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RXR对缺氧/复氧诱导的大鼠肺泡ii型上皮细胞自噬的调控作用

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RXR对缺氧/复氧诱导的大鼠肺泡II型上皮细胞自噬的调控作用

瘦素/ERK信号在云锡矿粉诱导大鼠ii型肺泡上皮细胞转化中的作用

2019中国生理学会学术年会暨张锡钧基金第十五届全国青年优秀生理学学术论文交流会及第十三届全国青年生理学工作者学术会议

作者：周卓琳高慧楼国强张晶晶武垣伶黄丹娜 Wu Yiming 王万铁温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所 Division of Cardiovascular Medicine University of Iowa Carver College of Medicine Iowa City

目的:常氧培养大鼠肺泡ii型上皮细胞(Alveolar epithelial cell type ii,AEC ii)。方法:将长至对数生长期的细胞随机分为5组(n=10):1.对照组(C):正常条件下培养30h;2.缺氧/复氧组(HR):缺氧6h,复氧24h;3.溶剂DMSO组(HD):造模前1.5h用浓... 详细信息

目的:常氧培养大鼠肺泡ii型上皮细胞(Alveolar epithelial cell type ii,AEC ii)。方法:将长至对数生长期的细胞随机分为5组(n=10):1.对照组(C):正常条件下培养30h;2.缺氧/复氧组(HR):缺氧6h,复氧24h;3.溶剂DMSO组(HD):造模前1.5h用浓度低于0.1%的DMSO进行预处理,其余处理同HR组;4.9-顺式维甲酸组(RA):缺氧前1h用9-RA(100nmol/L)预处理;***531组:先用9-RA处理0.5h然后用HX531(2.5μmol/L)处理1h。采用CCK-8法检测各组细胞活力;免疫荧光染色法观察各组细胞RXRα表达变化;透射电镜观察细胞内部超微结构的改变;RT-PCR和Western blot检测AMPK、Beclin 1、LC3ii、mTOR和P62基因及蛋白水平的表达。结果显示,与C组相比,HR、HD、RA、HX四组细胞的细胞活力明显降低,线粒体、板层小体等细胞器均有不同程度的损伤性改变;mTOR、P62蛋白及mRNA表达均显著降低;而RXRα、AMPK、Beclin 1、LC3 ii表达也显著升高(P细胞损伤减轻,自噬水平也明显降低(P0.05)。结论:初步证实缺氧/复氧可诱导细胞自噬水平的升高,而激活RXR对缺氧/复氧引起的AEC ii损伤有一定的防护作用,其机制可能与抑制细胞自噬有关。

关键词：维甲酸X受体缺氧/复氧损伤细胞自噬肺泡ii型上皮细胞

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中国肺癌杂志 2023年第10期26卷 732-740页

作者：胡雄颜聪张宇黎贵芸周喆焱阮永华刘士岳边莉昆明医科大学第一附属医院病理科昆明650031 昆明医科大学基础医学院昆明650500 云南省第三人民医院病理科昆明650011

背景与目的目前,云南个旧锡矿有大量矿工从事开采工作,这种职业环境与接触粉尘颗粒、重金属、多环芳烃和放射性氡有关,大大增加了患肺癌的风险。本研究旨在探讨在云锡矿粉诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(immortalized rat alveolar cells ty... 详细信息

