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细胞角蛋白19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用

生物化学与生物物理进展 2010年第7期37卷 728-736页

作者：张衡贾雅丽岳文陈琳谢小燕南雪何丽娟裴海云裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白... 详细信息

肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白19(CK19)启动子片段,构建了CK19启动子调控的海肾荧光素酶和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双报告载体(pSicoR-CK19-hrl-mrfp).其次,将上述慢病毒载体转染肝干/祖细胞后,通过流式细胞分选获得稳定转染的细胞株.再次,将上述细胞株与表达"上皮形态发生素"(Epimorphin,EPM)的PT67细胞共培养后,整合有pSicoR-CK19-hrl-mrfp表达载体的肝干/祖细胞不仅形态发生了变化,而且排列为二维环状结构,另外还检测到由CK19启动子启动表达的海肾荧光素酶和RFP,细胞形态和基因表型都证明肝干/祖细胞经诱导已经分化成为BECs.与此形成对照的是肝干/祖细胞与不表达EPM的PT67细胞共培养后,没有观测到上述的变化.所以,CK19启动子调控的双报告载体不仅可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向,而且还可以定量地检测CK19启动子活性的变化情况.总之,这一载体的成功构建将为研究肝干/祖细胞的分化提供了便捷的工具,同时也有助于筛选可诱导肝干/祖细胞定向分化的分子.

关键词：细胞角蛋白海肾荧光素酶红色荧光蛋白肝干/祖细胞分化

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肝细胞生成素Cn促进肝干/祖细胞增殖的功能研究

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军事医学 2015年第6期39卷 413-417页

作者：李永锋刘勇常菁刘鹏飞高慧英周旭卢俊崔春萍山东大学附属省立医院普外科济南250021 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

目的检测肝细胞刺激因子肝细胞生成素Cn(hepatopoietin Cn,HPPCn)作用肝祖细胞的功能。方法利用MTT法、AnnexinⅤ和PI荧光染色法分别检测WB-F344细胞增殖及其抗凋亡能力,Transwell法检测细胞迁移能力。建立小鼠2AAF-部分肝切除(partial ... 详细信息

目的检测肝细胞刺激因子肝细胞生成素Cn(hepatopoietin Cn,HPPCn)作用肝祖细胞的功能。方法利用MTT法、AnnexinⅤ和PI荧光染色法分别检测WB-F344细胞增殖及其抗凋亡能力,Transwell法检测细胞迁移能力。建立小鼠2AAF-部分肝切除(partial hepatectomy)模型,分析高表达HPPCn对肝干/祖细胞增殖和迁移的影响。结果重组HPPCn蛋白能促进WB-F344细胞的增殖及细胞迁移,低浓度HPPCn能抑制WB-F344细胞的凋亡,并激活WB-F344细胞中Sph K1、Erk1/2以及Stat3信号通路。动物模型检测结果显示,肝特异HPPCn转基因小鼠部分肝切除后,肝卵圆细胞较对照组明显增多,肝再生能力增强。结论 HPPCn能促进肝干/祖细胞增殖和存活,并通过促进肝卵圆细胞增生,提高肝再生能力。

关键词：肝细胞刺激因子,肝细胞生成素Cn 肝干/祖细胞细胞增殖肝再生白细胞介导6 细胞运动小鼠,转基因

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肝内干/祖细胞参与ALPPS 1期术后残肝再生的研究

肝内干/祖细胞参与ALPPS 1期术后残肝再生的研究

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作者：黄民西南医科大学

学位级别：硕士

目的:门静脉结扎联合肝脏原位离断术(Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy,ALPPS)能够在较短的理想时间内显著促进残肝体积的增大和肝脏的增生,但其具体的促再生机制目前仍不十分清楚,本文旨... 详细信息

