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诱导性多能干细胞与肾脏再生

肾脏病与透析肾移植杂志 2014年第6期23卷 559-562,542页

作者：刘熹余晨同济大学医学院同济大学附属同济医院肾脏内科上海200065

诱导性多能干细胞来源于成熟体细胞,具有再分化为内、中、外三胚层细胞的潜能,较胚胎干细胞来源广、免疫排斥反应小,在肾脏再生领域最具发展前景。肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等多种肾脏固有细胞可被诱导为多能干细胞,诱导性多能干... 详细信息

诱导性多能干细胞来源于成熟体细胞,具有再分化为内、中、外三胚层细胞的潜能,较胚胎干细胞来源广、免疫排斥反应小,在肾脏再生领域最具发展前景。肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等多种肾脏固有细胞可被诱导为多能干细胞,诱导性多能干细胞可定向分化为肾小球足细胞、肾小管上皮细胞等肾脏固有细胞,促进肾脏再生。本文就诱导性多能干细胞在肾脏再生领域的研究进展作一综述。

关键词：诱导性多能干细胞肾脏再生慢性肾脏病

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肾脏再生的研究进展

中国血液流变学杂志 2011年第3期21卷 561-564页

作者：姚根宏（综述）南京军区南京总医院南京大学医学院临床学院输血科江苏南京210002

肾脏自身的再生能力非常有限,寻找特有的肾脏祖细胞和干细胞是目前的研究热点.对肾脏再生的机制和病理生理的分子药物设计和研究,可以达到用肾脏再生来代替血液透析和肾移植.该综述总结了肾脏再生的细胞生物学和前景方面最新研究进展.

关键词：肾脏疾病肾脏再生干细胞

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干细胞在肾脏再生中的应用研究进展

中华临床医师杂志（电子版） 2015年第12期9卷 112-117页

作者：耿晓东耿俊张航崔杰吴镝北京军区北戴河疗养院肾内科河北秦皇岛066100 解放军总医院肾脏病科北京100853 首都师范大学心理咨询中心北京100048 北京军区北戴河疗养院医务部河北秦皇岛066100

终末期肾病加剧了世界医疗资源的负担。现在迫切需要有效的策略,通过肾脏再生来预防进一步的肾损伤以及恢复肾功能。除了防止肾脏损伤,再生受损的肾组织对于延缓慢性肾脏疾病发展到终末期肾衰竭也是非常重要的。几种类型的干细胞,包括... 详细信息

终末期肾病加剧了世界医疗资源的负担。现在迫切需要有效的策略,通过肾脏再生来预防进一步的肾损伤以及恢复肾功能。除了防止肾脏损伤,再生受损的肾组织对于延缓慢性肾脏疾病发展到终末期肾衰竭也是非常重要的。几种类型的干细胞,包括骨髓来源的细胞,脂肪来源的间充质干细胞,胚胎干细胞和诱导多能干细胞都可应用于肾脏再生。基于这些研究和知识,我们希望能够创新更可靠的生物工程方法来应用于肾脏再生领域。

关键词：干细胞生物工程肾肾脏再生

京尼平交联去细胞支架诱导大鼠缺损肾脏的再生

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京尼平交联去细胞支架诱导大鼠缺损肾脏的再生

作者：杜奥玲南华大学

学位级别：硕士

【目的】肾脏的再生能力几乎为零。有学者尝试用去细胞肾脏生物支架来诱导缺损肾脏的再生,已取得一定进展。但单纯去细胞生物支架有易塌陷、变形、降解快等不足之处。肾支架植入到部分肾切除大鼠体内后,支架组织降解过快,不能为组织或... 详细信息

