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基于果蝇口腔感染的肠道训练免疫模型研究

生物化学与生物物理进展 2023年第5期50卷 1206-1222页

作者：杨君霞朱锦彤彭颖郑州大学华大基因学院郑州450052 郑州大学河南省医药科学研究院郑州450052

目的利用果蝇作为遗传工具从个体和分子层面研究果蝇的训练免疫效应,并为后续深入研究其分子机制提供依据。方法首先构建无菌果蝇模型,在此基础上构建果蝇成虫及跨发育阶段训练免疫模型,用两种革兰氏阴性菌——胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwin... 详细信息

目的利用果蝇作为遗传工具从个体和分子层面研究果蝇的训练免疫效应,并为后续深入研究其分子机制提供依据。方法首先构建无菌果蝇模型,在此基础上构建果蝇成虫及跨发育阶段训练免疫模型,用两种革兰氏阴性菌——胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora carotovora 15)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分别经口腔感染果蝇。在第一次感染完全消退后进行再次感染,然后通过比较果蝇在两个感染阶段的存活率和细菌量来衡量训练免疫的潜在效果。通过实时荧光定量PCR检测相应先天免疫相关基因的表达水平,研究革兰氏阴性菌对免疫缺陷(IMD)通路的诱导作用。结果果蝇成虫及幼虫初次感染均可提高二次感染后的生存率、细菌清除效率及死亡时能承受的最高细菌负荷;二次感染的果蝇中,IMD通路中免疫反应基因的基础表达比未感染的高,这提供了获得感染抗性的分子基础;果蝇的免疫反应主要发生在中肠,二次免疫比初次免疫的效应更迅速且剧烈;二次免疫的果蝇中,肠道干细胞的数量显著多于初次感染。结论果蝇肠道中强大的训练免疫可由同源或异源革兰氏阴性菌口腔感染引发,且免疫记忆可在整个发育阶段持续存在;其可能作用于染色质,通过染色质修饰将免疫记忆储存在相关基因位点。免疫记忆跨发育阶段传递的一种潜在方式是通过肠道干细胞的JNK/STAT通路激活,这些干细胞可能在从幼虫到成虫的发育阶段携带免疫印记。

关键词：黑腹果蝇肠道训练免疫肠道干细胞抗菌肽免疫缺陷信号通路

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肠道类器官在畜禽营养中的研究进展

动物营养学报 2022年第10期34卷 6352-6357页

作者：王丹刘玉兰武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室武汉430023

肠道类器官是由单个肠道干细胞发育而来的具有隐窝-绒毛结构及所有种类的肠道上皮细胞的结构,也称为“迷你肠”。由于其与肠道结构和生理环境具有高度的一致性,肠道类器官是代替肠道组织的良好模型。目前,肠道类器官已经应用于畜禽动物... 详细信息

肠道类器官是由单个肠道干细胞发育而来的具有隐窝-绒毛结构及所有种类的肠道上皮细胞的结构,也称为“迷你肠”。由于其与肠道结构和生理环境具有高度的一致性,肠道类器官是代替肠道组织的良好模型。目前,肠道类器官已经应用于畜禽动物的营养吸收评价、肠道微生物与宿主互作等方面的研究。本文综述了肠道类器官的研究进展以及关键信号通路在其中的作用,并探讨了肠道类器官在畜禽营养研究中的应用前景。

关键词：肠道类器官畜禽营养肠道微生物肠道干细胞

酵母培养物促进干细胞增殖分化、改善小鼠肠上皮完整性

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动物营养学报 2022年第6期34卷 3962-3971页

作者：张得香朱超周加义王修启华南农业大学动物科学学院广东省动物营养调控重点实验室国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

本研究旨在探讨酵母培养物(YC)对小鼠肠道干细胞驱动隐窝绒毛轴更新的影响。试验选取6周龄体重[(19.85±1.45) g]相近的健康C57BL/6雄性小鼠36只,随机分为3组,每组12个重复,每个重复1只。对照组饲喂基础饲粮,0.5%和1.0%YC组分别在基础... 详细信息

本研究旨在探讨酵母培养物(YC)对小鼠肠道干细胞驱动隐窝绒毛轴更新的影响。试验选取6周龄体重[(19.85±1.45) g]相近的健康C57BL/6雄性小鼠36只,随机分为3组,每组12个重复,每个重复1只。对照组饲喂基础饲粮,0.5%和1.0%YC组分别在基础饲粮中添加0.5%和1.0%YC。试验期10 d。结果显示:1)与对照组相比,0.5%YC组小鼠平均日采食量(ADFI)极显著增加(P细胞核抗原(PCNA)荧光信号强度极显著增加(P 细胞数量显著或极显著增加(P肠道干细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡,改善肠道结构和屏障功能,增强肠道抗氧化能力,提高小鼠生长性能。

