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肠类器官在儿童肠道疾病机制研究中的作用及临床转化前景

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中华小儿外科杂志 2021年第8期42卷 754-759页

作者：田钰欣朱海涛沈淳国家儿童医学中心复旦大学附属儿科医院小儿外科上海201102

肠类器官是一种体外培养建立的富含肠道干细胞群的三维立体肠道组织。肠类器官可以模拟接近体内环境下肠道的生理状态,在研究肠道胚胎发育、建立肠道疾病模型、临床药物筛选、组织再生及基因治疗等领域更具优势,也为儿童肠道疾病研究提... 详细信息

肠类器官是一种体外培养建立的富含肠道干细胞群的三维立体肠道组织。肠类器官可以模拟接近体内环境下肠道的生理状态,在研究肠道胚胎发育、建立肠道疾病模型、临床药物筛选、组织再生及基因治疗等领域更具优势,也为儿童肠道疾病研究提供了全新思路。本文现就肠类器官作为儿童肠道疾病模型的研究进展及潜在临床转化应用前景做一综述。

关键词：肠类器官儿科肠道疾病临床转化研究

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肠类器官研究与传统形态学教学相结合的刍议

中国组织化学与细胞化学杂志 2019年第5期28卷 474-477页

作者：王锋超王健欣杨杰高美娇蒋吉英粟永萍陆军军医大学军事预防医学系防原医学教研室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038 山东潍坊医学院临床医学院人体解剖学教研室潍坊261053

近年来类器官技术获得突破,得以在生物医学基础科研和临床前实践中广泛应用,但目前在我校传统的形态学相关的教学中还未涉及相关内容。我们结合自己的科研优势,将肠类器官的模型和相关的研究进展融入本科生科研实践和第二课堂活动中,帮... 详细信息

近年来类器官技术获得突破,得以在生物医学基础科研和临床前实践中广泛应用,但目前在我校传统的形态学相关的教学中还未涉及相关内容。我们结合自己的科研优势,将肠类器官的模型和相关的研究进展融入本科生科研实践和第二课堂活动中,帮助学生理解组织器官发育和急性放射病模型,激发了学生的学习兴趣,促进了科研和教学工作的有机融合;同时为将类器官相关内容添加入传统的细胞生物学和组织胚胎学等相关教材提供了初步的依据。

关键词：肠类器官形态学教学改革科研实践

3D培养体系中不同肠上皮细胞株形成肠类器官潜能的比较及应用

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第三军医大学学报 2020年第1期42卷 31-38页

作者：欧静徐珍妮刘登群王涛王锋超王军平粟永萍陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系防原医学教研室全军复合伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆市纳米医学工程研究中心重庆400038

目的比较不同肠上皮细胞株在3D培养条件下形成肠类器官的潜能及特点,为利用肠上皮细胞株培养肠类器官提供实验研究基础。方法使用IEC-6、CT26.WT、Caco-2三种肠上皮细胞株进行3D培养,分析不同细胞株形成肠类器官的潜能。流式分选获取Cac... 详细信息

目的比较不同肠上皮细胞株在3D培养条件下形成肠类器官的潜能及特点,为利用肠上皮细胞株培养肠类器官提供实验研究基础。方法使用IEC-6、CT26.WT、Caco-2三种肠上皮细胞株进行3D培养,分析不同细胞株形成肠类器官的潜能。流式分选获取Caco-2单细胞后使用Matrigel进行培养并测定其生长速度。比较2D和3D培养条件下Caco-2细胞中肠道干细胞标志物Lgr5、Olfm4及增殖标志物Ki67的mRNA表达差异。免疫荧光染色分析2D和3D培养时Caco-2细胞内Ki67阳性细胞及lamp1阳性溶酶体的分布特点。比较5 Gy和15 Gy照射后Caco-2来源肠类器官中TUNEL阳性细胞分布特点。结果 3D培养时,Caco-2细胞可形成肠类器官,而IEC-6和CT26.WT细胞不能形成肠类器官,且单个Caco-2细胞也可形成肠类器官。Caco-2来源肠类器官中肠道干细胞标志物Lgr5、Olfm4和细胞增殖标志物Ki67的mRNA表达水平较2D培养时显著降低(P肠类器官中细胞内溶酶体呈极性分布,与小肠组织切片中溶酶体在肠上皮细胞内的分布一致。电离辐射可引起Caco-2来源肠类器官内细胞发生凋亡,且凋亡细胞比例与照射剂量密切相关。结论 Caco-2在3D培养时可形成与在体肠道结构和功能类似的肠类器官,为下一步进行胃肠道电离辐射研究和药物评价研究提供了更加稳定可靠的体外研究模型。