背景与目的目前,云南个旧锡矿有大量矿工从事开采工作,这种职业环境与接触粉尘颗粒、重金属、多环芳烃和放射性氡有关,大大增加了患肺癌的风险。本研究旨在探讨在云锡矿粉诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(immortalized rat alveolar cells type Ⅱ,RLE-6TN)恶性转化过程中,瘦素(leptin)及其介导的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)信号通路所起的作用。方法采用200μg/mL的云锡矿粉隔代毒染RLE-6TN至第9代,建立毒染细胞模型,命名为R_(200)细胞,正常培养组命名为R细胞,通过Western blot法检测两种细胞leptin受体的表达情况。通过MTT法筛选出leptin及丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)抑制剂(U0126)对R_(200)细胞的最佳作用浓度。自第20代起,将R组、R_(200)组细胞分别与leptin及MEK抑制剂U0126共培养,对各组细胞的形态改变进行观察,并利用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色技术鉴别第40代细胞的形态学差异,通过刀豆凝集素A(concanavalin A,ConA)及锚着独立性生长实验法检测细胞恶性转化情况。通过Western blot法检测leptin作用后上皮细胞ERK信号通路的变化。结果R组和R_(200)组细胞均表达leptin受体(OB-R)。与R_(200)组比较,当leptin浓度达100 ng/mL时,其促增殖效应最为显著,30μmol/L U0126可抑制毒染细胞R_(200)增殖,与对照组相比具有统计学差异(P细胞形态发生变化,至第30代出现恶性转化,至第40代时恶性转化特征明显;而R_(200)组细胞及U0126诱导的R_(200)组(R_(200)LU组)细胞则在第40代时才出现恶性转化特征。R_(200)L组细胞凝集速度较R_(200)LU组快,其余各组细胞P30出现凝集,且随ConA浓度增加,细胞凝集速度加快。R_(200)L组细胞自P40可见克隆形成,克隆形成率为2.25‰±0.5‰,R_(200)LU组及R_(200)组未见克隆集落。R_(200)L组细胞pERK表达增强;加入U0126阻断后,R_(200)L组细胞pERK磷酸化水平降低。结论Leptin可以促进云锡矿粉毒染肺上皮细胞的恶性转化,ERK信号通路可能是其促进云锡矿粉引发的肺泡Ⅱ型上皮细胞转化的重要途径。

关键词：瘦素肺泡ii型上皮细胞转化 ERK信号通路

NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用机制研究

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中国病理生理杂志 2021年第10期37卷 1822-1827页

作者：周卓琳刘秀洁王新雨王淑远宋正阳田云娜张赛黄丹娜王万铁温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所浙江温州325035 温州市人民医院呼吸内科浙江温州325035

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用及其机制。方法:常氧培养AEC Ⅱ,并建立H/R损伤模型,随机分为:正常组(Con组,不做处理)、H/R组、NL... 详细信息

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用及其机制。方法:常氧培养AEC Ⅱ,并建立H/R损伤模型,随机分为:正常组(Con组,不做处理)、H/R组、NLRP3炎症小体激动剂(脂多糖和ATP,LPS+ATP)组(在H/R组的基础上用NLRP3炎症小体激动剂)及NLRP3炎症小体抑制剂(MCC950)组(在H/R组的基础上用NLRP3炎症小体抑制剂)。实验结束后,收集细胞,采用CCK-8法检测各组细胞活力;试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)和caspase-1活性;免疫荧光染色法观察各组细胞NF-κB和caspase-1表达变化;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NF-κB、NLRP3、gasdermin D(GSDMD)和白细胞介素1β(IL-1β)的表达水平。结果:与Con组相比,其余3组细胞活力显著下降(P细胞焦亡相关蛋白NF-κB、NLRP3、GSDMD-N和IL-1β表达显著增加(P细胞活力显著升高(P细胞焦亡相关蛋白表达,导致大鼠AEC Ⅱ损伤;NLRP3炎症小体抑制剂MCC950可减轻H/R引起的大鼠AEC Ⅱ损伤,其机制可能与其抑制NF-κB,减轻细胞焦亡有关。

关键词： NLRP3炎症小体细胞焦亡缺氧/复氧肺泡ii型上皮细胞

1,25-(OH)_2D_3对肺纤维化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中Ca^(2+)浓度和PI3K/AKT/mTOR通路的影响

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医学研究生学报 2016年第10期29卷 1040-1045页

作者：董洪亮刘乃国苗双倪娜郑静王楠李新静滨州医学院附属医院临床医学实验室滨州理学硕士256603 滨州医学院附属医院肿瘤研究中心滨州256603 滨州医学院附属医院医务处滨州256603

