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差异性多肽与肽锌配合物的制备及基于Caco-2细胞模型的吸收代谢机制

差异性多肽与肽锌配合物的制备及基于Caco-2细胞模型的吸收代谢机...

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作者：朱素茵广州大学

学位级别：硕士

人体锌的吸收不仅依赖于足够的饮食摄入,而且还很大程度上受到肠道利用率的影响。Pep T1载体对不同活性肽的吸收能力有所差异。一般地,Pep T1载体负电荷多肽的亲和力大于正电荷多肽;而对于疏水性多肽,疏水性越强,Pep T1载体更容易吸收... 详细信息

人体锌的吸收不仅依赖于足够的饮食摄入,而且还很大程度上受到肠道利用率的影响。Pep T1载体对不同活性肽的吸收能力有所差异。一般地,Pep T1载体负电荷多肽的亲和力大于正电荷多肽;而对于疏水性多肽,疏水性越强,Pep T1载体更容易吸收。这也是影响人体对多肽及其配合物吸收的重要因素。进一步阐明这些因素对肠上皮吸收锌的影响仍是一个重要的研究课题。因此,本课题从大豆粕中分离出不同电荷性、疏水性的差异化多肽,并分别与Zn配合形成肽锌配合物。探究差异性多肽及其配合物的分子结构和理化特性,并通过Caco-2细胞模型对多肽及其配合物进行吸收代谢机制探究。1、以大豆粕为原料,通过预处理、双酶酶解-膜分离偶联等技术制备出高水解度、低分子量多肽(LMWP)。再采用DA201-C大孔树脂和DEAE阴离子交换柱进行差异化分离纯化,分别得到弱疏水性多肽(WHP)、强疏水性多肽(SHP)以及正电荷多肽(PCP)、负电荷多肽(NCP)。对这5种多肽进行分子量分布分析,发现大部分多肽都分布在3.5-5k Da之间。2、经分离纯化后,5种多肽分别和Zn配合制备出肽锌配合物。经测定,正电荷多肽(PCP)的锌配合能力(124.89±1.98mg/g)高于负电荷多肽(NCP)(106.88±0.94mg/g);强疏水性多肽(SHP)的锌配合能力(89.65±2.03mg/g)高于弱疏水性多肽(WHP)(79.10±1.51mg/g),而低分子量多肽的锌配合能力为102.95±1.72mg/g。3、肽锌配合物的结构表征及结合机理研究:X射线衍射和光谱分析的结果证明,Zn与多肽的活性基团(COOH、OH、NH)之间发生配合作用,形成肽锌配合物。SEM-EDS结果显示,肽锌配合物呈致密的颗粒状结构。通过热重分析发现,肽锌配合物具有良好的热稳定性,120-400℃之间的失重远小于多肽。此外,肽锌配合物和Zn SO在酸性条件下都有良好的溶解性,但在肠道pH 7.5时,肽锌配合物的锌溶解度(均高于40%)显著高于Zn SO(7.54±1.16%)。同样,在模拟小肠消化中,Zn SO的锌释放率明显低于肽锌配合物,而在模拟胃消化中,肽锌配合物具有一定的抗肠胃消化能力。这些结果表明,肽锌配合物的在肠道环境下比Zn SO的稳定性更好,具有更高的生物利用率。4、Caco-2细胞模型的建立,采用Caco-2细胞形态学、跨膜电阻值(TEER)测定、碱性磷酸酶(AKP)活性检测以及荧光素钠的透过率和表观渗透系数等对Caco-2细胞模型的完整性和通透性进行评价,结果表明Caco-2细胞在培养21天时,细胞结合紧密、电阻值>300Ω·cm、AP/BL的AKP比值为5.60±0.22、荧光素钠的表观渗透系数均在参考值内,且透过率仅为4.56±0.17%。以上相关参数指标显示,本研究已成功建立Caco-2细胞模型,可以用于多肽及其配合物的转运吸收实验。5、首先,确定出Caco-2细胞存活率最高的Zn浓度为50umol/L。在此浓度下,对比肽锌配合物和Zn SO在Caco-2细胞的锌转运吸收效率,发现肽锌配合物具有更高的吸收率。进一步测定Caco-2细胞内相关基因和酶系的表达水平,发现:在一定锌浓度范围内,ZIP4 mRNA和Zn T1 mRNA的表达水平与锌浓度成正比;Pep T1 mRNA的表达水平主要受多肽的影响,在多肽的刺激下,Pep T1 mRNA的表达水平会上调;羧肽酶A和Cu-Zn SOD的酶活力都会受锌浓度影响,Zn对该酶的酶活力有催化或激活作用。从基因和酶系表达水平的结果发现,肽锌配合物实验组高于其他组别。以上结果表明,吸收效率和基因、酶系催化效果最高的均为Zn-NCP。

关键词：大豆多肽肽锌配合物 Caco-2细胞转运吸收生物利用

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