关键词：酵母培养物肠道干细胞肠上皮增殖分化

基于Notch信号通路研究白头翁汤对溃疡性结肠炎小鼠肠黏液屏障的保护作用

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中草药 2023年第16期54卷 5257-5266页

作者：刘伟刘又前蒋翠花张东建方雨夕龚旻李寅庆王甜甜张健南京中医药大学第三临床医学院江苏南京210028 南京市溧水区中医院江苏南京211200 南京中医药大学附属中西医结合医院江苏南京210028 中国药科大学中药学院江苏南京210009 河北御芝林药业有限公司河北石家庄050000

目的探讨白头翁汤对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠肠黏液屏障的保护作用以及对Notch通路的影响。方法C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、美沙拉嗪(50 mg/kg)组和白头翁汤... 详细信息

目的探讨白头翁汤对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠肠黏液屏障的保护作用以及对Notch通路的影响。方法C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、美沙拉嗪(50 mg/kg)组和白头翁汤低、高剂量(7.4、14.8 g/kg)组,对照组小鼠自由饮用纯净水,其余各组连续8 d自由饮用2.5%DSS溶液诱导UC模型,造模同时各给药组ig相应药物。每日记录小鼠体质量、粪便稠度以及血便情况;采用苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织病理变化;采用AB-PAS染色观察结肠组织黏蛋白2(mucin 2,MUC2)的分泌情况;ELISA法检测结肠组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及促炎因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和抗炎因子IL-10的含量;免疫组化法检测结肠组织Ki67的表达情况;免疫荧光法测定结肠组织富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5,Lgr5^(+))肠道干细胞(intestinal stem cells,ISCs)阳性细胞数;Western blotting测定结肠组织Notch-1、Atoh1、Hes1和MUC2蛋白表达。结果与模型组比较,白头翁汤能够缓解DSS诱导的UC小鼠体质量降低和疾病活动指数(disease activity index,DAI)升高(P细胞浸润、隐窝的破坏与杯状细胞的丢失,降低结肠组织MPO活性和IL-1β、TNF-α水平(P细胞数(P细胞数,并下调Notch和Hes-1蛋白表达水平(P细胞因子水平,增加Lgr5^(+)ISCs的增殖和分化,保护隐窝和杯状细胞结构,促进MUC-2分泌,其作用可能与调控Notch-1/Atoh1/Hes1通路密切相关。

关键词：白头翁汤溃疡性结肠炎肠道干细胞黏液屏障 Notch通路白头翁皂苷B4 黄柏碱小檗碱表小檗碱黄连碱巴马汀秦皮甲素秦皮乙素

沉默信息调节因子6基因敲除模型小鼠肠黏膜形态及转录组学的特征性变化

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中国组织工程研究 2022年第32期26卷 5119-5125页

作者：游弋晖宋春晖陈曦姚晓宏柯俊羽杜群宋宁李燕舞广州中医药大学科技创新中心脾胃研究所广东省广州市510405 河南中医药大学药学院河南省郑州市450046

背景:肠黏膜更新是维持机体稳态的关键生理过程,其中隐窝干细胞是肠上皮增殖和分化的驱动力。沉默信息调节因子(silent information regulator,SIRT)参与细胞的基因修复、代谢、能量平衡和寿命的调节,在肠上皮稳态中的研究逐步成为热点... 详细信息

