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重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶ⅰ在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质

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华东理工大学学报（自然科学版） 2011年第4期37卷 458-463页

作者：张云康高兴汪德健王富军赵健华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海中医药大学上海201203

肝素酶ⅰ(HeparinaseⅠ,HepⅠ)是一种多糖裂解酶,可特异性裂解硫酸肝素分子中糖苷键以制备低分子质量肝素(LMWH)。由于重组肝素酶ⅰ在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体,将肝素酶ⅰ基因的N端融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签,在大肠杆菌中... 详细信息

肝素酶ⅰ(HeparinaseⅠ,HepⅠ)是一种多糖裂解酶,可特异性裂解硫酸肝素分子中糖苷键以制备低分子质量肝素(LMWH)。由于重组肝素酶ⅰ在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体,将肝素酶ⅰ基因的N端融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签,在大肠杆菌中进行低温表达。结果显示,约90%的GST-HepⅠ融合蛋白以可溶性形式表达,表达的目标蛋白粗酶经过一步亲和纯化,比活为124.7 U/mg,纯化倍数达到366.7倍,酶活回收率为31.0%;结果表明Ca2+对重组GST-HepⅠ有很强的激活作用,GPC-HPLC结果显示重组GST-HepⅠ与天然肝素酶ⅰ裂解图谱相同。

关键词：肝素黄杆菌谷胱甘肽-S-转移酶肝素酶ⅰ 融合表达亲和纯化

人脐静脉血管内皮细胞缺氧复氧损伤时黏结合蛋白多糖1及细胞外信号调节酶表达与肝素酶ⅰ的调节

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第11期14卷 1995-1999页

作者：罗海彦胡长林重庆医科大学附属第二医院神经病学研究室重庆市400010

背景:研究发现肝素酶可以促使肿瘤细胞的syndecan-1脱落,而且低氧增加的巨噬细胞运动也可能与硫酸已酰肝素蛋白多糖的生物合成调节相关。目的:观察肝素酶ⅰ对缺氧复氧损伤人脐静脉血管内皮细胞黏结合蛋白多糖1及细胞外信号调节酶的调节... 详细信息

背景:研究发现肝素酶可以促使肿瘤细胞的syndecan-1脱落,而且低氧增加的巨噬细胞运动也可能与硫酸已酰肝素蛋白多糖的生物合成调节相关。目的:观察肝素酶ⅰ对缺氧复氧损伤人脐静脉血管内皮细胞黏结合蛋白多糖1及细胞外信号调节酶的调节作用。方法:采用缺氧复氧处理肝素酶ⅰ预培养的人脐静脉血管内皮细胞,用免疫组织化学、RT-PCR及western blot检测人脐静脉血管内皮细胞细胞黏结合蛋白多糖1、ERK2的表达。结果与结论:单纯缺氧复氧后人脐静脉血管内皮细胞的黏结合蛋白多糖1和ERK2表达轻度上调。缺氧复氧处理肝素酶ⅰ预培养人脐静脉血管内皮细胞的黏结合蛋白多糖1和ERK2明显上调,与单纯缺氧复氧处理人脐静脉血管内皮细胞相比差异有显著性意义。黏结合蛋白多糖1与ERK2上调表达成正相关。结果表明,黏结合蛋白多糖1和细胞外信号调节酶参与了人脐静脉血管内皮细胞缺氧复氧损伤的病理生理过程,肝素酶ⅰ可能通过调节黏结合蛋白多糖1来影响细胞外信号调节酶的表达。

关键词：肝素酶ⅰ 黏结合蛋白多糖1 细胞外信号调节酶缺氧/复氧损伤人脐静脉血管内皮细胞

肝素酶ⅰ在原核工程菌中异源可溶性表达及性质表征的研究

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肝素酶Ⅰ在原核工程菌中异源可溶性表达及性质表征的研究

作者：栗慧超长春理工大学

学位级别：硕士

肝素酶来源于肝素黄杆菌,是一类能够特异性降解肝素和乙酰肝素的多糖裂解酶。目前研究发现,肝素酶在制备低分子量肝素、抑制肿瘤细胞增殖,清除血液中残留肝素等方面具有重要的生物学作用,受到越来越多人的关注。目前研究最多的是肝素酶... 详细信息

