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肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究

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实用临床医药杂志 2008年第1期12卷 17-26页

作者：陈婷汤旭东万瑛房殿春梁光萍陈陵余松涛熊震师红雷罗元辉杨仕明第三军医大学西南医院全军消化病研究所第三军医大学基础部全军免疫学研究所重庆400038 第三军医大学西南医院烧伤创伤复合伤国家重点实验室重庆400038

目的研究肝素酶(Hpa)多肽疫苗体外能否诱发肝素酶特异性CTL反应,为肝素酶多肽疫苗的临床应用提供理论依据。方法5条HLA-A2限制性肝素酶抗原表位[Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)]分别负载正常人外周血来源(PBMC)的树突状细胞(DC),诱导肝素酶特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),采用4 h标准51Cr释放实验检测上述CTL对不同肿瘤细胞的免疫杀伤效应,采用ELISPOT方法检测肝素酶表位肽负载的DC疫苗刺激的效应细胞IFN-γ的释放。结果5条肝素酶多肽表位中,只有Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)体外可以诱导肝素酶表位特异性CTL反应,对Hpa阳性且HLA-A2阳性的KATO-Ⅲ胃癌细胞、U2OS骨肉瘤细胞、SW480结肠癌细胞具有明显的杀伤效应,对HLA-A2阴性的HepG2肝癌细胞和Hpa阴性的MCF-7乳腺癌细胞不具有杀伤效应,但对转染了HLA-A2的HepG2细胞和转染了肝素酶质粒的MCF-7细胞恢复杀伤效应,对自体淋巴细胞不具有杀伤效应,进一步研究表明,Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)表位肽可以促进CTL细胞IFN-γ的释放。结论人肝素酶特异性抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点,为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据。

关键词：肝素酶 CTL表位树突状细胞肿瘤疫苗

肝素酶和低氧诱导因子-2α基因在肾细胞癌中的表达及意义

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临床医学 2010年第6期30卷 78-79页

作者：马宏武邹华伟河南省邓州市第一人民医院泌尿外科邓州474150 河南省周口市中心医院肿瘤外科

目的探讨肝素酶(Hpa)和低氧诱导因子(HIF-2α)基因在肾细胞癌组织中的表达及临床意义。方法免疫组织化学法检测66例不同分型、分级、分期肾癌标本及35例正常肾组织中Hpa和HIF-2α的表达,分析其表达与肾癌分级分期的关系及二者表达的相... 详细信息

目的探讨肝素酶(Hpa)和低氧诱导因子(HIF-2α)基因在肾细胞癌组织中的表达及临床意义。方法免疫组织化学法检测66例不同分型、分级、分期肾癌标本及35例正常肾组织中Hpa和HIF-2α的表达,分析其表达与肾癌分级分期的关系及二者表达的相关性。结果 66例肾透明细胞癌标本中,Hpa阳性表达28例,阳性率为42.4%;HIF-2α阳性表达43例,阳性率为65.2%。癌旁正常肾组织中Hpa阳性表达2例,HIF-2α阳性表达3例,35例正常肾组织中Hpa、HIF-2α阳性表达较少。与癌旁正常组织比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Hpa和HIF-2α表达与肾细胞癌分期分级关系密切,共同参与了肾癌的发生发展。