背景:肠黏膜更新是维持机体稳态的关键生理过程,其中隐窝干细胞是肠上皮增殖和分化的驱动力。沉默信息调节因子(silent information regulator,SIRT)参与细胞的基因修复、代谢、能量平衡和寿命的调节,在肠上皮稳态中的研究逐步成为热点。肠类器官由单个隐窝干细胞经3D培养形成,可体外呈现肠上皮更新及受损后修复过程,是研究肠黏膜更新的最新模式。目的:探究SIRT6基因特异性敲除(SIRT6-i/-i)小鼠模型肠黏膜形态、肠类器官形成及其转录组学的特征性变化。方法:①采用Cre-loxp方法建立SIRT6-i/-i小鼠模型,制备小肠组织石蜡切片并进行苏木精-伊红染色,观察其病理变化,免疫组化检测肠干细胞标记物Lgr5和潘氏细胞标记物溶菌酶的表达;②体外构建SIRT6-i/-i小鼠肠类器官模型,Western-blot检测类器官SIRT6蛋白变化,免疫荧光检测肠类器官Lgr5、细胞角蛋白20和黏蛋白2蛋白表达变化;③采用肠组织进行转录组测序,分析该模型小鼠差异基因及相关功能的特征变化。结果与结论:①与野生型对照小鼠肠黏膜形态比较,SIRT6-i/-i小鼠肠黏膜出现绒毛稀疏、变短,隐窝高度变浅,且杯状细胞数目增多,潘氏细胞数目明显减少,Lgr5和溶菌酶的表达明显降低;②SIRT6-i/-i小鼠肠类器官中SIRT6蛋白表达明显降低,培养中出芽率明显减少,且Lgr5表达降低,吸收上皮细胞标记物细胞角蛋白20和杯状细胞标记物黏蛋白2表达水平升高;③转录组结果显示,与野生型对照小鼠比较,模型小鼠肠组织的差异基因有846个,其中上调基因438个,下调基因408个,差异基因在京都基因与基因组百科全书通路富集前5位的分别是化学致癌、药物代谢、视黄酸代谢、亚油酸代谢和类固醇生物合成,显著富集通路中关联的基因主要为Cyp2c29、Cyp2c65、Cyp3a11、Cyp3a25等Cyp450家族的改变;④结果表明,SIRT6缺失会导致肠道干细胞增殖和分化功能失衡,其机制可能与SIRT6调控代谢通路有关,其中SIRT6对细胞色素P450家族的调控与肠黏膜更新稳态关系密切。

关键词： SIRT6 基因敲除肠类器官肠黏膜肠道干细胞转录组小鼠

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农业动物肠道类器官研究进展

饲料工业 2022年第18期43卷 1-7页

作者：王修启谢文文周加义华南农业大学动物科学学院广东省动物营养调控重点实验室国家生猪种业工程技术研究中心广东广州510642

由干细胞自组建形成的肠道类器官(Intestinal organoids,IOs)是一种新兴的体外研究模型。这种多功能细胞组成的有机复合体能够高度模拟肠上皮组织,因此被广泛应用于肠道营养学、生理学、毒理学、病理学和药理学研究。近十年来,猪、鸡、... 详细信息

由干细胞自组建形成的肠道类器官(Intestinal organoids,IOs)是一种新兴的体外研究模型。这种多功能细胞组成的有机复合体能够高度模拟肠上皮组织,因此被广泛应用于肠道营养学、生理学、毒理学、病理学和药理学研究。近十年来,猪、鸡、牛、羊和兔等农业动物肠道类器官培养体系相继建立,有望成为推动营养素及功能性饲料添加剂活性评价和药物筛选及畜禽肠道疾病机制解析的新平台。文章简要概述IOs的结构和来源,重点结合实验室十年来开展猪肠道干细胞研究的工作经验,归纳总结农业动物IOs培养体系组成及其应用,旨在为IOs技术的应用推广提供指导。

关键词：农业动物肠道干细胞肠道类器官培养体系研究模型

葡聚糖硫酸钠诱导小鼠空肠损伤及肠上皮细胞组成变化的研究

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中国畜牧杂志 2022年第6期58卷 261-265页

作者：匡雁玲万志成李佩陈钦亮杨彩梅刘金松刘玉兰王丹武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室湖北武汉430023 浙江惠嘉生物科技股份有限公司浙江安吉313307

本试验旨在研究葡聚糖硫酸钠(DSS)对小鼠空肠组织形态学、炎性因子表达、ATP含量以及肠道上皮细胞组成的影响。试验选取12只6周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为2组:对照组和DSS组(饮用水中添加2.5%DSS),饲养至第8天时处死小鼠,取空肠样品待... 详细信息