肝素酶来源于肝素黄杆菌,是一类能够特异性降解肝素和乙酰肝素的多糖裂解酶。目前研究发现,肝素酶在制备低分子量肝素、抑制肿瘤细胞增殖,清除血液中残留肝素等方面具有重要的生物学作用,受到越来越多人的关注。目前研究最多的是肝素酶ⅰ,肝素酶ⅰ在重组大肠杆菌中可溶性表达低,导致其产量较低,纯化较难,成本较高等问题,限制了其在医药方面的应用。因此寻找合适的方法来提高肝素酶ⅰ的产量和纯度具有重要的意义。分子伴侣素CpkA是从嗜热菌Thermococcus kodakarensis中发现的耐热伴侣蛋白,具有辅助蛋白折叠功能和ATPase活性。本文构建重组质粒pACYC-CpkA和切去前导肽并加上带正电signal-tag的HepI’-28a质粒,并以单转或共转化形式转入大肠杆菌*** DE3（BL21）中诱导表达,通过镍柱纯化,除盐柱除盐,阳离子交换柱层析等优化纯化方式获得可溶性的HepI’蛋白;同时在*** DE3-RIPL中原核表达分子伴侣素CpkA,经85℃热处理1h、饱和度为80%的硫酸铵沉淀、透析除盐和阴离子交换柱层析,获得高纯度CpkA蛋白;利用本文制备的分子伴侣素CpkA蛋白在体外与HepI包涵体蛋白进行尿素梯度复性研究;实验结果表明:去除前导肽后,肝素酶ⅰ的可溶性表达量明显增加,与CpkA共表达后,包涵体蛋白进一步较少,最终纯化得到大小为43 kDa,纯度90%以上,最大浓度为0.404 mg/ml的HepI’蛋白,酶活为27.16 IU/mg;原核表达获得大小为59.17kDa,纯度为93%以上,浓度为2.706 mg/ml的CpkA蛋白,其ATPase活性为539IU/mg;利用纯化的CpkA蛋白帮助HepI包涵体蛋白进行体外尿素梯度梯度复性,包涵体蛋白回收率约为50%,复性蛋白无明显肝素酶ⅰ活性。本研究工作为肝素酶ⅰ的大量制备提供了一种新的方法,为肝素酶ⅰ在医药方面的广泛应用奠定了物质基础。也为分子伴侣素CpkA能够在体内环境下帮助异源蛋白折叠提供了实验依据。

关键词：肝素酶ⅰ 分子伴侣可溶性表达蛋白纯化

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肝素酶ⅰ的基因工程表达及分子改造

肝素酶Ⅰ的基因工程表达及分子改造

作者：杨宝成天津科技大学

学位级别：硕士

肝素酶ⅰ(heparanase Ⅰ,HepⅠ)是一种能降解肝素或肝素类结构物质的多糖裂解酶,在制备低分子量肝素、消除体外循环血液中肝素以及测定肝素类物质结构等方面具有十分重要的作用。肝素酶ⅰ最初来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinu... 详细信息