关键词：肾细胞癌肝素酶低氧诱导因子-2α 免疫组化

siRNA表达载体对乳腺癌肝素酶基因的沉寂作用

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siRNA表达载体对乳腺癌肝素酶基因的沉寂作用

作者：刘启志福建医科大学

学位级别：硕士

近年研究发现,肝素酶（heparanase,HPSE）是一种能降低细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPG）的内切糖苷酶。它通过降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）,为肿瘤细胞的转移创造了条件。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指小分子双链RNA（small interfering RNA,siRNA）介导的转录后基因沉默现象。本实验希望通过RNAi技术在转录后水平阻断HPSE基因的表达,从而降低肿瘤细胞的浸润和转移,为临床预防肿瘤转移奠定了理论基础,并为肿瘤的治疗带来了希望。根据已发表的基因库中的人肝素酶基因序列,设计出与HPSE以外的基因组没有同源性的4条最佳序列（HPSE-1:5’GCA ATG AAC CTA ACA GTT TCC3’;HPSE-2:5’GCT TTA TGT GGC TGG ATA A3’;HPSE-3:5’CTG TCA GCC CGA ATG GGA A3’;HPSE-4:5’CTT GCC ACC TTT AAT GGA A3’）。取2μg质粒pGPU6/GFP/Neo载体,按照相应体系进行酶切处理,形成线性质粒载体。将设计的DNA寡核苷酸（oligo）分别用Tris-EDTA缓冲液溶解,取相应的正义链和反义链oligo溶液,在PCR仪上按照相应程序进行退火处理,形成shRNA模板。线性pGPU6/GFP/Neo载体与shRNA模板连接,构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo载体,碱裂解法抽提质粒,用BamH I,Pst I分别酶切鉴定重组质粒,并将阳性重组体送上海英骏生物技术有限公司测序。常规培养MDA-MB-231细胞。将构建好的重组质粒载体按照脂质体转染试剂盒LipofectaminTM2000操作说明转染MDA-MB-231细胞,实验设HPSE-1组;HPSE-2组;HPSE-3组;HPSE-4组;NEGATIVE CONTRAL组（阴性对照组）;MOCK组（只添加转染试剂组）;BLANK组（空白对照组）。转染细胞24 h和48 h后荧光显微镜观察细胞,pGPU6/GFP/Neo重组载体转染MDA-MB- 231后在绿色荧光激发波长下细胞应显示为绿色,转染后24 h和48 h荧光显微镜照片证明转染成功。Trizol法提取HPSE的总RNA。RT-PCR扩增条件为95oC（3 min）变性,95oC（30 s）,62oC（40 s）,共40个循环。Western blot检测HPSE蛋白的表达情况。实验结果显示:成功构建了带绿色荧光蛋白标记的重组质粒pGPU6/GFP/Neo载体;RT-PCR检测干扰组HPSE mRNA的表达明显降低;western blot显示干扰组HPSE蛋白的表达也明显降低,其中HPSE-1组mRNA的表达明显降低;MTT比色法检测细胞生长抑制率,24 h、48 h、72 h后重组质粒组细胞生长抑制率相对于对照组的细胞明显提高（P ＜0.05）。本实验将有利于阐明HPSE在乳腺癌及其他肿瘤侵袭转移中的作用机制,通过RNAi技术干扰HPSE在肿瘤转移中的关键酶作用,并降低HPSE蛋白的表达,从而抑制肿瘤的转移,为以后研制抗肿瘤的基因药物和方法提供理论依据和基础。

关键词： RNA干扰肝素酶质粒 MDA-MB-231 转染

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肝素酶及其研究进展

肝素酶及其研究进展

2007年全国生化与生物技术药物学术年会

作者：孙永福王凤山山东大学国家糖工程技术研究中心山东大学药学院生化与生物技术药物研究所山东大学国家糖工程技术研究中心山东大学药学院生化与生物技术药物研究所

目的综述肝素酶及其研究进展。方法根据文献对近年来肝素酶的研究进展进行整理、分析、归纳。结果与结论肝素酶在医药工业领域有着重要的应用价值和前景。了解肝素酶的结构性质,优化肝素酶的发酵生产条件以及对重组肝素酶的研究对进一... 详细信息

目的综述肝素酶及其研究进展。方法根据文献对近年来肝素酶的研究进展进行整理、分析、归纳。结果与结论肝素酶在医药工业领域有着重要的应用价值和前景。了解肝素酶的结构性质,优化肝素酶的发酵生产条件以及对重组肝素酶的研究对进一步拓宽肝素酶的生产和应用有着重要的意义．

关键词：肝素酶微生物肝素黄杆菌综述

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肝素酶在非小细胞肺癌中的表达及意义研究

肝素酶在非小细胞肺癌中的表达及意义研究

中期因子、肝素酶在食管鳞癌组织中的表达及意义

第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议

作者：宋作庆周乃康张鹏天津医科大学总医院心胸外科中国人民解放军总医院天津医科大学总医院心胸外科

目的:观察肝素酶（Heparanase,Hpa）在非小细胞肺癌（non—small cell lung cancer,NSCLC）中的表达情况及其与NSCLC患者临床病理特征之间的关系,并评价其可否作为NSCLC侵袭。转移及患者预后的指标。方法:检测2000 年1月-2000年12月解... 详细信息