【目的】肾脏的再生能力几乎为零。有学者尝试用去细胞肾脏生物支架来诱导缺损肾脏的再生,已取得一定进展。但单纯去细胞生物支架有易塌陷、变形、降解快等不足之处。肾支架植入到部分肾切除大鼠体内后,支架组织降解过快,不能为组织或细胞的迁移再生提供良好的生长环境。要解决这一问题,通常需要通过交联剂来改善支架的性能,本研究拟通过京尼平交联法提高去细胞肾脏生物支架的性能,以利于组织和细胞的再生,能够为缺损肾脏的再生和修复提供更好的条件。【方法】SD大鼠90只,体重230g左右,完全随机分为正常组、未交联支架组和京尼平交联支架组。从大鼠体内结扎血管,分离肾脏,PBS经腹主动脉灌注去血后作为正常组;将离体肾脏依次灌注肝素溶液、1%TritonX-100、1%十二烷基硫酸钠(SDS)、去离子水,得到去细胞以后的肾脏生物支架,作为未交联支架组;而将制备好的去细胞生物支架浸泡在0.5%的京尼平溶液中37℃恒温箱中行化学交联12h得到京尼平交联支架组。分别用HE、Masson、免疫荧光染色观察三组肾脏的组织形态学特征;血管铸型观察三组肾脏内部脉管结构,分析支架组肾脏脉管结构的保留情况;Ⅰ型胶原酶促降解实验检测三组肾脏的抗降解能力;细胞与支架共同培养,利用CCK8、Transwell迁移、免疫荧光实验检测支架对细胞生存生长情况的影响;将大鼠左肾下1/3切除,将制备好的肾脏支架补足缺损部位,以观察交联后支架植入体内,对缺损肾脏再生能力的影响。【结果】正常大鼠肾脏去细胞过程后,得到的单纯去细胞肾脏生物支架。HE、Masson染色以及免疫组织荧光染色结果显示:生物支架已经几乎完全去除组织中的细胞核成分,保留了细胞外基质成分。经京尼平交联后的肾生物支架胶原纤维排列整齐致密,与正常组相似,可清晰看到肾小球的轮廓及肾小球部位聚集的纤维结构;从荧光结果也可以看到细胞核成分被完全去除,且Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白特异性荧光染色增强。肾脏血管铸型结果显示:去细胞肾脏生物支架中保留了完整的脉管结构,经京尼平交联后的支架也同样保留了与正常组肾脏相似的完整的脉管结构,并未损伤支架内的血管结构。Ⅰ型胶原酶促降解实验表明京尼平交联后的去细胞肾脏生物支架的抗降解能力明显提升。血管内皮细胞与各组肾脏支架共培养实验结果显示:各组肾脏支架均有细胞黏附生长,CCK8结果显示经京尼平交联后,肾支架对血管内皮细胞并无细胞毒性,而且有良好的细胞相容性,能在一定程度上促进细胞的增殖。生物支架体内植入实验结果显示:京尼平交联去细胞肾脏支架后,可见未经交联的去细胞支架很快降解,组织模糊不清,而京尼平交联后的肾脏支架补足缺损部位以后,可明显观察到有细胞移入支架,且肾小球结构清晰可见。【结论】以京尼平交联大鼠肾支架补足大鼠体内的肾脏缺损部位,能够增强支架诱导的肾脏再生和修复能力。

关键词：京尼平肾脏再生去细胞化肾脏组织工程

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斑马鱼肾脏疾病和再生模型的构建及初步研究

斑马鱼肾脏疾病和再生模型的构建及初步研究

作者：王飞西南大学

学位级别：硕士

肾脏是人体的重要器官,发育自中间中胚层,发挥着从血液中滤过代谢废物并维持体内正常酸碱和渗透压平衡的重要作用。在脊椎动物中,肾脏的最小功能单位是肾单元,包括滤过性功能的肾小球,再吸收功能的肾小管以及运输和排泄功能的收集管。... 详细信息