肝素酶ⅰ(heparanase Ⅰ,HepⅠ)是一种能降解肝素或肝素类结构物质的多糖裂解酶,在制备低分子量肝素、消除体外循环血液中肝素以及测定肝素类物质结构等方面具有十分重要的作用。肝素酶ⅰ最初来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum),但其产量低、活性低、稳定性差,而基因工程表达产品则极易形成无活性的包涵体。为了解决以上问题,本论文从提高基因工程表达肝素酶ⅰ的可溶性及分子改造寻找具有更高活性的肝素酶ⅰ突变体等方面着手,开展了如下研究:根据大肠杆菌对密码子的偏爱性对F heparinum,肝素酶ⅰ基因进行优化并合成目的基因,经酶切、连接后插入到大肠杆菌表达质粒pE-SUMO上,构建得到表达载体pE-SUMO-HepⅠ,转化大肠杆菌*** Rosetta(DE3)后筛选获得HepⅠ基因工程表达菌株,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示目的蛋白得到了有效的可溶性表达,且检测发现融合肝素酶ⅰ具有较好的酶活。接下来,为了提高肝素酶ⅰ蛋白的表达水平,我们对诱导温度、诱导转速、诱导剂浓度和诱导时间进行了优化。结果表明,重组大肠杆菌的最佳诱导表达条件为:在37℃培养到OD600为0.6时,加入终浓度为 0.6 mM 的 IPTG,150 rpm,30℃诱导培养 9h。为了进一步提高HepⅠ活性,我们通过对HepⅠ蛋白质结构及功能域的生物信息学分析,选择性的对肝素酶ⅰ进行定点突变,得到了 S169D、A259D和C297S等三种突变体,通过对基因工程表达获得的三种突变体蛋白质进行酶活分析,结果表明S169D、A259D和C297S突变体的比酶活分别为37.8 IU/mg、17.9 IU/mg和42.1 IU/mg,分别是野生型HepⅠ的1.65、0.78、1.83倍。其中,由于S169D为本研究首次发现的高活性突变体,我们着重对其进行了后续分析,结果显示S169D的最适诱导表达条件为:在37℃培养到OD600为0.6时,加入终浓度为0.6 mM的IPTG,200 rpm,30℃诱导培养12 h,进一步的酶学性质分析显示其最佳反应温度为30℃,最佳pH值7.0,最佳CaCl2浓度为50 mM。综上所述,本研究利用SUMO标签融合表达策略建立了 HepⅠ的高效可溶性基因工程表达体系,并首次发现了 HepⅠ的一种高活性突变体S169D,为提升HepⅠ及低分子肝素等药物的生产效率奠定了新的基础。

关键词：肝素酶ⅰ 低分子肝素可溶表达纯化定点突变酶学性质

重组大肠杆菌生产多形拟杆菌肝素酶I的发酵优化

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食品科技 2019年第6期44卷 1-8页

作者：张川刘敏敏刘耀天张悦李中媛宋亚囝罗学刚工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院

以实验室前期构建的N端融合SUMO标签的多形拟杆菌肝素酶ⅰ(SUMO-Bt-Hep Ⅰ)生产菌株重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pE-SUMO-Bt-HepⅠ为研究对象,通过单因素确定其最佳表达条件:诱导温度25℃、诱导剂浓度0.4mmol/L、诱导时间12 h;首先通过Pla... 详细信息

以实验室前期构建的N端融合SUMO标签的多形拟杆菌肝素酶ⅰ(SUMO-Bt-Hep Ⅰ)生产菌株重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pE-SUMO-Bt-HepⅠ为研究对象,通过单因素确定其最佳表达条件:诱导温度25℃、诱导剂浓度0.4mmol/L、诱导时间12 h;首先通过Plackett-Burman试验,筛选出培养基中3个主要影响酶活的因素:葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨。并通过响应面试验确定最佳培养基为:葡萄糖9.52g/L,酵母提取物9.61g/L,蛋白胨19.92g/L,硫酸铵4g/L,磷酸氢二钠18g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸镁5g/L。在此最佳培养基下发酵酶活预测可达55133IU/L,3次验证试验获得的SUMO-Bt-HepI酶活力平均为56961 IU/L,与理论预测值接近,比优化前(24215.9 IU/L)提高了2.3倍。通过5L发酵罐的分批补料扩大培养得到的最高发酵酶活为3.937×10^5IU/L,比摇瓶提高了6.91倍,这是目前报道发酵生产肝素酶I的最高水平,对工业化应用具有一定的指导意义。