本试验旨在研究葡聚糖硫酸钠(DSS)对小鼠空肠组织形态学、炎性因子表达、ATP含量以及肠道上皮细胞组成的影响。试验选取12只6周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为2组:对照组和DSS组(饮用水中添加2.5%DSS),饲养至第8天时处死小鼠,取空肠样品待测。结果显示:①与对照组相比,DSS诱导小鼠体重显著降低并伴有明显肛门出血,且DSS组小鼠的疾病活动指数(DAI)显著升高;②与对照组相比,DSS诱导小鼠空肠组织形态受损,其中绒毛高度极显著降低;③与对照组相比,DSS组小鼠空肠中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)mRNA表达量显著上升;④与对照组相比,DSS组小鼠空肠上皮微绒毛略稀疏、线粒体固缩且空肠中ATP含量极显著降低;⑤与对照组相比,DSS组小鼠空肠中Lgr5、Ascl2、Muc2的mRNA表达量显著降低,Alpi的mRNA表达量极显著降低,Lyz的mRNA表达量有降低趋势(P=0.061)。结果表明,DSS诱导了小鼠空肠炎症反应,造成了肠道损伤,降低了肠道干细胞和各种功能细胞数量。

关键词： DSS 空肠炎症反应肠上皮细胞肠道干细胞

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猪萨佩罗病毒感染对仔猪小肠肠道屏障的影响

猪萨佩罗病毒感染对仔猪小肠肠道屏障的影响

作者：严治山华中农业大学

学位级别：硕士

近年来养猪业高速发展的同时也面临着多种疫病的威胁,而腹泻性疾病则是其中最大的威胁之一,频发的腹泻疾病给养猪业造成了巨大的经济损失。猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)作为一种检出率较高的肠道病毒,感染后可引起的腹泻、肺... 详细信息

近年来养猪业高速发展的同时也面临着多种疫病的威胁,而腹泻性疾病则是其中最大的威胁之一,频发的腹泻疾病给养猪业造成了巨大的经济损失。猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)作为一种检出率较高的肠道病毒,感染后可引起的腹泻、肺炎、脑脊髓炎等疾病,会严重影响仔猪的健康生长。PSV的亚临床感染或隐性感染只引起轻微的组织损伤甚至不引起损伤,在临床上易被忽略,因而造成PSV感染扩散,致使防控难度加大。目前PSV广泛存在于国内规模化猪场中,在我国华南、华东、华北、西南等地猪场均有检出,给养猪业可持续发展带来威胁。迄今为止,对PSV的研究主要集中在流行病学方面,而对PSV感染后引起宿主腹泻的致病机理还暂不清楚。因此,为进一步研究PSV的致病机制,本文以PSV感染的仔猪为研究对象,对PSV在猪小肠的组织定位以及病毒对小肠黏膜形态的影响进行了研究,并进一步分析了PSV感染对仔猪肠道黏膜上皮细胞间紧密连接和上皮细胞损伤后修复的影响,主要研究内容和结果如下:1.猪萨佩罗病毒感染后在肠道组织中的定位以PSV毒株感染仔猪,建立感染模型。取仔猪肠道组织制成石蜡切片,免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测PSV在仔猪小肠组织内的分布。IHC结果显示,PSV阳性信号主要存在小肠绒毛上皮细胞和淋巴细胞内。2.猪萨佩罗病毒感染对小肠上皮细胞间紧密连接的影响以人工感染PSV的猪肠道组织为材料,通过荧光定量PCR、Western Blot、IHC等方法对肠道紧密连接相关蛋白进行检测,分析PSV感染对小肠上皮细胞间紧密连接的影响。结果显示,与对照组相比,PSV感染组仔猪回肠中Claudin-3、Occludin和ZO-1的m RNA和蛋白表达水平均下降,对Claudin-3进行的免疫组化染色结果显示,PSV感染后Claudin-3在绒毛顶端的上皮细胞间减少或消失。结果表明PSV感染后可下调紧密连接相关蛋白的表达,破坏紧密连接,造成肠道屏障完整性受损,引发肠道损伤。3.猪萨佩罗病毒感染对小肠上皮损伤后修复的影响通过荧光定量PCR、Western Blot等方法对肠道干细胞增殖分化相关因子进行检测。结果显示,与对照组相比,PSV感染组仔猪Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin的m RNA表达水平升高;LEF1的m RNA与蛋白表达水平升高;对肠道干细胞进行免疫组化染色结果显示,PSV感染后LGR5细胞增多。Notch信号通路中,Notch1、Notch3、Hes1的m RNA与蛋白表达水平下降,ATOH1表达水平升高,粘蛋白MUC2的m RNA的表达量升高。通过PAS染色对小肠中杯状细胞进行定位并分析阳性率,结果表明与对照组相比,PSV感染后回肠中杯状细胞显著增多。以上结果表明,PSV感染后可以促进肠道干细胞增殖并向分泌型的杯状细胞分化,分泌增强。4.猪萨佩罗病毒感染对仔猪肠道免疫的影响以人工感染PSV的猪肠道组织为材料制作石蜡切片,通过免疫组织化学对肠道相关免疫细胞进行定位,统计各肠段染色阳性率,分析肠道免疫细胞的数量、位置变化。结果显示,与对照组相比,PSV感染组仔猪空肠、回肠中CD3T淋巴细胞的数量减少,十二指肠、回肠中CD4T淋巴细胞的数量显著减少,与之相反的是空肠、回肠中CD8T淋巴细胞数量显著增多。结果表明,PSV感染影响了小肠的黏膜免疫功能,提示其与PSV临床感染引起的腹泻具有一定的相关性。综合以上结果得出,PSV感染后定植在小肠绒毛上皮细胞和固有层淋巴细胞内,破坏上皮间紧密连接,致使上皮选择透过性紊乱,上皮细胞脱落;促使肠道干细胞增殖并向分泌型细胞分化,并促进粘蛋白分泌,导致吸收紊乱;上皮选择透过性紊乱,诱导增强体液免疫,致使仔猪肠道的炎症病理损伤;以上结果共同作用引起仔猪肠道屏障完整性破坏进而引发仔猪腹泻。