肾脏是人体的重要器官,发育自中间中胚层,发挥着从血液中滤过代谢废物并维持体内正常酸碱和渗透压平衡的重要作用。在脊椎动物中,肾脏的最小功能单位是肾单元,包括滤过性功能的肾小球,再吸收功能的肾小管以及运输和排泄功能的收集管。当肾单元发育缺陷或大多数肾单元结构损伤时,肾脏功能不能正常发挥,引发多种肾脏疾病。肾脏疾病具有病因复杂、并发症多、发病人群广泛等特点,临床上的检测方法包括测量血中氮含量或尿中蛋白含量。多数肾脏疾病发展到晚期形成终末期肾衰竭,血液透析或肾脏移植是临床上常用的治疗手段。肾脏如何进行损伤后再修复对于探索肾脏疾病的临床治疗十分重要。有报道显示在哺乳动物成年肾脏中存在肾脏损伤后再修复的证据,但是关于肾脏损伤后再修复的机制仍然知之甚少。因此,肾脏发育的分子调控、肾脏疾病的致病机制及肾脏损伤后再修复的分子生物学机制是近年来肾脏领域研究的热点。斑马鱼是新兴的模式动物,具有体外受精、胚胎透明和遗传操作方便等独特优势。本研究中,我们以斑马鱼为模式动物着手肾脏发育、疾病和再生展开研究。主要研究议题为：1,构建斑马鱼肾脏滤过性模型;2,斑马鱼肾.脏前肾管突变体的遗传筛选及初步研究;3,构建斑马鱼肾脏再生模型。斑马鱼肾脏滤过性模型的构建对于体外实时监测斑马鱼肾脏滤过性功能,评估肾脏健康状况具有十分重要的意义;基于斑马鱼肾脏前肾管突变体遗传筛选和机制研究,有助于深入了解斑马鱼肾脏发育的分子调控网络和肾脏疾病的致病机制,进而可能为人类肾脏发育和疾病的研究提供间接理论参考;构建斑马鱼肾脏再生模型为肾脏再生机制研究和肾脏再生的正向遗传筛选提供了实验材料。本研究第一部分中,我们通过建立一系列斑马鱼肾脏特异性表达基因的转基因品系。具体来说包括：肾小球特异性表达基因podocin转基因品系Tg(podocin:eGFP)和Tg(podocin: dsRed);肾脏早期发育决定基因pax2a转基因品系Tg(pax2a:eGFP)前肾管特异性表达基因cdh17和enpep的转基因品系Tg(cdh17:eGFP), Tg(cdhl7:dsRed)和Tg(enpep:dsRed)。最终,我们将这些转基因品系与实验室已有的血管转基因品系Tg(flkl:mcherry)杂交,初步实现了体外实时监测斑马鱼肾脏滤过性功能的模型。本研究第二部分中,我们对262个ENU诱变突变基因组的F2家族进行遗传筛选,具体为在突变基因组自交家族后代胚胎3.5dpf时,通过APStaining方法对斑马鱼肾脏前肾管染色,显微镜下观察斑马鱼前肾管表型。最终,我们在30个突变基因组自交家族中找到了57对斑马脏前肾管疑似突变体,结合疑似突变体前肾管表型对疑似突变体进行了简单的表型归类。具体为：1,突变体前肾管发育迟缓或缺陷;2,突变体前肾管迁移异常或缺陷;3,突变体前肾管膨胀。在这些突变体中,我们注意到一个非常有意思的前肾管膨胀表型突变体V3-5。经过突变体表型深入分析,同时结合已有的相关报道,我们推测V3-5突变体前肾管膨胀表型是肾脏囊肿疾病的前期表现。目前,我们正在着手寻找V3-5突变体的致变基因。本研究第三部分中,我们利用NTR/Mtz系统,成功构建了斑马鱼肾脏特异性表达基因podocin和cdh17的斑马鱼肾脏再生模型,为未来斑马鱼肾脏再生机制研究和肾脏再生正向遗传筛选提供了实验材料。通过本研究,最终我们：1,初步建成了斑马鱼肾脏滤过性功能监测模型;2,遗传筛选获得了多种斑马鱼前肾管突变体;3,成功构建了斑马鱼肾脏再生模型。

