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大连工业大学学报 2018年第2期37卷 84-88页

作者：张齐牛庆昌姜琳黄君马俊丛丽娜李成大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

利用实验室已构建好的表达载体pET32a(+)-SjLys,在基因工程菌RoSetta(DE3)plysS中表达重组融合海参溶菌酶rSjLys。利用融合的组氨酸标签,通过Ni 2+-NTA层析柱分离、纯化,获得高纯度的重组海参溶菌酶。利用重组牛肠激酶在22℃、pH 7.4、... 详细信息

利用实验室已构建好的表达载体pET32a(+)-SjLys,在基因工程菌RoSetta(DE3)plysS中表达重组融合海参溶菌酶rSjLys。利用融合的组氨酸标签,通过Ni 2+-NTA层析柱分离、纯化,获得高纯度的重组海参溶菌酶。利用重组牛肠激酶在22℃、pH 7.4、16h条件下对目的蛋白rSjLys的融合标签Trx-His-S tag进行完全酶切,通过Ni 2+-NTA层析柱纯化得到纯度大于99%的非融合的海参溶菌酶SjLys。实验结果表明,作为i型溶菌酶,与rSjLys比较,非融合海参溶菌酶对指示菌溶壁微球菌具有明显的抑菌作用。

关键词：海参溶菌酶重组蛋白肠激酶酶切抑菌活性

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海参溶菌酶的功能、活性及其非酶抑菌活性位点的分析

海参溶菌酶的功能、活性及其非酶抑菌活性位点的分析

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作者：张齐大连工业大学

学位级别：硕士

海参是我国沿海城市重要的经济养殖物种,近年来,由于集约化养殖,导致其生存环境日益恶化,使海参病害问题日益严重。研究表明,海参在面对微生物感染时,会出现两条免疫应激策略。产生抗菌肽,如海参溶菌酶,通常情况下直接破坏病原菌机体;... 详细信息

海参是我国沿海城市重要的经济养殖物种,近年来,由于集约化养殖,导致其生存环境日益恶化,使海参病害问题日益严重。研究表明,海参在面对微生物感染时,会出现两条免疫应激策略。产生抗菌肽,如海参溶菌酶,通常情况下直接破坏病原菌机体;产生过量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。但是,过量的ROS本身对机体具有严重的毒害作用。生物体的抗氧化防御系统(SOD和CAT),可以平衡ROS,维持机体的氧化还原平衡。因此深入研究海参的相关免疫机制,了解免疫相关蛋白的性质和功能将能有效增强海参抗病能力,对深入探讨仿刺参的抗氧化及免疫功能有着重要的作用。本研究主要深入讨论了海参溶菌酶及过氧化氢酶的作用和功能。在活体水平上,实验首次分析了海参i型溶菌酶在各个组织中的分布,初步确定了海参溶菌酶的免疫功能。研究发现,海参溶菌酶的量在触手中最多,呼吸树次之,而在肠中最少,体腔细胞和体壁中海参溶菌酶的量基本持平。灿烂弧菌免疫刺激后,海参体腔中的海参溶菌酶含量持续增加,在48 h时含量达到最多,之后海参溶菌酶含量会逐渐降低。在细胞水平上,利用基因沉默技术分析了海参i型溶菌酶对病原菌的免疫抑制作用。基因沉默后,体腔细胞的溶菌酶蛋白在转录水平上的表达被抑制了约50%,而在同等免疫条件下,离体培养的体腔细胞其凋亡和坏死情况明显加剧。在体外,本课题对溶菌酶的抑菌活性关键位点进行分析,结合定点突变技术从而确定海参i型溶菌酶的活性位点;实验利用肠激酶酶切技术,首次在体外对重组溶菌酶蛋白的标签Trx-His-S tag肽段进行切除,获得了非融合海参i型溶菌酶,并对溶菌酶的抑菌活性和异构肽酶活性进行了分析。实验中还构建海参过氧化氢酶原基因序列的重组大肠杆菌胞内表达基因工程菌,成功表达目的蛋白,优化表达条件。实验成功构建基因工程菌pET28c(+)-CAT/BL21(DE3),对其表达条件:时间、诱导物IPTG的量、温度、pH、转速进行了优化,确定了最优表达条件为诱导物 IPTG 量为 0.05mmol/L、pH7.4、250C、180rpm、诱导 6h。本研究为海参溶菌酶的深入研究开发和利用提供了很好的理论依据,并为海参过氧化氢酶今后的分离纯化及活性研究提供了理论基础。

关键词：海参溶菌酶肠激酶酶切表达纯化过氧化氢酶

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