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响应面法优化人凝血因子Ⅸ肝素亲和层析条件研究

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中国输血杂志 2021年第1期34卷 26-29页

作者：胡川罗观文李文善庾昌文杨波波广东双林生物制药有限公司广东湛江524000

目的利用响应面法对肝素亲和层析在人凝血因子Ⅸ纯化中的纯化条件进行优化,确立最佳层析工艺参数。方法通过单因素试验分析上样温度对纯化效果的影响,三因素三水平响应面法优化层析洗脱条件,福林酚法和一期凝固法分别测定总蛋白含量和... 详细信息

目的利用响应面法对肝素亲和层析在人凝血因子Ⅸ纯化中的纯化条件进行优化,确立最佳层析工艺参数。方法通过单因素试验分析上样温度对纯化效果的影响,三因素三水平响应面法优化层析洗脱条件,福林酚法和一期凝固法分别测定总蛋白含量和人凝血因子Ⅸ效价,以比活性指标以及工艺回收率评价层析纯化效果。结果优化的最佳层析条件为5℃上样,洗涤4 CV,洗脱液配方枸橼酸钠20 mmol/L、盐酸精氨酸18.7 mmol/L、NaCl 611.6 mmol/L、pH7.5;在此最佳层析参数条件下工艺回收率为(46.6±2.9)%,人凝血因子Ⅸ效价达到(68.4±4.7) IU/mL,比活性(62.8±3.3) IU/mg。结论经本研究优化的肝素亲和层析工艺参数可对人凝血因子Ⅸ的纯化起到很好的指引作用。

关键词：人凝血因子Ⅸ 肝素亲和层析响应面法工艺优化

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重组人酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化

华东理工大学学报（自然科学版） 2001年第4期27卷 361-363,378页

作者：刘叶青徐殿胜曹学君桑玉英张秀萍华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室生物工程系上海200237

采用肝素 - sepharose亲和层析和 Sephadex G- 1 0 0凝胶过滤层析法 ,从含 ha FGF基因重组体的大肠杆菌菌体中分离纯化得到人酸性成纤维细胞生长因子 ( rha FGF)。 SDS- PAGE,IEF电泳检测均为单一谱带 ,HPLC层析显示单一蛋白峰。 SDS- P... 详细信息

采用肝素 - sepharose亲和层析和 Sephadex G- 1 0 0凝胶过滤层析法 ,从含 ha FGF基因重组体的大肠杆菌菌体中分离纯化得到人酸性成纤维细胞生长因子 ( rha FGF)。 SDS- PAGE,IEF电泳检测均为单一谱带 ,HPLC层析显示单一蛋白峰。 SDS- PAGE测定 rha FGF分子质量为 1 6.67ku,IEF测定等电点 p I为 4.8,并用 Edman降解法测定了 N-末端氨基酸序列。Balb/ c3T3细胞培养法测定纯化的 rha FGF生物活性 ED50 为 6μg/ L。

关键词：人酸性成纤维细胞生长因子肝素亲和层析凝胶过滤分离纯化多肽类细胞生长因子细胞分裂

毕赤酵母表达重组人内皮抑素对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用

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癌症 2002年第11期21卷 1197-1202页

作者：夏虎骆利敏文金序佟万成第一军医大学附属珠江医院呼吸科广东广州510282 第一军医大学生物技术实验室广东广州510515 第一军医大学附属南方医院呼吸科广东广州510515

背景与目的:肿瘤的生长和转移有赖于新生血管的生成,内皮抑素能抑制肿瘤的血管生成。本研究旨在观察毕赤巴斯德酵母(***115)分泌表达的重组人内皮抑素(recombinanthumanendostatin,rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。方法:... 详细信息

背景与目的:肿瘤的生长和转移有赖于新生血管的生成,内皮抑素能抑制肿瘤的血管生成。本研究旨在观察毕赤巴斯德酵母(***115)分泌表达的重组人内皮抑素(recombinanthumanendostatin,rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。方法:挑取一株高效分泌表达rhES的毕赤巴斯德酵母菌株,利用甲醇进行大量诱导表达;用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白;将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成两组,分别给予rhES和PBS皮下注射,每日1次,连续14天;观察两组小鼠肿瘤生长情况,测量肿瘤体积大小,并观察两组小鼠肿瘤肺部转移情况。结果:经甲醇诱导的毕赤巴斯德酵母菌株高效分泌表达了rhES;动物实验研究发现rhES能显著抑制小鼠肺腺癌LA795的生长,rhES治疗组肿瘤大小与对照组比较具有显著性差异(P<0.001),抑瘤率达到66.4%,并且有效抑制了肿瘤的肺部转移。结论:利用毕赤酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生物学活性,可显著抑制小鼠肺腺癌LA795的生长和转移。