目的:门静脉结扎联合肝脏原位离断术(Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy,ALPPS)能够在较短的理想时间内显著促进残肝体积的增大和肝脏的增生,但其具体的促再生机制目前仍不十分清楚,本文旨在建立门静脉结扎联合肝脏原位离断术的稳定动物模型,并探索肝内干/祖细胞是否参与ALPPS术后残肝的快速增生。方法:将72只雄性健康SPF级SD大鼠按随机数字表随机分为ALPPS组(n=24),门静脉结扎组(portal vein ligation,PVL)(n=24),假手术组(Sham)(n=24)。分别在手术后1、2、3、7天检测各组大鼠肝脏的肝再生率(hepatic regeneration rate,HRR),大鼠血清IL-6、HGF、TNF-α等细胞因子表达水平、肝脏功能指标(AST、ALT、TBIL)和肝脏组织病理学检测(HE染色),同时检测肝脏组织Ki-67阳性细胞表达率;免疫组织化学、免疫荧光和Western Blot检测大鼠肝内干/祖细胞特异性标记物OV-6表达水平。结果:术后第3d和第7d ALPPS组的肝脏再生率(HRR)显著高于PVL组(均p肝脏再生率在各时间节点均明显高于Sham组(均p细胞比率在术后第2、3天明显高于PVL组(均P细胞比率在术后2、3、7天均高于Sham组(均p肝功指标AST、ALT显著升高并达高峰,且术后第一天ALPPS组显著高于PVL组(均p细胞标记物OV-6阳性细胞表达比例显著高于PVL组(均P细胞标记物OV-6阳性细胞表达比例均高于PVL组(均P0.05);血清ELISA结果显示:ALPPS组术后第1和2天血清IL-6、TNF-α、HGF水平均高于PVL组(均p肝脏再生率(HRR)变化趋势和Ki-67阳性表达率以及肝脏功能恢复的时间等结果表明ALPPS诱导的肝再生明显优于PVL,且术后肝功恢复时间快。同时,证实了肝内干/祖细胞参与了ALPPS术后残肝的快速再生,其可能的机制为ALPPS术造成了肝脏相对严重的损伤,这种严重的损伤刺激了体内一系列的高水平的炎症反应,而严重的炎症水平进一步激活肝内干/祖细胞的动员和增殖活化,从而参与了术后肝脏快速的增生恢复。

关键词：门静脉结扎联合肝脏原位离断术门静脉结扎术肝再生肝干/祖细胞卵圆细胞

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潜在的成体肝干/祖细胞

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中国生物化学与分子生物学报 2008年第8期24卷 698-703页

作者：李福生张耀洲浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所杭州310018

研究者在50年前提出"成体肝组织内存在肝干细胞"这一假说.肝干/祖细胞研究对干细胞基础研究及其临床治疗研究都有着重要的意义.研究者也已从损伤的人类和啮齿动物的肝组织中分离到激活的肝干/祖细胞,并建立了相应的培养体系.目前的研究... 详细信息

研究者在50年前提出"成体肝组织内存在肝干细胞"这一假说.肝干/祖细胞研究对干细胞基础研究及其临床治疗研究都有着重要的意义.研究者也已从损伤的人类和啮齿动物的肝组织中分离到激活的肝干/祖细胞,并建立了相应的培养体系.目前的研究表明,肝内存在多个具有干细胞特性的细胞,且它们位于肝内不同的区域.另外,潜在的肝干/祖细胞的分子表达谱也已得到一定的阐述.本文结合肝干/祖细胞的研究,对成体肝干/祖细胞的潜在类型、来源与定位作一回顾.

关键词：肝干/祖细胞卵圆细胞类小肝细胞祖细胞侧群定位肝再生骨髓转基因小鼠

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CK19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用

CK19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中...

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作者：张衡中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

终末期肝病是威胁我国人民生命健康的一大类疾病,目前临床上治疗它的最有效的办法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),但因其供体极度短缺极大地限制了这一治疗手段的广泛开展。对于这一问题,肝脏组织工程构建无异于... 详细信息