关键词：重组大肠杆菌多形拟杆菌肝素酶ⅰ 响应面发酵优化

基于化学酶法合成的肝素寡糖探究肝素酶ⅰ的催化切割模式

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基于化学酶法合成的肝素寡糖探究肝素酶Ⅰ的催化切割模式

作者：张成盈山东大学

学位级别：硕士

肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)残基与氨基葡萄糖(GlcN)残基以1→4糖苷键连接而成的二糖重复单元组成的糖胺聚糖,因糖链长短不一、各糖单元存在可变的硫酸化、异构化等修饰,使其成为分... 详细信息

肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)残基与氨基葡萄糖(GlcN)残基以1→4糖苷键连接而成的二糖重复单元组成的糖胺聚糖,因糖链长短不一、各糖单元存在可变的硫酸化、异构化等修饰,使其成为分子量、精细结构不均一的多组分混合物,并表现出多种多样的生物活性。作为有机合成中最具挑战性的研究领域之一,国内外多个研究小组已成功发展了许多肝素/HS寡糖合成的新方法和策略,实现了特定结构肝素寡糖的定向合成,但现有单纯化学合成策略存在反应步数多、合成效率极低等不足。课题组前期通过模拟肝素的体内生物合成途径,成功发展了一种以多酶催化反应为主的、温和的化学方法为辅的化学酶法合成方法,这种全新的技术具有步骤少、产率高等优点,被认为是最具有发展前途的肝素寡糖合成策略。因此,本课题以之前建立的化学酶法合成技术为基础,有针对性地引入温和的化学修饰方法对合成特定寡糖进行N-脱硫酸化修饰以突破修饰酶对底物识别的限制,从而构建结构更加丰富的肝素寡糖化合物库。此外,肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)产生的肝素酶ⅰ(heparinase Ⅰ)是表征肝素/HS结构、制备低分子量肝素及寡糖的工具酶之一,但之前以结构不均一的肝素及其衍生物为底物确定的底物特异性不够准确,故本论文通过全面测定肝素酶ⅰ对合成的、结构确定的肝素寡糖的降解作用,首次发现该酶对多种不同的糖苷键均具反应活性,并阐明了酶的催化活性与底物修饰模式的关系;最后利用生物膜层干涉技术(bio-layer interferometry,BLI)分析不同寡糖底物与肝素酶1的亲和力大小。本研究清晰阐明了肝素酶ⅰ的多样化催化切割模式,为拓展肝素酶的应用奠定了基础。本学位论文取得的成果及结论包括以下几个方面:1.糖基供体与硫酸基供体的制备肝素寡糖合成需要稀有的糖基供体UDP-GlcNTFA、UDP-GlcA及硫酸基供体PAPS,均采用本实验室建立的酶法或化学酶法合成、离子交换柱层析纯化制备,所得产物的纯度均>95%,制备规模达克级以上。所用酶包括NahK、GlmU、PPA、KAST/APSK均为大肠杆菌(***)表达、亲和柱层析制得。2.肝素寡糖的合成、纯化及结构表征以对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料,在糖基转移酶KfiA或PmHS2的催化作用下,于其非还原端交替添加GlcNTFA或GlcA得到肝素寡糖骨架,每步反应产率高达96%;经反相C18柱层析纯化,得到纯度高于90%的寡糖骨架。含GlcNTFA的寡糖利用LiOH脱除三氟乙酰基后,以PAPS为硫酸基供体,由N-硫酸基转移酶(NST)催化合成N-硫酸化肝素寡糖。然后在C5异构化酶的催化作用下,使寡糖链中介于两个N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的GlcA残基转变为IdOA,或者在C5异构化酶和2-O-硫酸基转移酶(2-OST)的共同催化下,使GlcA残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),所得到两种寡糖的产率分别为40%和80%,纯度均高达92%以上。最后在6-O-硫酸基转移酶1/3(6-OST1/3)的催化作用下,寡糖的GlcNS发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S),得到的三种寡糖产物的产率均高于98%,纯度均高达95%以上。此外,为突破修饰酶对底物识别的限制,以温和的化学法对合成的寡糖进行N-脱硫酸化,得到四种含N-非取代GlcN(GlcNH2)的肝素寡糖,产率分别为98%、70%、73%、65%,经离子交换柱层析纯化后的寡糖纯度均高达95%以上。ESI-MS及NMR分析表明不同修饰模式的肝素寡糖产物的结构正确。3.肝素酶ⅰ的催化切割模式的研究以合成的一系列结构确定的肝素/HS寡糖为底物,利用HPLC、ESI-MS测定肝素酶ⅰ在不同条件下对底物的切割作用,以探究酶对不同底物的催化特性。研究结果如下:(U)肝素酶ⅰ不能切割N-非取代GlcN(GlcNH2)与糖醛酸之间的糖苷键(GlcNH2-IdoA2S 或 GlcNH2-IdoA2S 或 GlcNH26S-IdoA 或GlcNH26S-IdoA2S),结合文献报道-GlcNAc6S-IdoA2S能被酶切割,因此N-取代GlcN(GlcNS或GlcNAc)是肝素酶ⅰ切割必需的。除含-GlcNS6S-IdoA2S-的肝素寡糖,我们发现肝素酶ⅰ还能够切割含-GlcNS6S-GlcA2S-、-GGcNS-IdOA2S-、-GlcNS-GlcA2S、-GlcNS6S-IdoA-、GlcNS6S-GlcA-糖苷键的不同寡糖,这一结果表明2-6?-硫酸化糖醛酸和6-O-硫酸化葡糖胺(GlcNS6S)不是肝素酶ⅰ切割必需的。(2)肝素酶ⅰ对六种肝素寡糖底物的切割效率存在较大差异,其对高硫