关键词：重组人内皮抑素毕赤巴斯德酵母肝素亲和层析肺腺癌LA795 T739小鼠

乳腺生物反应器表达的重组人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化

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生物工程学报 2014年第10期30卷 1634-1638页

作者：王翠杰黄永东孔英俊罗坚张贵锋赵东旭苏志国马光辉北京理工大学生命学院北京100086 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室北京100190

抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)是人体内最重要的抗凝血物质,利用转基因技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ(rhAT Ⅲ)受到了越来越多的关注,如何有效地将rhAT Ⅲ从转基因羊奶中分离纯化出来是实现其产业化的关键所在。本研究建立了基于等电点沉淀和肝素亲和... 详细信息

抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)是人体内最重要的抗凝血物质,利用转基因技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ(rhAT Ⅲ)受到了越来越多的关注,如何有效地将rhAT Ⅲ从转基因羊奶中分离纯化出来是实现其产业化的关键所在。本研究建立了基于等电点沉淀和肝素亲和层析的纯化工艺,实现了rhAT Ⅲ的高效、快速纯化。先用等电点沉淀法,快速去除了占总蛋白50%左右的酪蛋白;然后用肝素亲和层析纯化rhAT Ⅲ,并系统考察了pH值和温度对rhAT Ⅲ稳定性的影响,以及pH值和操作条件(洗脱梯度、流速和上样量)对rhAT Ⅲ分离效果的影响。在优化的条件下,rhAT Ⅲ纯度达到99%以上,蛋白收率达到90%,活性收率约为50%。所建立的纯化工艺简单、快速,rhAT Ⅲ收率高,为今后工艺放大提供了重要的依据和参考。

关键词：乳腺生物反应器重组人抗凝血酶Ⅲ 肝素亲和层析分离纯化

截断型人酸性成纤维细胞生长因子的表达及活性鉴定(英文)

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中国药科大学学报 2004年第5期35卷 470-473页

作者：吴晓萍苏志坚郑青黄亚东李校堃暨南大学医药生物技术研究开发中心广州510632

目的 :稳定且具有活性的截断型人酸性成纤维细胞生长因子 (shaFGF)的构建、表达及纯化。方法 :以含全长人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的质粒pUC haFGF为模板 ,设计一对引物 ,PCR扩增获得shaFGFcDNA ,将其克隆到表达载体pET3c中 ,重组质... 详细信息

目的 :稳定且具有活性的截断型人酸性成纤维细胞生长因子 (shaFGF)的构建、表达及纯化。方法 :以含全长人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的质粒pUC haFGF为模板 ,设计一对引物 ,PCR扩增获得shaFGFcDNA ,将其克隆到表达载体pET3c中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,0 5mmol/LIPTG诱导表达 ,通过离子交换和肝素亲和层析纯化目标蛋白 ,MTT法检测促分裂活性。结果 :shaFGF的表达量约为 2 5 % ,纯化的shaFGF的促分裂活性与haFGF标准品相当。结论 :BL2 1(DE3) /pET3c表达系统能高效表达shaFGF ,纯化得到的shaFGF可供下一步的药学研究。

关键词： FGF 酸性成纤维细胞生长因子表达系统纯化活性鉴定肝素亲和层析药学研究 IPTG 高效表达诱导表达

重组人VEGF_(165)工程菌的发酵及表达产物的纯化与活性测定

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中国药科大学学报 2004年第1期35卷 82-85页

作者：刘煜吴国祥赵建阳颜天华奚涛沈子龙成国祥中国药科大学生命科学与技术学院南京210009 上海转基因研究中心上海201203 南京军医学院南京210099

目的 :优化重组人VEGF1 65(rhVEGF1 65)工程菌的发酵条件 ,分离纯化目的蛋白并检查活性。方法 :考察了甲醇诱导浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响 ;发酵液经离心、透析后 ,经肝素亲和柱层析、超滤制得纯品 ;采用CAM实验和血管内皮细... 详细信息

