的干细胞标记物表达量下降,而肾脏祖细胞(nephronic progenitor cell,NPC)标记物则呈上升趋势;对第1/3/6/11/18天蛋白进行的检测在证实了这一趋势的基础上,进一步发现随着诱导的进行,如PAX2、ECAD等肾小管和集合管的标记物也逐步开始表达。研究结论:利用我们设计的诱导方案,我们获得了含有大量管状结构的肾脏类器官,并推测该管状结构很可能是初级肾小管和初级集合管。

关键词：人诱导多能干细胞体外诱导肾脏类器官

基于人多能干细胞的肾脏类器官小分子定向诱导分化

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基于人多能干细胞的肾脏类器官小分子定向诱导分化

作者：吴胜兰安徽工业大学

学位级别：硕士

多能干细胞(PSCs)诱导定向分化是构建肾脏类器官的主要方法之一。前期研究主要采用细胞因子促进多能干细胞的分化。小分子由于具备高效、稳定等优势,近年来受到越来越多的关注。因此,本论文以诱导多能干细胞为研究对象,考察RhoA-ROCK和P... 详细信息

多能干细胞(PSCs)诱导定向分化是构建肾脏类器官的主要方法之一。前期研究主要采用细胞因子促进多能干细胞的分化。小分子由于具备高效、稳定等优势,近年来受到越来越多的关注。因此,本论文以诱导多能干细胞为研究对象,考察RhoA-ROCK和PI3K-AKT通路相关抑制剂对多能干细胞向肾脏类器官中的后肾间质和输尿管芽两个谱系的分化效果,并进一步探讨双通路抑制剂对分化的协同作用。主要的研究内容与结果如下:(1)人诱导多能干细胞(i PSC)细胞系的培养及qPCR引物的设计:首先是通过有饲养层培养获得i PSC细胞系,实验前将细胞转移至基质胶上进行无饲养层培养。多能干细胞的特异性标记物SSEA4,NANOG等的表达和高度活跃的碱性磷酸酶活性证明了培养的i PSC保持有良好的多能干性。为了在后续实验中实现对相关谱系细胞标记物的qPCR检测,利用Primer Premier 5.0软件和NCBI数据库的Primer-BLAST模块设计的引物进行扩增。凝胶电泳实验表明设计的引物具有专一性和稳定性。(2)RhoA-ROCK通路抑制剂对分化的影响:首先确定在单一抑制剂CYTO D和BMS-3在Activin A/BMP4和Activin A+BMP4共同存在下的细胞毒性,根据细胞的形态和活性确定合适的抑制剂浓度,进一步建立适合分化培养的方案:分化第一阶段为Activin A+BMP4+10 n M CYTO D培养。在分化过程中采用qPCR和流式分析法分析后原条时期的两个标记物T和LHX1,SIX2、WT1、HOXD11和GDNF是后肾间充质细胞的标志物和中间中胚层OSR1和PAX2的表达。通过与原方案Activin A+BMP4比较发现,Activin A+BMP4+10 n M CYTO D的分化效果与Activin A+BMP4作用相比略有提高。(3)PI3K-AKT通路抑制剂/对分化的影响:以二甲双胍和GSK两种抑制剂为研究对象,根据细胞的形态和活率对抑制剂的浓度进行筛选,确定适合的抑制剂浓度,进一步建立适合分化培养的方案。研究表明在BMP4中加入20 n M GSK能提高细胞的存活率。通过qPCR、流式细胞技术和免疫荧光法分析LHX1、SIX2、WT1、HOXD11和GDNF(后肾间充质细胞的标志物)和中间中胚层OSR1和PAX2的表达。实验结果表明BMP4+20 n M GSK的分化效果优于BMP4+Activin A作用。且在BMP4+20 n M GSK下处理1天比处理2天的效果更好。此外,2-NBDG的吸收实验证明进一步证明BMP4+20 n M GSK分化获得的细胞具有吸收葡萄糖的能力。(4)双通道小分子抑制剂对肾脏类器官分化的影响:以MEK-ERK和RhoA-ROCK通路的小分子抑制剂CYTO D、BMS-3、U0126和PD作为研究对象。首先通过细胞存活率发现,在BMP4和GSK中加入其它小分子对细胞的存活有一定的抑制。通过qPCR、流式细胞及术对LHX1和PAX2的分析可以看出,在BMP4和GSK中添加小分子使类器官中PAX2ECAD阳性的上皮细胞含量增加,但是对于不同通路小分子的作用位点等机理方面的研究还需进一步探究。

关键词：人诱导多能干细胞肾脏类器官后肾间质细胞输尿管芽细胞小分子抑制剂