关键词：化学酶法合成肝素寡糖肝素酶ⅰ 切割模式底物特异性

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三种肝素酶ⅰ的克隆表达及性质研究

三种肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质研究

作者：刘彩芸江苏大学

学位级别：硕士

肝素酶ⅰ(Hep Ⅰ)是一种可以特异性将肝素降解为低聚糖或不饱和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制备,体外循环中肝素的消除以及肝素精确结构的确定。本文选择了三种不同来源的肝素酶I,构建可溶性表达肝素酶I的大肠杆菌表达系统,... 详细信息

肝素酶ⅰ(Hep Ⅰ)是一种可以特异性将肝素降解为低聚糖或不饱和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制备,体外循环中肝素的消除以及肝素精确结构的确定。本文选择了三种不同来源的肝素酶I,构建可溶性表达肝素酶I的大肠杆菌表达系统,制备了三种重组肝素酶I,对其表达过程和酶学性质进行研究,并对肝素酶I与底物肝素的作用方式进行了初步探索,主要研究内容包括:1)选择来源于Bacteroides eggerthii VPI T5-42B-1、Bacteroides xylanisolvens SDCC 2a和Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的三种肝素酶I,分别命名为BeHep Ⅰ、BxHep Ⅰ和BcHep Ⅰ,各自编码394、381和389个氨基酸残基。成功构建了三种pET-28a-Hep Ⅰ表达载体,通过*** BL21(DE3)表达可溶性肝素酶I。2)对三种重组肝素酶ⅰ进行表达研究。诱导BeHep Ⅰ的最适IPTG浓度为0.1mM,温度为30℃,诱导时长为6 h,得到的粗酶活力为5038 U·L。经镍柱亲和纯化后,得到了一条分子量为42.23 kDa的明显目的蛋白条带。其比活力为480 U·mg。BxHep Ⅰ的最佳表达条件为:0.2 mM的IPTG在25℃诱导7 h,得到的粗酶活力为7144 U·L。镍柱亲和纯化得到一条分子量为43.06kDa的目的蛋白条带,比活力为57.6 U·mg。BcHep Ⅰ的最适表达条件为:0.05 mM IPTG在30℃诱导表达12 h,得到的肝素酶I粗酶总活为7005.4U·L。通过Ni-NTA纯化后,SDS-PAGE结果显示得到了单一的目的蛋白条带,比活力为639.5 U·mg。3)对三种重组肝素酶ⅰ的酶学性质进行研究。BeHep Ⅰ在40 mM,pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中相对酶活力最高。BeHep Ⅰ的最适反应温度为30℃,在此温度下半衰期为350 min。1 mM Ca对BeHep Ⅰ活力具有69%的提升作用,而Zn可以完全抑制BeHep Ⅰ的活性。