关键词：肠上皮细胞株 Caco-2细胞肠类器官干细胞电离辐射

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一种肠类器官样本快速石蜡块的制作方法

临床与实验病理学杂志 2021年第9期37卷 1131-1133页

作者：李丽陈菲包春娟周琪琪陈红英四川大学华西医院临床病理研究所成都610041 四川大学华西医院公共实验技术中心成都610041

类器官于2009年由Sato等[1]首次报道,其能较好地模拟体内细胞三维生长的生理条件,目前已广泛应用于疾病的研究并成为最具前景的实验技术。肠道病理的药理学、毒理学或微生物研究中常采用人或小鼠肠道组织进行肠类器官培养[2]。肠类器官... 详细信息

类器官于2009年由Sato等[1]首次报道,其能较好地模拟体内细胞三维生长的生理条件,目前已广泛应用于疾病的研究并成为最具前景的实验技术。肠道病理的药理学、毒理学或微生物研究中常采用人或小鼠肠道组织进行肠类器官培养[2]。肠类器官培养成为研究和治疗肠道疾病可行的方法[3],也是一种全新的消化道疾病体外研究模型。

关键词：肠类器官石蜡包埋 HE染色免疫荧光双重染色

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人肠类器官培养及基因导入体系建立

中华实验外科杂志 2018年第6期35卷 1066-1069页

作者：孙家亮曾之扬李亮李大力张学利锦州医科大学-上海市奉贤区中心医院研究生培养基地普外科上海201499 华东师范大学生命科学学院上海200241

目的建立体外人肠类器官培养以及基于慢病毒介导的基因高效导人体系。方法（1）将外科手术中回肠或结肠标本取下3～5cm后，将黏膜层与肌层分离开，用预冷的乙二胺四乙酸螯合液消化、分离并收集肠隐窝。用基质胶重悬肠隐窝后接入预热的9... 详细信息

目的建立体外人肠类器官培养以及基于慢病毒介导的基因高效导人体系。方法（1）将外科手术中回肠或结肠标本取下3～5cm后，将黏膜层与肌层分离开，用预冷的乙二胺四乙酸螯合液消化、分离并收集肠隐窝。用基质胶重悬肠隐窝后接入预热的96孔板，待凝固后冉加人含有生长因子的培养基，每日观察类器官生长情况，每隔2～3d更换培养基，6～7d后传代。（2）包装高滴度带有报告基因一绿色荧光蛋白的慢病毒感染肠类器官，观察类器官中绿色荧光的表达量。结果分离的肠隐窝可在体外培养形成“出芽”球状的微型肠类器官结构，且两组隐窝一类器官的存活效率均大于70％。在小肠类器官中可以表达正常肠上皮组织中吸收细胞相关的蛋白标志物。使用慢病毒载体导入的报告基因可以在类器官中持续稳定地表达。结论这种新型的肠类器官培养模型有利于研究基因在肠稳态维持中的功能。

关键词：肠类器官隐窝底部柱状细胞慢病毒基斟编辑基因导人体系

PDCoV感染猪肠类器官模型的建立及肠道组织嗜性的分子机制研究

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PDCoV感染猪肠类器官模型的建立及肠道组织嗜性的分子机制研究