目的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性炎症性疾病,病因不明,缺乏有效的治疗方法。文中旨在探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞中Ca^(2+)和PI3K/AKT/mTOR通路在大鼠IPF中的作用,以及1,25-(OH)_2D_3对Ca^(2+)浓度和PI3K/AKT/mTOR通路的影响。方法 150只雄性SD大鼠随机分为:预防组(对照组Ⅰ、模型组Ⅰ、给药组Ⅰ,每组20只)和治疗组(对照组Ⅱ、模型组Ⅱ、给药组Ⅱ,每组30只)。对照组Ⅰ/Ⅱ行气管暴露手术,气管内给以200μL/只的无菌等渗盐水,并分别于第2和14天开始腹腔注射等渗盐水(200μL/只);模型组Ⅰ/Ⅱ气管内灌注博来霉素(5 mg/kg),并分别于手术后第2和14天开始腹腔注射维生素D3的溶剂(0.1%乙醇和99.9%的丙二醇,1μL/g体重);给药组Ⅰ/Ⅱ气管内灌注博来霉素(5 mg/kg),并分别于手术后第2和14天开始腹腔注射1,25-(OH)_2D_3(2μg/kg体重)。大鼠气管内注射博来霉素建立IPF模型,给药组腹腔注射1,25-(OH)_2D_3进行预防和治疗。检测各组大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量,分离肺泡Ⅱ型上皮细胞并用Fluo-3AM荧光负载,激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca^(2+)浓度。RT-PCR方法检测PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平。结果模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ中大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量、肺泡Ⅱ型上皮细胞内Ca^(2+)浓度以及PI3K、AKT、mTOR mRNA表达,在各时间点与相应对照组Ⅰ/Ⅱ相比均明显升高(P型组Ⅰ/Ⅱ相比,上述指标均有显著降低(P型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ中Ca^(2+)浓度与PI3K、AKT、mTOR mRNA表达之间具有显著正相关(r=0.598 8、r=0.623 0、r=0.6603,P肺泡Ⅱ型上皮细胞内Ca^(2+)的浓度,抑制PI3K-AKT-mTOR通路,进而抑制IPF的发生发展。

关键词： 1,25-(OH)2D3 SD大鼠肺纤维化肺泡ii型上皮细胞 Ca^2+浓度 PI3K/AKT/mTOR信号通路

IQGAP1在肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、分化及迁移中调控作用的研究

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IQGAP1在肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、分化及迁移中调控作用的研究

作者：李琼雅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的观察IQGAP1对肺泡ii型上皮细胞增殖、分化及迁移过程的影响。方法通过转染IQGAP1-siRNA干扰肺泡ii型上皮细胞（AlveolarEpithelial Cells type ii，AEC ii）中IQGAP1的表达，设空白对照组。1、采用直接细胞计数法分析IQGAP1对AEC I... 详细信息

目的观察IQGAP1对肺泡ii型上皮细胞增殖、分化及迁移过程的影响。方法通过转染IQGAP1-siRNA干扰肺泡ii型上皮细胞（AlveolarEpithelial Cells type ii，AEC ii）中IQGAP1的表达，设空白对照组。1、采用直接细胞计数法分析IQGAP1对AEC ii细胞数目的影响;2、采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析IQGAP1对AEC ii增殖能力的影响;3、通过Transwell迁移实验分析IQGAP1在AEC ii迁移过程中的作用;4、通过Western blotting检测AEC ii特异性标志物（SP-C）和AEC I的特异性标志物（AQP-5）的表达，分析IQGAP1对AEC ii分化过程的影响。结果1、IQGAP1-siRNA组干预后24h、48h和72h细胞数目较对照组明显减少(P细胞增殖活性较对照组显著降低(Pii细胞的迁移程度下降约50％(Pii向AEC I的分化受到抑制。结论IQGAP1对肺泡ii型上皮细胞的增殖、分化及迁移过程起着重要的调控作用。

关键词：肺泡ii型上皮细胞 IQGAP1蛋白增殖分化迁移

不同浓度的AC2-26对CPB血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响

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不同浓度的AC2-26对CPB血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响

作者：王娟遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:本实验拟应用成人CPB血清培养大鼠肺泡ii型上皮细胞（AECⅡ）,模拟临床CPB对AECⅡ损伤;细胞损伤模型成功建立后加入不同浓度的膜联蛋白A1拟肽AC2-26,观察其是否能减轻大鼠AECⅡ的损伤,并寻找减轻大鼠肺泡ii型细胞的最佳药物浓度,... 详细信息