BeHep Ⅰ的K值为3.6 mg·mL,V为647.93 U·mg。BeHep Ⅰ在4℃储存一周后活力可以保持89.1%。BxHep Ⅰ最适反应温度和pH为:35℃,pH 7.5。Ca和Mg可以促进BxHep Ⅰ的酶促反应速率,而Zn和Co抑制BxHep Ⅰ的活力。BxHep Ⅰ的K值为0.79mg·mL,V为124.58 U·mg。BxHep Ⅰ在30℃保温时半衰期为597 min,37℃下半衰期约为158 min。在4℃储存7天后,肝素酶I活力为初始活力的73%。BcHep Ⅰ在35℃,pH 7.5的条件下能够达到最高的比活力。Ca、Mg和Mn对酶活力有不同程度的促进作用,而Co和Zn使酶活力降低。BcHep Ⅰ的K值为0.17 mg·mL,V值为740.58 U·mg。BcHep Ⅰ在30℃半衰期为300 min,37℃半衰期为59 min。BcHep Ⅰ在4 C和-20℃储存3天后,活力均能够保持81%,在4℃储存时半衰期约为10天。4)通过同源建模和分子对接分析肝素酶ⅰ与底物肝素的作用方式。对BeHep Ⅰ而言,肝素通过Lys99、Arg101、Gln241、Lys270、Asn275和Lys292六个高度保守的氨基酸残基与BeHep Ⅰ进行结合,形成的8个氢键较BsHep Ⅰ和BtHep Ⅰ中形成的氢键短,说明了BeHep Ⅰ活力较高;建模之后BeHep Ⅰ的构象熵较小,验证了该酶的稳定性良好。BxHep Ⅰ与肝素通过Asn25、Gln27、Arg88、Lys116、His156、Arg161、Gln228、Tyr356、Lys358和Tyr362十个氨基酸残基进行结合,BxHep Ⅰ与肝素之间形成的13个氢键增强了蛋白-配体的稳定性,最小的构象熵也证明了BxHep Ⅰ优良的稳定性。而Arg88、His156、Tyr356和Tyr362这四个残基形成较大的空间位阻,阻碍了蛋白与配体的结合,因而降低了酶与蛋白的亲和力以及酶的催化活力,这解释了BxHep Ⅰ的K值较大,比活力较低的原因。BcHep Ⅰ与肝素的结合涉及Gln15、Lys74、Arg76、Lys104、Arg149、Gln208、Tyr336、Tyr342和Lys338九个氨基酸残基,与底物肝素形成了11个氢键,且结构中不含侧链较大的His,避免了额外的空间位阻的形成,因而相比于BeHep Ⅰ和BxHep Ⅰ,K值更小,比活力更高。

关键词：肝素酶ⅰ 表达性质表征分子建模低分子量肝素

通过理性设计提高来源于埃希拟杆菌的肝素酶ⅰ的热稳定性

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通过理性设计提高来源于埃希拟杆菌的肝素酶Ⅰ的热稳定性

作者：苏文彬江苏大学

学位级别：硕士

利用肝素酶I制备低分子量肝素条件温和,反应高效,专一性强,并且降解过程不会导致硫酸根基团的丢失,因此在低分子量肝素的生产中具有巨大的潜力。然而目前用于制备低分子量肝素的肝素酶I稳定性差,在25 ℃下半衰期仅200分钟,稳定性无法满... 详细信息