作者：尹灵丹中国农业科学院

学位级别：硕士

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年新发现的一种猪肠致病性冠状病毒,感染主要造成新生仔猪的急性腹泻,严重危害全球养猪业的发展。PDCoV体内感染的主要部位是猪小肠,体外能感染包括人,猪和鸡等多种物种来源的细胞... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年新发现的一种猪肠致病性冠状病毒,感染主要造成新生仔猪的急性腹泻,严重危害全球养猪业的发展。PDCoV体内感染的主要部位是猪小肠,体外能感染包括人,猪和鸡等多种物种来源的细胞,具有潜在的跨种间传播能力,阐明决定其细胞和肠道组织嗜性的分子机制显得尤为重要。然而,由于缺乏能模拟体内肠上皮高度复杂的结构和功能的体外研究模型,PDCoV感染与宿主肠上皮相互作用的研究受到了限制。最近,一种在体外建立的肠类器官模型能概括体内肠上皮复杂的生理特性,为阐明PDCoV的致病机制提供了一个理想的体外研究模型。首先,为探究PDCoV能否感染猪肠类器官,本研究在体外分离培养了隐窝干细胞来源的猪肠类器官。分别利用实时荧光定量PCR(qPCR),TCID和间接免疫荧光(IFA)分析PDCoV在猪肠类器官中的感染情况,结果显示猪肠类器官对PDCoV易感,能够支持子代病毒粒子的释放(病毒效价可达10.33.33 TCID/mL)。为探索PDCoV感染肠上皮的靶细胞类型,通过IFA检测表明PDCoV能感染肠细胞,干细胞以及杯状细胞等多种功能性的肠道上皮细胞。其次,为探究猪肠类器官能否模拟PDCoV体内感染的肠道组织嗜性,分别通过qPCR,TCID和IFA分析发现,PDCoV在空肠类器官中的复制水平明显高于十二指肠类器官和结肠类器官,与PDCoV体内感染结果相符。为进一步探究PDCoV肠道组织嗜性的分子机制,通过转录组测序(RNA-Seq)及qPCR分析发现不同肠段来源的肠类器官的转录谱呈肠段特异性的表达模式,PDCoV的肠道组织嗜性与细胞受体猪氨基肽酶N(pAPN)在不同肠段中的差异表达密切相关,而与冠状病毒感染相关的宿主蛋白酶和干扰素(IFN)受体的表达水平无明显关联。为进一步探究IFN免疫应答是否与PDCoV的肠道组织嗜性相关,我们研究发现PDCoV在空肠类器官中诱导抗病毒因子的表达水平显著高于十二指肠类器官和结肠类器官,与PDCoV在肠类器官中的复制水平一致,表明IFN免疫应答与PDCoV的肠道组织嗜性不相关。此外,我们监测了PDCoV感染肠类器官后IFN的表达,结果显示在PDCoV感染晚期显著诱导Ⅰ型和Ⅲ型IFNs产生,而通过外源IFN-λ1处理能显著抑制PDCoV在肠类器官中的复制,这进一步排除了IFN免疫应答与PDCoV的肠道组织嗜性无关是由于病毒对IFN耐受导致的。综上所述,本研究揭示了PDCoV肠道组织嗜性的分子机制,为阐明PDCoV的致病机制提供了新的见解。同时,本研究结果表明猪肠类器官可作为研究猪肠道冠状病毒致病机制的良好体外研究模型,这为深入探究肠道病毒的分子生物学特性奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒肠类器官猪氨基肽酶N 干扰素干扰素受体

基于类器官技术的小鼠急性移植物抗宿主病肠道损伤模型建立与评价策略研究

同方学位论文库评论

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中国实验血液学杂志 2023年第1期31卷 233-240页

作者：韩梦月李佩霖尹博丰李志凌郝瑞聪李晓彤王飞燕田家仪丁丽宁红梅武文卿朱恒安徽医科大学基础医学院安徽合肥230032 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 空军特色医学中心血液科北京100142 解放军总医院第五医学中心血液病医学部北京100071 军事科学院军事医学研究院实验动物中心北京100071