目的:本实验拟应用成人CPB血清培养大鼠肺泡ii型上皮细胞（AECⅡ）,模拟临床CPB对AECⅡ损伤;细胞损伤模型成功建立后加入不同浓度的膜联蛋白A1拟肽AC2-26,观察其是否能减轻大鼠AECⅡ的损伤,并寻找减轻大鼠肺泡ii型细胞的最佳药物浓度,为探寻CPB肺保护措施及实验研究提供理论依据。方法:选择200g～300g健康SD大鼠麻醉后取双肺肺组织进行肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、纯化及培养。选取16名风湿性心脏病手术患者,在CPB转流停止后取血液10ml,离心后分离血清,配制10%CPB血清加入培养板与肺泡Ⅱ型上皮细胞共培养,建立肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤模型。肺泡Ⅱ型上皮细胞培养48h后吸尽培养液,分为对照组（C组）、AECⅡ损伤组（B组）、AC2-26组（A组）,对照组（C组）仅做单纯原代肺泡Ⅱ型上皮细胞培养,AECⅡ损伤组（B组）为术后血清与肺泡Ⅱ型上皮细胞共培养组,A组为CPB血清与药物及细胞共培养组,A组根据不同的药物浓度随机分为A1组0.125μmol/L、A2组0.25μmol/L、A3组0.5μmol/L、A4组1.0μmol/L、A5组2.0μmol/L、A6组为4.0μmol/L、A7组8.0μmol/L,每组培养12h。选取培养48h的肺泡Ⅱ型上皮细胞于电镜下观察AECⅡ超微结构板层小体;分别选取24h、48h、72h、96h肺泡Ⅱ型上皮细胞于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况;选取共培养12h的肺泡Ⅱ型上皮细胞行CCK-8细胞活性检测;流式细胞仪检测细胞凋亡率;ELISA测培养液中的TNF-α、IL-8。结果:1.肺泡Ⅱ型上皮细胞的培养及鉴定（1）倒置显微镜下可见细胞呈现鹅卵石样形态,散在分布,随着时间延长,肺泡Ⅱ型上皮细胞逐渐增殖成多边形、不规则形,呈岛状分布,甚至连接成片铺满整个视野,细胞核明显,细胞核周围有丰富的小颗粒。（2）电子显微镜下可见细胞表面微绒毛,细胞膜完整,细胞间可见紧密连接,细胞核体积较大,呈不规则形,染色质均匀,核膜清楚,线粒体结构呈梭形,数量丰富,且嵴线清晰,还可见细胞质内特异性的板层小体,数量不等,呈“洋葱皮”状分布。（3）SPC免疫荧光染色图片可见肺泡Ⅱ型上皮细胞SPC呈现红色荧光,细胞核表现为蓝色荧光染色,SPC主要沿细胞质周围分布,荧光强弱不等。2.不同浓度的AC2-26对CPB血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响（1）倒置显微镜下各组细胞的生长情况:C组细胞排列紧密、贴壁良好,细胞间相互连接,细胞数量丰富。B组细胞数量明显减少,排列杂乱无序。A5、A6、A7组细胞损伤较重,细胞的正常结构消失,排列杂乱无序,细胞出现贴壁不良,甚至脱落凋亡,细胞间隙明显增大,细胞间连接断裂,A1、A2组细胞稀疏,细胞间隙增宽,细胞膜出现皱缩,细胞形态不规则,呈长条形、梭型生长,而A3、A4组细胞损伤明显减轻,细胞排列紧密,贴壁良好,细胞结构完整。（2）各组细胞活性比较:与C组相比,B组及A组各组细胞活性明显降低（P＜0.05）;A1-A7组细胞活性均明显高于B组（P＜0.05）;A组各组间比较,与A1相比较,A2组、A3组、A4组细胞活性增强,差异具有统计学意义（P＜0.05）,A5-A7组细胞活性未见明显差异（P＞0.05）,A2组、A3组、A4组三组细胞活性比较,未见明显差异（P＞0.05）。（3）各组细胞凋亡率比较:与C组相比较,B组及A1-A7组细胞凋亡率明显上升（P＜0.05）;与B组相比,A1组、A5组、A6组及A7组细胞凋亡率未见明显变化（P＞0.05）;而A2组、A3组及A4组三组细胞凋亡率显著下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;而A1-A7组各组组间相比,A1组与A6组相比细胞凋亡率未见明显差异,A1组较A7组细胞凋亡率有所下降,其余各组较A1组相比细胞凋亡明显减轻（P＜0.05）,A2组与A4组细胞凋亡率未见明显差异（P＞0.05）;但较A5组相比细胞损伤明显减轻（P＜0.05）,A3组细胞凋亡率（17.8±0.68）较其余各组显著降低（P＜0.05）。（4）各组TNF-α含量变化比较:与C组相比,B组及A组TNF-α含量均有所增高（P＜0.05）;A组各组与B组相比,A1-A5组TNF-α含量均比B组低（P＜0.05）,A6-A7组较B组TNF-α含量未见明显变化;A组各组组间比较,A2组、A3组及A4组细胞TNF-α含量明显低于A1组、A5组（P＜0.05）,A6、A7组与A1组比较TNF-α含量明显增高（P＜0.05）,A3组TNF-α含量较A2、A4组明显下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（5）各组IL-8含量变化比较:与C组比较,B组及A组各组IL-8表达均有所上升（P＜0.05）;与B组比较,A2组、A3组、A4组IL-8含量明显下降（P＜0.05）