关键词：斑马鱼 ENU诱变筛选肾脏滤过性肾脏疾病肾脏再生

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间充质干细胞促进肾脏损伤修复机制研究进展

中华肾病研究电子杂志 2024年第2期13卷 87-91页

作者：付章宁耿晓东张永军陆宇平孙冠南张益帆蔡广研陈香美洪权解放军医学院北京100853 解放军总医院第一医学中心肾脏病医学部、肾脏疾病国家重点实验室、国家慢性肾病临床医学研究中心、肾脏疾病研究北京市重点实验室北京1008533 中央军委机关事务管理总局服务局保健室北京100034

间充质干细胞具有强大的自我更新、多向分化和旁分泌能力,在肾脏疾病的治疗中展现出了良好的应用前景。本文综述了间充质干细胞在肾脏损伤修复中的作用机制,旨在为间充质干细胞的临床应用提供参考依据。

关键词：肾脏疾病间充质干细胞肾脏再生旁分泌

成体肾脏干/祖细胞特异性标记分子研究中的争议

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肾脏病与透析肾移植杂志 2017年第4期26卷 351-354,348页

作者：吴燕升(综述) 高建东(审校) 上海中医药大学附属曙光医院肾病科上海中医药大学中医肾病研究所上海市中医临床重点实验室上海201203

目前已有大量研究证实肾脏中干/祖细胞的存在,成为损伤后细胞修复新的研究方向。虽然诸多研究证实了成体肾脏干/祖细胞通过增殖和(或)旁分泌作用保护肾脏损伤,但是对于成体肾脏中是否真实存在促进肾脏发育和再生的干/祖细胞,学术界仍存... 详细信息

目前已有大量研究证实肾脏中干/祖细胞的存在,成为损伤后细胞修复新的研究方向。虽然诸多研究证实了成体肾脏干/祖细胞通过增殖和(或)旁分泌作用保护肾脏损伤,但是对于成体肾脏中是否真实存在促进肾脏发育和再生的干/祖细胞,学术界仍存在大量争议。成体肾脏包囊和肾小管中CD133和CD24双阳性细胞被认为是成体肾脏干/祖细胞的特异性标记分子,为肾脏细胞损伤后再生提供了可能性。自体肾脏干细胞的体外培养可能会成为慢性肾脏病尤其是终末期肾病一种有前景的治疗手段。

关键词：成体肾干/祖细胞分化型小管细胞包囊足细胞肾脏再生

利用人多能诱导性干细胞构建肾脏类器官相关研究

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利用人多能诱导性干细胞构建肾脏类器官相关研究

作者：姜珊山东大学

学位级别：硕士

研究背景:近年来,终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的临床患病率逐年提高,据美国肾脏病数据系统数据,美国ESRD年患病率为每百万人中有2023.6例人,其主要治疗方法为肾脏移植和透析治疗。尽管近年来相关治疗技术进步较大,但透析... 详细信息