目的:借助急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型小鼠血清和肠类器官培养技术,建立模拟aGVHD肠道损伤的体外模型并探索类器官水平aGVHD肠道损伤的规律。方法:以20-22 g雌性C57BL/6小鼠和20-22 g雌性BALB/c小鼠分别作为骨髓移植的供鼠和受鼠。... 详细信息

目的:借助急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型小鼠血清和肠类器官培养技术,建立模拟aGVHD肠道损伤的体外模型并探索类器官水平aGVHD肠道损伤的规律。方法:以20-22 g雌性C57BL/6小鼠和20-22 g雌性BALB/c小鼠分别作为骨髓移植的供鼠和受鼠。受鼠接受致死剂量(8.0 Gy)的γ射线全身照射后的4-6 h内,输注供鼠来源骨髓细胞(1×10^(7)/只,n=20)及脾脏有核细胞(5×10^(6)/只,n=20)混合液共0.25 ml,建立aGVHD小鼠模型(n=20)。于造模后d 7麻醉aGVHD小鼠,摘取眼球取血,静置离心后收取血清。分离C57小鼠小肠隐窝,在模拟体内肠道干细胞生长增殖的3D培养体系中培养。分别在类器官培养基中加入5%、10%和20%体积比例的aGVHD血清,培养3d,倒置显微镜下观察小肠类器官的形成过程,比较小肠类器官形态。为了进一步评估,收集aGVHD肠道类器官并观察其病理变化。结合HE染色进行肠类器官形态评价;结合Alcian Blue染色,观察aGVHD小肠类器官分泌功能;结合免疫组化技术,分析血清浓度在5%、10%和20%条件下肠类器官中Lgr5^(+)和Clu^(+)肠干细胞分布及变化规律。结果:成功建立了体外模拟aGVHD肠道损伤类器官模型。HE染色结果显示,5%浓度血清组肠道类器官形态明显较10%和20%组完整,随aGVHD血清浓度的升高,肠道类器官形态破坏加重。5%aGVHD血清组小肠类器官数量最多,出芽率最高,病理评分最低;20%aGVHD血清组形态破坏严重,没有出芽,病理评分最高(t=3.668、4.334、5.309,P肠道类器官分泌功能较5%组和10%组类器官弱,未见杯状细胞分布及其分泌黏液染色。免疫组化结果表明,5%组的aGVHD血清组的肠类器官中Lgr5^(+)细胞数量较10%aGVHD和20%的aGVHD血清组肠道类器官多,基本未见Clu^(+)细胞,相反,20%aGVHD血清组Lgr5^(+)细胞破坏严重,无法观察,Clu^(+)细胞比例明显升高。结论:aGVHD血清浓度影响体外小肠类器官数量、功能和肠干细胞的数量。血清浓度越高类器官发生损伤风险越大,揭示了aGVHD场景中肠类器官的形成和功能规律,为开展aGVHD肠损伤领域研究提供了新的工具。

关键词：辐射造血干细胞移植急性移植物抗宿主病肠类器官肠干细胞

沉默信息调节因子6基因敲除模型小鼠肠黏膜形态及转录组学的特征性变化

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中国组织工程研究 2022年第32期26卷 5119-5125页

作者：游弋晖宋春晖陈曦姚晓宏柯俊羽杜群宋宁李燕舞广州中医药大学科技创新中心脾胃研究所广东省广州市510405 河南中医药大学药学院河南省郑州市450046

背景:肠黏膜更新是维持机体稳态的关键生理过程,其中隐窝干细胞是肠上皮增殖和分化的驱动力。沉默信息调节因子(silent information regulator,SIRT)参与细胞的基因修复、代谢、能量平衡和寿命的调节,在肠上皮稳态中的研究逐步成为热点... 详细信息