目的:观察肝素酶（Heparanase,Hpa）在非小细胞肺癌（non—small cell lung cancer,NSCLC）中的表达情况及其与NSCLC患者临床病理特征之间的关系,并评价其可否作为NSCLC侵袭。转移及患者预后的指标。方法:检测2000 年1月-2000年12月解放军总医院胸外科手术切除的66例非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织,取同期15例相应癌旁正常肺组织作正常对照,收集病人的临床病理资料,并随访术后有无复发和转移。采用免疫组织化学染色（S-ABC法）检测以上标本中的Hpa的表达情况,结合患者的临床病理指标和随访结果,应用X2检验和生存曲线等方法分析Hpa在肺癌组织中的表达及意义。结果:肝素酶主要表达在癌细胞膜和／或细胞浆中。免疫组织化学结果表明:在66例非小细胞肺癌组织中有49例（74．2％）呈肝素酶阳性表达,而正常支气管和肺泡上皮中无阳性表达。X2检验显示肝素酶表达与肺癌的临床分期（P=0．042）,淋巴结转移（P=0．005）有密切关系。生存曲线分析表明肝素酶阳性表达组患者的5年生存率明显低于阴性组（P=0．025）。但多因素分析结果显示肝素酶不能作为影响患者预后的风险因素。结论:肝素酶在人肺癌组织中的表达较正常肺组织明显上调,并与肺癌的临床分期,淋巴结转移和患者的预后相关,但不能作为患者预后评估的独立指标。

关键词：非小细胞肺癌肝素酶转移预后免疫组化

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中期因子、肝素酶在食管鳞癌组织中的表达及意义

作者：朱永彪郑州大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一,近些年在中国乃至世界上,恶性肿瘤呈现上升趋势。据WHO专家预测,肿瘤将会成为21世纪人类第一杀手。研究表明,在恶性肿瘤分化、发生发展过程中是经历了多步骤的过程,从不典型增生到原位癌、浸... 详细信息