目的 :优化重组人VEGF1 65(rhVEGF1 65)工程菌的发酵条件 ,分离纯化目的蛋白并检查活性。方法 :考察了甲醇诱导浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响 ;发酵液经离心、透析后 ,经肝素亲和柱层析、超滤制得纯品 ;采用CAM实验和血管内皮细胞MTT法测定生物活性 ,比较了与人VEGF1 65标准品的免疫原性。结果 :最佳表达条件为 :甲醇诱导浓度为 1% ,诱导时间为 5～ 6d ;采用Heparin SepharoseCL6B亲和层析后 ,产物纯度可达 90 %以上 ;活性测定结果显示 ,目的蛋白具有促血管生成作用 ;与人VEGF1 65具有相似的免疫原性。结论 :经发酵纯化后获得了有活性的重组人VEGF1

关键词： rhVEGF165 血管内皮生长因子巴氏毕赤酵母纯化生物活性免疫原性肝素亲和层析

一种促分裂活性降低的hbFGF突变体的表达及纯化(英文)

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中国生物工程杂志 2005年第2期25卷 49-52页

作者：吴晓萍李校堃苏志坚郑青吴思娴许华曲红艳暨南大学药学院医药生物技术研究开发中心广州510632

为了降低由人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的广谱促分裂活性引起的潜在副作用,用中性氨基酸丙氨酸取代了hbFGF第108位的丝氨酸,构建了促分裂活性降低的hbFGF突变体(mhbFGF)。IPTG诱导突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。mhbFGF的... 详细信息

为了降低由人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的广谱促分裂活性引起的潜在副作用,用中性氨基酸丙氨酸取代了hbFGF第108位的丝氨酸,构建了促分裂活性降低的hbFGF突变体(mhbFGF)。IPTG诱导突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。mhbFGF的表达量约为全菌体蛋白的30％。通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白。MTT法检测促分裂活性表明,mhbFGF的促分裂活性显著低于野生型hbFGF。纯化的:mhbFGF可用于进一步的药效和安全性研究。

关键词： FGF 活性纯化表达肝素亲和层析 MTT法副作用人碱性成纤维细胞生长因子突变体 IPTG

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人碱性成纤维细胞生长因子突变体的高效表达

中国生物工程杂志 2005年第5期25卷 32-35页

作者：吴晓萍李校堃苏志坚郑青吴思娴暨南大学药学院广州510632 暨南大学广东省生物工程药物重点实验室广州510632

用PCR法将人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因中编码第2 5、69和92位的半胱氨酸(Cys)密码子突变为丝氨酸(Ser)密码子,将突变的hbFGFcDNA片断与表达质粒pET3c连接,构建重组质粒pET3c hbFGFSer2 5,69,92 。hbFGFSer2 5,69,92 在大肠杆菌... 详细信息

用PCR法将人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因中编码第2 5、69和92位的半胱氨酸(Cys)密码子突变为丝氨酸(Ser)密码子,将突变的hbFGFcDNA片断与表达质粒pET3c连接,构建重组质粒pET3c hbFGFSer2 5,69,92 。hbFGFSer2 5,69,92 在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中的表达量大于30 %。通过阳离子交换和肝素亲和层析两步纯化,得到纯度大于95 %的hbFGFSer2 5,69,92 。MTT法测定纯化的产物活性表明,hbFGFSer2 5,69,92 突变体促Balb/c细胞增殖的活性与野生型hbFGF相当,为下一步对hbFGFSer2 5 ,69,92 突变体进行定点化学修饰打下了基础。

关键词：人碱性成纤维细胞生长因子突变体 PCR 阳离子交换肝素亲和层析生物学活性化学修饰蛋白质类药物

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移抑制的初步研究

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人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795生长...