研究背景:近年来,终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的临床患病率逐年提高,据美国肾脏病数据系统数据,美国ESRD年患病率为每百万人中有2023.6例人,其主要治疗方法为肾脏移植和透析治疗。尽管近年来相关治疗技术进步较大,但透析患者的死亡率仍然很高;而肾移植肾源紧缺是当前难题,且肾脏移植存在免疫排斥反应,需终生治疗。为突破肾脏替代治疗的局限性,肾脏再生成为研究热点。随着对干细胞研究的不断深入及再生医学的不断发展,应用干细胞进行肾脏再生为终末期肾病患者带来新的希望。干细胞(Stem Cell,SC)是一类具有自我复制功能的多潜能性细胞,在一定的条件下,具有多向地分化形成多种功能性细胞的潜能。随着对干细胞研究的不断深入,干细胞相关的应用范围已涉及了到医学的许多领域。目前,人体的胚胎干细胞已经完全能够实现体外培养过程,包括在体外进行鉴别、分离、纯化、扩增等过程,并且其己经完全可以作为种子的细胞进行下一步的定向分化和培养,已成功培养出人的组织和器官。随着先进的干细胞技术的发展及其对于衍生组织器官的广泛应用,将对一些疾病提供潜在的治疗方法手段及全新的治疗技术,1999年美国《科学》杂志把干细胞的研究列入了排在全球十大基因组测序技术和克隆技术之前的全球十大科学成果中之一。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)可以定向分化成为大多数类型的细胞,并有潜力用于修复受损组织。然而,使用ESCs存在伦理问题,因为这些细胞来自早期胚胎的内细胞团,在此过程中细胞团被破坏。相反,iPSCs可以通过上调多能因子从分化的细胞中生成,因此,iPSCs有望为再生医学提供大量难以获得的细胞资源。涉及iPSCs的再生医学研究进展显著,其治疗方法已经开始进行临床试验。此外,患者来源的诱导多能性干细胞有可能产生与疾病相关的特化细胞和相关的类器官,帮助研究人员了解相关疾病潜在的病理生理学。再生医学已越来越成为国内外学者关注的焦点,当前肾脏类器官培育己成为研究新热点,目前已取得突破性的研究进展。由于肾脏结构上和功能上的高度复杂性,肾脏类器官与正常的人肾脏还存在很大差距。首先,肾脏类器官体内移植得到的血管化是来自宿主的细小血管,无法形成成熟的血管网络,缺少功能性的血管灌流系统;其次,尽管肾脏类器官培育能产生肾小球细胞,但肾小球的过滤功能,尿液的排除无法实现。目前,肾脏类器官的体外培养过程并无统一规定的标准,我们在总结多个肾脏类器官诱导方案的基础上,同时针对上述问题,本实验将通过以下研究方法达到提高类肾器官体外诱导成熟度,促进类肾器官体外诱导过程中细胞更好的分化,获得结构更加丰富的类肾器官。研究目的:人诱导性多能干细胞(Human Induced pluripotent stem cells,hiPSCs)由于其扩增性及对发育信号的可塑性,可以诱导分化成肾脏细胞,从而模拟人类遗传肾脏疾病的发病过程。为准确了解肾脏发育过程和肾脏疾病发病机制,并最终能为治疗终末期肾病(End Stage Renal Diseases,ESRD)提供新的治疗思路,本实验将在体外利用人多能诱导性干细胞(hiPSCs)制备肾脏类器官,同时优化肾脏类器官体外培育体系,之后进行体内移植实验,从而进一步促进肾脏类器官在体内发育成熟。研究方法:***于体外诱导成肾脏类器官,具体为hiPSCs种植于T25培养瓶中,当细胞汇集到一定细胞密度后,开始依次加入CHIR99021、FGF9、肝素(Heparin)定向诱导分化因子,于体外进行至少18天的诱导过程,包括2D平面培养6天,及3D立体诱导12天,最终获得初具肾脏结构及功能特点的类肾组织。2.在进行上述方法构建肾脏类器官的同时,利用hiPSCs来源的肾元细胞进行肾脏类器官的培育,在前期培养基础上,优化肾脏类器官体外培养方案,体外诱导效率相对提高。hiPSCs-肾元细胞是从人多能干细胞(hiPSCs)分化而来的肾元祖细胞(Renal Progenitor Cells,NPC),利用hiPSCs-肾元细胞进行体外诱导、分化,最终获得肾脏类器官。3.为进一步促进肾脏类器官的成熟,我们将肾脏类器官消化成细胞团的形式,将其注射进入小鼠的肾皮质内,移植后3周开始,将体内类肾器官取出进一步鉴定。目的是研究肾皮质内微环境对肾脏类器官的影响,以及肾脏类器官消化成细胞团后,是否能在体内进一步分化、发育,得出相应结论。研究结果:1.利用hiPSCs培养肾脏类器官培育期间,根据对平面培养时的细胞观察所见,加入诱导因子后的细胞生长密度及形态上均有明显变化。在转3D培养后的第三天开始镜下观察细胞团中出现类似管状结构,并逐渐增多、成