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一,近些年在中国乃至世界上,恶性肿瘤呈现上升趋势。据WHO专家预测,肿瘤将会成为21世纪人类第一杀手。研究表明,在恶性肿瘤分化、发生发展过程中是经历了多步骤的过程,从不典型增生到原位癌、浸润癌,在分子水平上有许多改变,包括生长因子/受体基因等表达在一些恶性肿瘤中已经提示为癌变的一个重要因素,寻求一种新的肿瘤标志物,并阐明它与恶性肿瘤生物学特性的关系,为恶性肿瘤的早期诊断以及治疗提供理论依据显得尤为迫切。近年来,相继克隆出多种与肿瘤发生、发展、浸润和转移相关的基因,其中中期因子（Midkine,MK）是一种新发现的肝素结合性生长因子,首先在视磺酸诱导分化早期的胚胎瘤中被发现,但与其它肝素结合性生长因子性质截然不同。在多种肿瘤中,与周围非癌组织相比,中期因子在肿瘤组织中出现过表达,如乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、神经母细胞瘤、Wilm’s瘤等。中期因子除在恶性肿瘤组织中有高表达外,在肿瘤早期、潜伏期和癌前病变阶段也呈高水平表达。目前大量的研究表明它与多种肿瘤生长、分化、血管生成、侵袭、转移及预后有关。肿瘤细胞要实现侵袭和转移,首先必须突破由基底膜（basement membrane,BM）和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）构成的组织屏障。乙酰肝素（heparan sulfate,HS）又称硫酸肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）是细胞外基质（ECM）和细胞表面的生物大分子,是基底膜（BM）的主要构成成分。肝素酶（heparanase,HPA）是一种葡萄糖苷酸内切酶,可水解乙酰肝素侧链与其核心蛋白相连的糖苷键,直接破坏ECM和BM。近来的研究发现,肝素酶不仅可以特异性地降解该屏障的主要成分—硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparansulfate proteoglycan,HSPG）,还能协同多种因子,通过多条途径直接和间接地促进肿瘤的浸润和转移,因而成为近年来肿瘤转移机制和对策研究的热点。中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,河南省食管癌发病率和死亡率均居中国首位,而浸润、转移是导致食管癌患者死亡的主要原因,因此探讨食管癌的发生、发展、浸润、转移机制已成为研究的热点之一。有关MK及HPA在食管鳞癌组织中的表达及意义的研究,至今国内外鲜见文献报道,为进一步探讨MK及HPA表达与食管癌的发生、发展、浸润、转移的关系,寻找诊断及抑制食管癌浸润、转移的有效方法,提高食管癌患者的生存时间、降低死亡率。本研究采用免疫组化SP法,分别观察了高发区49例食管鳞癌组织、20例癌旁不典型增生组织及49例正常粘膜组织中MK及HPA蛋白的表达情况,二者的联合检测为进一步探讨食管癌的浸润转移机制,有效地阻断食管癌的浸润转移提供了理论基础。方法 1.采用免疫组化SP法分别对49例食管鳞癌组织、20例癌旁不典型增生组织及49例正常食管粘膜组织中MK及HPA蛋白的表达进行检测。 2.统计学处理:所有数据均经SPSS11.0软件进行统计分析。阳性率之间的比较大样本采用x~2检验（chi-square）小样本采用Fisher精确检验;两变量之间的关系分析采用spearman等级相关分析表示。显著性水准α=0.05。结果 1.正常食管粘膜组织中MK蛋白阳性表达率为0.00%（0/49）,不典型增生组织中MK蛋白阳性表达率为50.00%（10/20）,食管鳞癌组织中MK蛋白阳性表达率为79.59%（39/49）;食管鳞癌组织中MK蛋白阳性表达率与相应的癌旁不典型增生组织及正常食管粘膜组织两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 2.正常食管粘膜组织中HPA蛋白阳性表达率为0.00%（0/49）。不典型增生组织中HPA蛋白阳性表达率为55.00%（11/20）,食管鳞癌组织中HPA蛋白阳性表达率为65.31%（32/49）;食管鳞癌组织中HPA蛋白表达与癌旁不典型增生组织相比,差异无统计学意义（P＞0.05） 3.21例伴有淋巴结转移的食管鳞癌组织中MK蛋白阳性表达率为95.24%（20/21）,无淋巴结转移的28例食管鳞癌组织中MK蛋白阳性表达率为67.86%（19/28）,两组间食管鳞癌组织中MK蛋白阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。 4.21例伴有淋巴结转移的食管鳞癌组织中HPA蛋白阳性表达率为100%（21/21）,无淋巴结转移的28例食管鳞癌组织中HPA蛋白阳性表达率为39.29%（11/28）,两组间食管鳞癌组织中HPA蛋白阳性率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。 5.无浸润、浸润达浅肌层、深肌层和食管外膜的食管鳞癌组织中MK蛋白阳性率分别为:40.00%（2/5）、57.14%（4/7）、77.78%（14/18）和100

关键词：食管鳞癌中期因子肝素酶浸润转移

miR-337-3p抑制肝素酶的表达调控胃癌细胞转移的作用和机制

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现代实用医学 2015年第9期27卷 1171-1173,F0004页

作者：李先鹏吴益峰李红亮陈明良李小平许丰宁波市鄞州人民医院宁波315040

目的确定mi R-337-3p对肝素酶(HPSE)的靶向调控作用,明确mi R-337-3p对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法利用生物信息学预测的方法筛选靶向HPSE的micro RNAs,通过荧光素酶报告基因系统和western blot的方法确定mi R-337-3p对HPSE的... 详细信息