关键词：膜联蛋白A1 AC2-26 体外循环肺泡ii型上皮细胞肺保护

氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡变化和ERK信号转导机制

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氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡变化和ERK信号转导机制

高频振荡通气对急性肺损伤新生猪肺功能及病理影响的研究

2006年全国危重病急救医学学术会议

作者：陈娟许峰蒋静方芳匡凤梧卢仲毅王兴勇

目的探讨氧化戍激状态下肺泡ii型上皮细胞(alveolar type ii epithelial cell,ATii) 修复存活、凋亡及其细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)对凋亡的调控作川。方法采用过氧化氢(H2O2)处理体外分离纯化培... 详细信息

目的探讨氧化戍激状态下肺泡ii型上皮细胞(alveolar type ii epithelial cell,ATii) 修复存活、凋亡及其细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)对凋亡的调控作川。方法采用过氧化氢(H2O2)处理体外分离纯化培养的原代大鼠AT ii细胞,蛋白质免疫印迹法 (Western blot)检测H2O2刺激后ATii细胞磷酸化ERK的表达,四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,并观察ERK特异性抑制刺PD98059干预后细胞凋亡的变化。结果与对照组比较,低于500 μ M的H2O2处理3h对ATii细胞存活率和凋亡率无明显影响,大于500 μM 的H2O2处理可导致ATii细胞的存活率明显降低(Pii细胞30min,细胞存活率和凋亡率无显著变化,处理3h细胞存活率明显降低, 凋亡率明显增高(Pii细胞凋亡率明显增高。结论H2O2可以浓度和时间依赖的方式诱导ATii细胞凋亡, ERK信号转导途径参与了ATii细胞的凋亡调控,对氧化应激状态下的ATii细胞可能起到保护作用。

关键词：肺泡ii型上皮细胞凋亡细胞外信号调节激酶活性氧

来源： cnki会议评论

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高频振荡通气对急性肺损伤新生猪肺功能及病理影响的研究

作者：覃晓菲南华大学

学位级别：硕士

目的：用生理盐水反复灌洗新生猪肺泡的方法建立急性肺损伤(ALI)模型，研究分为两个部分：一、高频振荡通气对新生猪急性肺损伤气体交换、肺力学及血流动力学的影响：动态观察常频机械通气(CMV)、高频振荡通气(HFOV)治疗过程中损伤肺的... 详细信息