终末期肝病是威胁我国人民生命健康的一大类疾病,目前临床上治疗它的最有效的办法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),但因其供体极度短缺极大地限制了这一治疗手段的广泛开展。对于这一问题,肝脏组织工程构建无异于是一个好的解决办法。众所周知,肝脏中的实质细胞除了占绝对主体的肝细胞外,还存在着胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs),虽然BECs仅占肝脏细胞总数的3%～5%,但其有着重要的功能,比如:分泌胆汁、调节胆汁的组成、控制胆汁流量和运输胆汁。BECs的这些功能可以很好地维持肝脏功能的完整性。因此,在肝脏的组织工程学研究中,要想得到结构功能兼备的肝单元结构,同肝细胞一样,BECs也是必不可少的。然而,目前肝脏组织工程的研究方向主要集中在向肝细胞的诱导分化上,对于BECs的研究甚少。具有高度自我更新和发育全能性的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)在适宜的环境中可以向各种组织细胞分化,有望为肝脏的组织工程提供理想的种子细胞。本研究主要分为两大部分,在第一部分中,我们首先建立了CK19启动子调控的双报告载体,经慢病毒转染肝干/祖细胞(hepatic progenitor cells,HPCs)系,建立了稳定表达的细胞系,之后利用体外共培养的方法诱导HPCs分化为BECs,验证了报告载体的功能;在第二部分中,我们在体外培养了小鼠ES细胞,并且建立了稳定表达报告载体的小鼠ES细胞系。这一研究不仅提供了纯化目的细胞的手段,同时也为以细胞治疗和基因治疗为基础的肝脏再生医学的基础研究提供了一些方法。本研究主要包括以下两部分内容。一、CK19启动子调控的双报告载体的构建近年来,遗传修饰技术的逐步成熟为细胞分化研究提供了便利的工具。遗传修饰技术可以方便地“跟踪”目标细胞分化的情况,从而能够使原本不易察觉的分化过程变得易于研究。在本研究中我们首先构建了由BECs较为特异的标志CK19启动子调控的双报告载体pCK19-Rluc-mRFP,然后通过遗传修饰技术建立了稳定转染表达载体pCK19-Rluc-mRFP的HPCs。接下来,我们利用EPM-PT67细胞与HPCs稳定株共培养的方法诱导后者分化为BECs,之后通过细胞形态的变化、RT-PCR和Western-blot等结果说明HPCs被诱导到了BECs,同时海肾荧光素酶和红色荧光蛋白的表达情况说明我们构建的报告载体pCK19-Rluc-mRFP在细胞分化过程中能够发挥指示和报告作用。 (一)在肝脏中CK19是BECs的特异性基因肝系细胞在发育分化过程中缺乏一致的特异性标志物,只有一些高度表达的标志物,这些标志为我们识别成功诱导分化的细胞奠定了一定的基础,其中特异性标记的筛选在分化细胞的鉴定中具有更重要的意义。细胞角蛋白(cytokeratins,CKs)是一种分化特异的蛋白质,属于中间纤维家族,与细胞分化和细胞骨架的组织有关。CKs广泛存在于上皮类细胞中,是其重要的标志。CKs在很多组织(如:肝脏、胰腺、膀胱等)的上皮细胞中都有表达,其中CK19呈高表达状态,但是在肝脏中CK19是BECs的特异性标志基因[1,2]。Michael Lie-A-Ling等为了更早期更准确地诊断胆管癌,在BECs的多种标志物中筛选出了CK19,并构建了由人CK19启动子启动萤火虫荧光素酶的质粒pShuttle-CK19-Luc,然后将其转入人胆管癌细胞中以测定其表达效率,在候选的启动子中CK19启动子比其它更高效地表达。这样通过测定各种标志物的表达效率,Michael Lie-A-Ling等认为CK19是BECs的较为特异性基因[3]。 (二)表达载体pCK19-Rluc-mRFP的构建 CK19在BECs中高表达,是识别BECs的一个较为特异的细胞标志。在本实验中,我们首先从HepG2细胞的全基因组、pcDNA3.1-hrl-mrfp-ttk载体[4]和pcDNA3.1质粒中用高保真DNA聚合酶分别扩增出CK19核心启动子、Rluc-mRFP序列和poly A序列三个目的片段,然后通过相应地酶切位点将三个目的片段插入慢病毒干涉载体pSicoR-GFP,这样就构建成了一个由CK19启动子调控Rluc-mRFP的表达载体pCK19-Rluc-mRFP。四酶切鉴定显示出载体中含有744bp、1650bp和225bp大小的三个插入片段,测序鉴定也证明了载体中插入片段的正确性。另外,该载体中还含有一段可以编码绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的基因,可将此作为获得稳定转染pCK19-Rluc-mRFP表达载体的细胞株的标记。 (三)通过共培养诱导WB细胞分化为BECs对表达载体进行功能验证 WB-F344(简称WB)细胞是从正常成年雄性Fisher大鼠肝

关键词：细胞角蛋白肝干/祖细胞胚胎干细胞分化海肾荧光素酶红色荧光蛋白

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