作者：夏虎第一军医大学

学位级别：硕士

血管内皮抑素(endostatin，ES)是由0’Reilly等于1997年从小鼠血管内皮瘤细胞株(EOMA)的培养基中纯化获得的分子量为20KD的一种蛋白质。经证实其为胶原18C末端的一个内源性片段，并能特异性抑制新生血管内皮细胞增殖，从而达到抑制新生... 详细信息

血管内皮抑素(endostatin，ES)是由0’Reilly等于1997年从小鼠血管内皮瘤细胞株(EOMA)的培养基中纯化获得的分子量为20KD的一种蛋白质。经证实其为胶原18C末端的一个内源性片段，并能特异性抑制新生血管内皮细胞增殖，从而达到抑制新生血管生成的目的。进一步的动物实验证明内皮抑素(ES)具有显著抑制原发实体肿瘤的生长和转移的作用，是一种强效的血管内皮生长抑制剂，重复使用未发现其有耐药性及毒副作用产生。重组表达的人内皮抑素分子量约为18.5KD，等电点为9.3，与鼠源性的内皮抑素氨基酸序列有86％的完全一致。本文重点研究将人内皮抑素(hES)基因整合入真核表达系统毕赤巴斯德(***115)酵母基因组，使其表达重组人内皮抑素(rhES)，并观察其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。一人血管内皮抑素(hES)在毕赤巴斯德酵母GS115(***115)中的表达、纯化及其体外细胞生物学活性检测酵母分泌型表达重组质粒pPIC9／hES由本实验室自行构建。分别用SaLⅠ，SacⅠ和BgLⅡ三种限制性内切酶使重组质粒pPIC9／hES线性化，并用氯化锂转化法将目的基因整合到宿主菌GS115的染色体中。鉴定转化子表型(HisMut和HisMut)，经甲醇诱导各转化子分泌表达重组人内皮抑素(rhES)，用SDS-PAGE及Western-blot鉴定，筛选出高效表达株。选择一株高表达株进行诱导表达，表达上清超滤浓缩及70％硫酸铵沉淀后经***进行肝素亲和层析纯化目的蛋白。采用MTT比色法观察重组人内皮抑素(rhES)是否抑制bFGF刺激的人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖。实验结果显示通过基因重组技术获得了可分泌表达重组人内皮抑素(rhES)的高效表达转化菌株;各转化子分泌分子量约为18.5KD，并具有人内皮抑素抗原活性的蛋白条带;进一步在体外证实了重组人内皮抑素(rhES)能明显抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖。二小鼠肺腺癌LA795动物模型的建立及观察重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制将LA795小鼠肺腺癌细胞接种于30只T739小鼠背部近右前肢处皮下(4×10cells／mouse)，随机分成两组：rhES治疗组和PBS对照组，各组15只接种小鼠。选择一株高效表达重组菌，经甲醇诱导进行大量表达，用***-6B亲和层析纯化目的蛋白，将获得的蛋白用于rhES治疗组。小鼠在接种后第6天开始接受治疗(分别给予 rhES20mg／kg／d，等量PBSO．3ml／kg／d，IB月瘤边缘3cm处皮下注射，共 14天)。观察各组小鼠肿瘤生长情况，肝、脾、肺肿瘤转移情况及各组小鼠生存期，并对各组数据进行统计学处理。成功制备LA795小鼠肺腺癌动物模型并随机分为两组。经大量诱导表达获得足量的重组人内皮抑素(rhES)，并用于治疗。动物实验结果表明：rhES治疗组肿瘤生长缓慢，治疗前后肿瘤平均体积分别为m．509 士5．120E－02Cd)，(2．073士0．202C旷);而PBS处理组肿瘤体积生长迅速，治疗前后肿瘤平均体积分另为(0．491士 8．174E一02cm’)，(6．761土 0．208cm‘)。治疗结束时两组小鼠肿瘤大小比较具有显著差异(p＜0．001)。病理切片观察发现rhES治疗组可见广泛散在组织坏死，肿瘤细胞凋亡、萎缩，肺、肝、脾未见明显肿瘤转移灶;而PBS对照组肿瘤细胞生长良好，肺部可见散在肿瘤转移灶，肝及脾脏亦未见肿瘤转移灶。两组小鼠生存期分别为门士3天)、(28士2天)，统计学分析两组比较具有显著性差异(P＜***)。本文成功地利用毕赤酵母一ichia。***)表达系统表达了重组人内皮抑素什hES人并证实其具有良好的生物学活性，有效地抑制了！人795小鼠肺腺癌的生长和转移，同时延长了小鼠的生存时间。

关键词：内皮抑素血管内皮抑制剂毕赤巴斯德酵母肝素亲和层析 LA795小鼠肺腺癌 T739小鼠