目的：用生理盐水反复灌洗新生猪肺泡的方法建立急性肺损伤(ALI)模型，研究分为两个部分：一、高频振荡通气对新生猪急性肺损伤气体交换、肺力学及血流动力学的影响：动态观察常频机械通气(CMV)、高频振荡通气(HFOV)治疗过程中损伤肺的氧合、静态顺应性及血流动力学改变，探讨HFOV对缺少肺表面活性物质引起的新生动物ALI时肺功能及循环功能的影响;二、高频振荡通气对新生猪肺组织大体及肺泡ii型上皮细胞病理结构的影响：了解机械通气类型、时间与肺损伤之间的关系，探讨HFOV在治疗新生儿ALI／ARDS及减轻呼吸机相关肺损伤(VALI)发生发展中的机制及应用价值。方法：(一)第一部分1、动物预处理15只出生3天内的新生猪经麻醉后气管切开插管，连接MAQUET Servo-i呼吸机，进行压力控制通气。股动咏插管连续监测动咏血压变化。预处理操作结束后通气30分钟，测量血气、动咏血压、心率、肺静态顺应性，并计算氧合指数(OI)、平均动咏压(MABP)、肺静态顺应性(Cst)，作为基础值。2、ALI动物模型的建立所有模型建立过程均在CMV模式下进行。经气管导管向气管内注入37℃生理盐水：35ml／kg，停留约10s抽出肺内生理盐水，间隔5min后重复操作。在吸入氧浓度为1．0的条件下直至动咏血气分析Pa02型制备成功。3、实验动物分组将15只新生猪随机分为3组。对照组(n=3)：ALI对照组，ALI模型制备成功后不予机械通气，即处死动物。CMV组(n=6)：动物均连接MAQUETServo-i呼吸机，进行压力控制通气。分别在常频机械通气治疗24h、48h各处死动物3只。HFOV组(n=6)：动物模型制备成功后，转换为连接SLE5000呼吸机，进行高频振荡通气。分别在高频振荡通气治疗24h、48h各处死动物3只。4、观察指标在建模前、ALI即刻即0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h分别监测以下指标(1)血气分析经股动咏插管取动咏血行血气分析，并计算OI。(2)肺静态顺应性测定采用低流速法，CMV组通过呼吸机自带分析软件，记录第5次呼吸时的数据。HFOV组将HFOV模式转换为CMV模式，呼吸机参数设置同CMV组，记录第5次呼吸时的数据，肺顺应性测完毕后立即转换为HFOV模式。并计算Cst。(3)动咏血压及心率记录动咏血压及心率，并计算MABP。(二)第二部分1、动物预处理同前2、ALI动物模型的建立同前3、实验动物分组同前4、观察指标对照组动物在建模成功后即予处死，CMV组和HFOV分别在机械通气24h和48h各处死3只动物，取肺组织进行以下检测。(1)右上肺组织光镜检测：分为重力依赖区和非重力依赖区，HE染色分别计数中性粒细胞(PMN)、巨噬细胞(AM)、红细胞(RBC)，改良Mallory’s磷钨酸苏木素法染色分别计数透明膜／水肿液(HM/E)。(2)右下肺底组织行透射电镜检测：观察AECii超做结构改变。结果：(一)第一部分1、各组的OI、Cst、HR、MABP在基础状态、ALI0h均无显著性差异。ALI0h的P/F比值0．05)。(二)第二部分1、光镜观察(1)肺组织病变重力依赖区重于非重力依赖区。(2)PMN：CMV及HFOV各亚组各区PMN均较对照组明显增加(P< 0．01);HFOV48h亚组的重力依赖区PMN较CMV 48h亚组明显减少(P<0．05)。(3)AM：CMV 48h、HFOV 24h和48h亚组的AM均较对照组明显减少(P<0．05)，HFOV 24h亚组的AM较CMV 24h亚组明显减少(P< 0．01)。(4)RBC：CMV及HFOV各亚组各区PMN均较对照组明显增加(P< 0．01);HFO

关键词：急性肺损伤呼吸机相关肺损伤机械通气肺泡ii型上皮细胞新生猪

缺氧与NaCN中毒大鼠肺损伤特点及其机制初步研究

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缺氧与NaCN中毒大鼠肺损伤特点及其机制初步研究

作者：蔡颖第三军医大学

学位级别：硕士

氢氰酸是极为重要的工业毒物,也是外军装备的速杀性化学战剂,《禁止化学武器公约》将其列为“双用途毒剂”。分子结构中含有氰根(CN-)的化合物多具有强烈毒性,人们称它们为氰类毒剂或氰化物。氰化物进入机体后迅速释放出氰离子(CN-),CN... 详细信息