利用肝素酶I制备低分子量肝素条件温和,反应高效,专一性强,并且降解过程不会导致硫酸根基团的丢失,因此在低分子量肝素的生产中具有巨大的潜力。然而目前用于制备低分子量肝素的肝素酶I稳定性差,在25 ℃下半衰期仅200分钟,稳定性无法满足工业生产的要求。本论文尝试利用辅助分子设计计算,进一步通过结构改造提高肝素酶I的热稳定性。论文的主要内容包括两部分:第一部分通过分析肝素酶I的结构,通过优化得到合理的肝素酶I构象。主要对肝素酶I的α螺旋偶极矩,潜在的二硫键形成位点,以及氨基酸柔性计算,确定了可能影响肝素酶I稳定性的关键氨基酸残基。在对肝素酶I的α螺旋偶极矩的计算中,通过在C端引入带正电荷的氨基酸,在N端引入带负电的氨基酸增加α螺旋的偶极矩从而提高肝素酶I的稳定性。得到了6个突变体:V168E/T177H,V168Glu/T177Arg,V168E/T177K,V168D/T177H,V168D/T177R和V168D/T177K,其中V168E/T177H和V168D/T177R突变体保留27.7%和30.3%的催化活力,且25 ℃半衰期为野生型的15.48%和14.14%,其余突变体在突变后丧失催化活力。通过Disulfide by Design在线服务器对肝素酶I潜在二硫键形成位点进行计算,结果显示S57C/A365C,I106C/L172C,T109C/H112C和W147C/L226C的突变可能形成二硫键,并影响肝素酶I的稳定性。实验结果证明,二硫键的引入会导致肝素酶I表达受阻。最后对肝素酶I柔性氨基酸的计算中发现,Ala145是肝素酶I中最不稳定的氨基酸残基,对其进行饱和突变,研究该点柔性对肝素酶I稳定性的影响。实验显示Ala145突变为异亮氨酸(Ile),亮氨酸(Leu),甲硫氨酸(Met)和缬氨酸(Val)后,柔性降低,且突变后保留了7%,10%,2%和21%的催化活性,而25 ℃下的半衰期为430,380,250和360分钟,相对于野生型肝素酶I的200分钟均有不同程度的提高。第二部分采用两种不同的计算工具计算肝素酶I和突变体的解折叠自由能的差值(ΔΔG),筛选可能影响肝素酶I稳定性的位点。首先采用Prethermut软件预测肝素酶I单点突变后的解解折叠自由能,并根据其与野生型的差值筛选出以下四个突变体:W33P,F60Y,E82N和D152I。结果显示,仅突变体D152I保留40%,其25 ℃的半衰期为1300分钟,相较于野生型提高了7.5倍,其余突变体则在突变后丧失催化活性。继续通过Fold X结合Rosetta软件预测肝素酶I单点突变后的解折叠自由能,并筛选出如下17个突变体:K14E,F48Y,R63K,G73A,S141V,T142I,Q157M,A190I,K213G,N240F,R244K,S256M,S272Y,T300L,N307T,Q338L和D344E。而在以上17突变体,除了K14E,F48Y,R63K,T142I,N240F,T300L和Q338L丧失催化活性外,其余突变体不仅保留较高的催化活性,而且其25 ℃的半衰期也有大幅度的提高。其中以G73A和K213G最为突出,其催化活性位野生型的91.77%和75.69%,而25 ℃的半衰期为14000和8700分钟。通过计算选择性突变,有效提高了肝素酶I的热稳定性同时保持了其催化活性,为肝素酶I的工业应用奠定了一定的基础。此外,本论文设计的热稳定性改造策略,也可以为其它酶的结构改造提供一定的借鉴意义。

关键词：肝素酶ⅰ 理性设计定点突变稳定性

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黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

食品与药品 2008年第4期10卷 5-7页

作者：傅文彬熊可强阚梦元赵健李素霞姬胜利袁勤生华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 山东大学药学院山东济南250012

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序... 详细信息

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入*** BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。

关键词：肝素酶ⅰ 克隆基因表达酶活性