关键词：肾脏再生人多能诱导性干细胞肾元细胞肾脏类器官肾皮质内注射

四因子诱导iPSCs方法的改良及大鼠肾脏固有细胞来源的iPSCs的获得

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四因子诱导iPSCs方法的改良及大鼠肾脏固有细胞来源的iPSCs的获得

作者：周宇楠中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

背景：近年来,慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的发病率在世界范围内呈明显上升趋势。对于终末期肾脏病患者,主要的替代治疗方法是透析和肾移植。但是不论哪种方法都不能很好地维持其机体内环境的稳定,更不能替代肾脏的分泌功... 详细信息

背景：近年来,慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的发病率在世界范围内呈明显上升趋势。对于终末期肾脏病患者,主要的替代治疗方法是透析和肾移植。但是不论哪种方法都不能很好地维持其机体内环境的稳定,更不能替代肾脏的分泌功能,而且肾移植供体供不应求。组织工程与干细胞领域的突飞猛进为器官再生带来了希望。有研究表明利用小鼠脱细胞的肾脏细胞外基质作为骨架,通过肾动脉向骨架内灌注小鼠胚胎干细胞,发现胚胎干细胞可在骨架内定植,并能分化为相应的肾脏固有细胞。此前,我们课题组已成功获取大鼠脱细胞肾脏骨架并对其细胞相容性进行了检测。但是胚胎干细胞存在伦理问题。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)具有与胚胎干细胞类似的全能特性。利用iPSCs代替胚胎干细胞,不仅解决了伦理问题,同样在保持大量扩增能力的同时还具有胚胎干细胞的发育能力。目的：综合国内外加速体细胞重编程效率的有效方法改良iPS细胞的诱导效率,并提取原代的大鼠肾脏固有细胞,分别诱导为不同来源的iPS细胞,最后再灌注到脱细胞肾骨架中观察其生存情况。方法：(1)利用慢病毒载体结合抑制细胞的Mbd3基因,并在诱导培养基中加入维生素C加血清替代物,同时适当提高接种密度的方法改良iPS细胞的诱导效率;(2)分别提取并培养原代的大鼠肾脏系膜细胞、足细胞、血管内皮细胞、肾小管上皮细胞以及成纤维细胞等主要的肾脏固有细胞,分别诱导为不同细胞来源的iPS细胞,并做荧光标记;(3)将带有荧光标记的iPS细胞灌注到脱细胞肾骨架中观察其存活情况。结果：(1)利用改良过的iPS诱导方法成功将诱导周期由7天缩短至5天;(2)利用筛网及贴壁法,我们成功提取了主要的肾脏固有细胞,并分别用改良方法诱导成为各种不同细胞来源的iPS细胞,保留了对不同肾脏固有细胞的记忆性;(3)将带有RFP的大鼠iPS细胞灌入脱细胞肾骨架中,48小时后在双光子显微镜下观察其生长情况,结果示其生长状态良好。结论：(1)改良过的iPS细胞的诱导方法可缩短iPS细胞的诱导周期;(2)利用筛网及贴壁法,可成功提取主要的肾脏固有细胞,并且改良方法诱导也可成功将其诱导为各种不同细胞来源的iPS细胞,为下一步实验肾脏再生做准备;(3)大鼠iPSCs可以部分在脱细胞肾脏骨架内存活。

关键词：诱导多能干细胞诱导多能干细胞的记忆性肾脏再生