关键词：猪萨佩罗病毒紧密连接肠道干细胞黏膜免疫肠道屏障

基于Lgr5+的复方黄柏液涂剂对UC模型小鼠修复结肠黏膜损伤的作用机制研究

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基于Lgr5+的复方黄柏液涂剂对UC模型小鼠修复结肠黏膜损伤的作用...

作者：杨晟山东中医药大学

学位级别：硕士

目的:复方黄柏液涂剂是一种经过长期临床检验的复方制剂,反响良好,但对其基础研究不足。本研究将复方黄柏液涂剂按照大、小剂量,通过灌胃的方式,干涉葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)溶液诱导肠道炎症性反应的溃疡性结... 详细信息

目的:复方黄柏液涂剂是一种经过长期临床检验的复方制剂,反响良好,但对其基础研究不足。本研究将复方黄柏液涂剂按照大、小剂量,通过灌胃的方式,干涉葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)溶液诱导肠道炎症性反应的溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)小鼠模型,观察其对炎症相关因子、抗炎症相关因子肠道干细胞相关蛋白富含亮氨酸重复序列G蛋白耦联受体5(Leucine-rich repeatcontaining G-protein coupled receptor 5,Lgr5)和端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse tranase,TERT)的影响作用,为黄柏液在临床应用方面提供新的实验论据和探究新的治疗途径。方法:选择50只C57BL/6N小鼠,雌雄各25只,将小鼠随机分为空白组(空白)、模型组(模型)、美沙拉嗪组(美沙,130mg/kg)、大剂量黄柏液组(大黄,13ml/kg)、小剂量黄柏液组(小黄,3.25ml/kg);除空白组外,其余各组均按照5天饮用2%DSS溶液,9天饮用清水为一周期,连续饮用四个周期的方法造模;从第三周期开始,美沙拉嗪组和大、小黄柏液组以各自剂量的药物溶液灌胃;空白组和模型组则只用等体积生理盐水灌胃进行对照;分别记录不同组小鼠的各项体征,并算出各组疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI);用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的血液中的炎性相关因子、抗炎性相关因子含量;采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测Lgr5和TERT蛋白在结肠组组中的表达情况。结果:复方黄柏液涂剂显著上调了肠道干细胞标记蛋白Lgr5和TERT的表达量,不同的使用剂量上调的蛋白水平也有所不同。模型组小鼠的体重、进食量、对外来刺激的反应能力明显低于空白组(P肠道干细胞的活动起抑制作用;与模型组相比,美沙拉嗪组和大、小黄组的DAI评分均有下降(P肠道干细胞活性方面均对DSS诱导的UC小鼠有所改善和缓解。以上结果在雌雄组中表现一致。结论:复方黄柏液涂剂可以改善UC小鼠的症状,提高小鼠的一般状况;复方黄柏液涂剂可以抑制炎症相关因子的上调,促进抗炎性相关因子的产生,以缓解炎症进展,改善UC患者症状;同时可能通过促进肠道干细胞标记蛋白Lgr5的表达,增强干细胞增殖信号的转导,从而促进干细胞增殖分化,修复肠道黏膜,以达到治疗UC的目的,实验结果还证明,黄柏液使用剂量不同,治疗效果会有所区别,基本表现为剂量依赖性的改变。

关键词：复方黄柏液涂剂肠道黏膜屏障溃疡性结肠炎肠道干细胞 Lgr5