目的确定mi R-337-3p对肝素酶(HPSE)的靶向调控作用,明确mi R-337-3p对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法利用生物信息学预测的方法筛选靶向HPSE的micro RNAs,通过荧光素酶报告基因系统和western blot的方法确定mi R-337-3p对HPSE的靶向调控。通过脂质体转染模拟物的方法在胃癌细胞中过表达mi R-337-3p,MTT法确认胃癌细胞增殖能力的变化,Transwell侵袭实验确认胃癌细胞侵袭能力的变化。收集临床胃癌组织及癌旁组织,利用实时定量PCR的方法检测mi R-337-3p和HPSE基因的相对表达水平。结果mi R-337-3p在HPSE基因的3'UTR上有1个结合位点,荧光素酶报告基因系统显示过表达mi R-337-3p能够显著下调含HPSE基因3'UTR序列的荧光素酶活性以及内源性的HPSE蛋白水平。胃癌细胞中过表达mi R-337-3p后,细胞增殖能力显著降低,侵袭能力明显下降。37例胃癌组织中,mi R-337-3p在癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织,而HPSE在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。胃癌组织中的mi R-337-3p与HPSE的水平与胃癌浸润程度、淋巴结转移以及TMN分期均有关(均<0.05)。结论 mi R-337-3p通过调控靶基因HPSE的表达,调控胃癌细胞增殖和侵袭能力。

关键词：胃肿瘤癌肝素酶增殖转移 mi R-337-3p

RNA干扰对肝素酶在肝癌细胞中表达及其肿瘤生长抑制的作用

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世界华人消化杂志 2008年第2期16卷 138-143页

作者：檀英霞刘志玄李素波田曙光卞丽红宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京市100850 军事医学科学院附属医院妇科北京市100071

目的:采用RNA干扰(RNAi)技术抑制肝癌细胞系HepG2肝素酶(Hpa)的表达,体内观察其对肿瘤生长的抑制作用.方法:以脂质体介导的方法将构建的2个抗Hpa短发卡式RNA(Hpa-shRNA)真核表达载体稳定转染人肝癌细胞株HepG2(高表达Hpa),并设空载体对... 详细信息

目的:采用RNA干扰(RNAi)技术抑制肝癌细胞系HepG2肝素酶(Hpa)的表达,体内观察其对肿瘤生长的抑制作用.方法:以脂质体介导的方法将构建的2个抗Hpa短发卡式RNA(Hpa-shRNA)真核表达载体稳定转染人肝癌细胞株HepG2(高表达Hpa),并设空载体对照组;流式细胞技术鉴定转染稳定性,Western blot及RT-PCR检测肝素酶蛋白和mRNA表达;将干扰组和对照组的肿瘤细胞皮下接种裸鼠,比较各组肿瘤的体质量和体积大小,免疫组化法检测肝素酶在肿瘤组织的表达.结果:与空载体组相比,干扰后的HepG2细胞中Hpa mRNA和蛋白表达明显降低,干扰组裸鼠的肿瘤生长速度明显变慢,统计结果表明干扰组在抑制肿瘤生长方面与空载体组、空白对照组存在显著差异(P0.05).结论:应用RNAi技术沉默Hpa基因可以有效下调肝癌肿瘤细胞中Hpa mRNA及蛋白的表达,抑制体内肿瘤生长.

关键词： RNA干扰肝素酶肝癌免疫印迹免疫组化法

肝素酶mRNA在重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

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肝素酶mRNA在重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

作者：关洪波中国医科大学

学位级别：硕士

目的检测肝素酶mRNA在重度子痫前期及正常孕妇胎盘组织中的表达，探讨其差异性及临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测20例胎盘组织中肝素酶mRNA的表达，标本均取自2003年1月～12月在我院产科住院剖... 详细信息

目的检测肝素酶mRNA在重度子痫前期及正常孕妇胎盘组织中的表达，探讨其差异性及临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测20例胎盘组织中肝素酶mRNA的表达，标本均取自2003年1月～12月在我院产科住院剖宫产分娩患者，其中10例为重度子痫前期患者作为实验组，10例为正常妊娠足月孕妇作为对照组，除研究因素外组间其他因素无差异性。两组患者均于胎盘娩出后立即取胎盘组织约1cm~3大小，置入—70℃深冻冰箱冷藏待检测。检测结果以均数±标准差（（?）±S）来表示。结果实验组肝素酶mRNA农达（1.25±0.21）明显高于对照组（0.62±0.41），两组间行t检验显示组间差异有统计学意义，p＜0.001。结论肝素酶mRNA在重度子痫前期患者胎盘组织中表达增加可能与该病患者胎盘血管栓塞有关。

关键词：肝素酶重度子痈前期胎盘组织