氢氰酸是极为重要的工业毒物,也是外军装备的速杀性化学战剂,《禁止化学武器公约》将其列为“双用途毒剂”。分子结构中含有氰根(CN-)的化合物多具有强烈毒性,人们称它们为氰类毒剂或氰化物。氰化物进入机体后迅速释放出氰离子(CN-),CN-对细胞呼吸链有很强的亲和力,可与细胞色素氧化酶的三价铁(Fe3+)结合,抑制该酶的活性[1],阻断呼吸链电子传递,造成“内呼吸”障碍。呼吸衰竭和心血管功能衰竭是氰化物中毒死亡的主要原因[2,20]。高原地区空气稀薄,大气压和氧分压降低,是高原环境对机体影响的主要因素。缺氧既可以造成机体功能的异常反应[3],也可以加重化学毒物对脑、心、肺功能的损伤作用[4]。初入高原人员若发生氰化物中毒,机体将同时遭受呼吸性缺氧和细胞性缺氧双重打击,目前对缺氧条件下氰化物中毒的伤情特点了解甚少。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cell TypeⅡ,AECⅡ)是一种多功能细胞,对维持肺泡的结构和功能具有重要意义。既往研究发现,肺组织对缺血、缺氧损伤敏感。其中肺泡Ⅱ型上皮细胞的位置比较特殊,容易受到来自空气和血液两方面的损害。因此,AECⅡ在急性肺损伤后的变化非常复杂。急性肺损伤(ALI)肺组织的病理变化为肺泡上皮细胞的严重损伤。肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡,形态和结构发生改变,呼吸膜的完整性遭到破坏,导致其功能异常,主要表现为肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)系统的异常,表面活性物质是呼吸不可缺少的物质,这种基本物质的缺乏、不足和失活是引起严重呼吸功能失调的原因。近年来,随着对急性肺损伤发病机制及防治措施研究的深入,发现急性肺损伤时常伴有表面活性蛋白含量的降低[43]。AECⅡ的增殖和分化不仅可以修复肺泡的正常结构,更可以有效地进行功能上的恢复,从而阻止肺损伤向ARDS发展。AECⅡ是肺泡上皮细胞的干细胞,AECⅡ细胞的凋亡在ALI的病理过程中至关重要。研究表明,细胞凋亡可发生于ALI的不同阶段和时期。AECⅡ是肺部特异性细胞,有着极其重要的生理病理功能,是急性肺损伤发病过程中的重要效应细胞,在发病早期即可出现异常改变,其受损的确切机制尚未完全阐明,目前研究认为,肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及相关基因表达异常可能参与ALI的发病机制[42]。为了阐明缺氧复合氰化物中毒对肺损伤的特点及其机制,本课题以肺泡ii型上皮细胞为研究目标,从缺氧与NaCN中毒对整体动物呼吸系统结构和功能指标的影响及对离体AEC ii毒性作用研究,从肺组织及AEC ii结构变化、肺血管通透性、BALF和肺组织均浆主要成分改、氧化应激状态变化以及AEC ii合成SP-A的能力、相关凋亡基因HIF-1α和P53蛋白表达情况等方面,研究复合缺氧损伤引起AEC ii功能状态改变与急性肺损伤的关系,以进一步明确复合缺氧损伤AEC ii发生凋亡的可能机制,为缺氧和NaCN中毒后导致的急性肺损伤的诊断和防治提供理论依据。方法:1:大鼠缺氧与NaCN中毒损伤模型:高原实验组预缺氧72h后皮下注射NaCN 3.60mg/K。利用光镜和免疫组织化学方法观察大鼠肺组织病理损伤、SP-A活性改变以及AEC ii凋亡相关基因HIF-1α和P53的表达情况;多道生理信号记录系统观察缺氧和NaCN中毒对大鼠呼吸功能的影响;生化分析测定肺血管通透性变化、BALF成分变化趋势和肺组织。2:离体AEC ii缺氧与NaCN中毒模型:观察NaCN对AEC ii的毒性作用;Western Blot测定SP-A,HIF-1α和P53蛋白表达情况;PI-3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002,P53抑制剂PFT-α对缺氧与NaCN中毒AEC ii生成SP-A的干预作用。结果: 一、缺氧与NaCN中毒动物模型 1、缺氧和氰化钠中毒大鼠肺组织结构出现病理损伤,肺泡间质形态学结构改变,并出现变性损伤。缺氧和氰化钠中毒大鼠AEC ii变性损伤显著,板层体排空,细胞呈空泡状。 2、缺氧和(或)氰化钠中毒可诱导大鼠肺组织HIF-1α、P53表达增强,SP-A表达减弱。 3、常氧大鼠NaCN中毒后肺干湿质量比、肺体比值增加,缺氧大鼠NaCN中毒肺干湿质量比、肺体比值在各时相点均明显高于常氧对照组、缺氧对照组(P肺泡灌洗液中细胞数,缺氧中毒组支气管肺泡灌洗液中细胞计数各时相点均明显高于常氧中毒组、缺氧对照组(P肺泡灌洗液中蛋白含量,缺氧中毒组支气管肺泡灌洗液中蛋白含量各时相点均明显高于常氧中毒组,缺氧对照组(P<0.01)。 6、常氧NaCN中毒升高大鼠BALF的TPL含量,缺氧对照组TPL含量明显高于常氧对照组,皮下注射NaCN后,TPL显著高于缺氧对照

关键词：缺氧氰化钠肺泡ii型上皮细胞急性肺损伤肺表面活性物质结合蛋白A 缺氧诱导因子-1α P53