背景:肠黏膜更新是维持机体稳态的关键生理过程,其中隐窝干细胞是肠上皮增殖和分化的驱动力。沉默信息调节因子(silent information regulator,SIRT)参与细胞的基因修复、代谢、能量平衡和寿命的调节,在肠上皮稳态中的研究逐步成为热点。肠类器官由单个隐窝干细胞经3D培养形成,可体外呈现肠上皮更新及受损后修复过程,是研究肠黏膜更新的最新模式。目的:探究SIRT6基因特异性敲除(SIRT6-i/-i)小鼠模型肠黏膜形态、肠类器官形成及其转录组学的特征性变化。方法:①采用Cre-loxp方法建立SIRT6-i/-i小鼠模型,制备小肠组织石蜡切片并进行苏木精-伊红染色,观察其病理变化,免疫组化检测肠干细胞标记物Lgr5和潘氏细胞标记物溶菌酶的表达;②体外构建SIRT6-i/-i小鼠肠类器官模型,Western-blot检测类器官SIRT6蛋白变化,免疫荧光检测肠类器官Lgr5、细胞角蛋白20和黏蛋白2蛋白表达变化;③采用肠组织进行转录组测序,分析该模型小鼠差异基因及相关功能的特征变化。结果与结论:①与野生型对照小鼠肠黏膜形态比较,SIRT6-i/-i小鼠肠黏膜出现绒毛稀疏、变短,隐窝高度变浅,且杯状细胞数目增多,潘氏细胞数目明显减少,Lgr5和溶菌酶的表达明显降低;②SIRT6-i/-i小鼠肠类器官中SIRT6蛋白表达明显降低,培养中出芽率明显减少,且Lgr5表达降低,吸收上皮细胞标记物细胞角蛋白20和杯状细胞标记物黏蛋白2表达水平升高;③转录组结果显示,与野生型对照小鼠比较,模型小鼠肠组织的差异基因有846个,其中上调基因438个,下调基因408个,差异基因在京都基因与基因组百科全书通路富集前5位的分别是化学致癌、药物代谢、视黄酸代谢、亚油酸代谢和类固醇生物合成,显著富集通路中关联的基因主要为Cyp2c29、Cyp2c65、Cyp3a11、Cyp3a25等Cyp450家族的改变;④结果表明,SIRT6缺失会导致肠道干细胞增殖和分化功能失衡,其机制可能与SIRT6调控代谢通路有关,其中SIRT6对细胞色素P450家族的调控与肠黏膜更新稳态关系密切。

关键词： SIRT6 基因敲除肠类器官肠黏膜肠道干细胞转录组小鼠

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食源性致病菌感染体内外肠道模型研究进展

食品与发酵工业 2023年

作者：宋仪洋吴梦洁董庆利李卓思上海理工大学健康科学与工程学院

体内外肠道模型是研究食源性致病菌的重要科学工具之一，已被广泛应用于食源性致病菌感染的致病机理、基因表型、耐受性、免疫反应和疫苗开发等研究领域。目前，国内外对食源性致病菌肠道模型的研究已有诸多进展，但缺乏较为系统的总结... 详细信息

体内外肠道模型是研究食源性致病菌的重要科学工具之一，已被广泛应用于食源性致病菌感染的致病机理、基因表型、耐受性、免疫反应和疫苗开发等研究领域。目前，国内外对食源性致病菌肠道模型的研究已有诸多进展，但缺乏较为系统的总结。本文对近年来研究食源性致病菌的体内外肠道模型进行了系统阐述。分别归纳了啮齿类、非人灵长类和其他一些动物模型在食源性致病菌研究中的应用进展，并系统阐述了细胞模型、肠道类器官等体外模型的研究进展及其应用价值和前景，最后分析和讨论了不同肠道模型在食源性致病菌研究中的优劣势。体内动物模型可全面评价食源性致病菌的宏观感染进程以及宿主免疫反应，但由于物种差异，结果不能完全适用于人类；体外三维细胞模型，尤其是肠道类器官和器官芯片，采用人体细胞，不存在种源差异，在研究食源性致病菌微观层面上的致病机制、细胞和组织趋向性方面潜力巨大。本文的进展研究，将为研究食源性致病菌提供科学依据和参考。

关键词：食源性致病菌体内模型体外模型肠类器官毒性评价