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翘嘴鲌Runx2b基因的克隆与表达特征分析

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浙江农业学报 2024年第5期36卷 1024-1031页

作者：何昌熙郑建波马建波贾永义刘士力蒋文枰迟美丽程顺李飞上海海洋大学水产与生命学院农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 浙江省淡水水产研究所浙江省淡水水产遗传育种重点实验室浙江湖州313001 余姚市水产技术推广中心浙江余姚315400

为探究Runx2b基因在翘嘴鲌肌间刺骨化过程中的调控作用,基于转录组数据和PCR扩增技术克隆获得了翘嘴鲌Runx2b基因全长编码序列。通过茜素红整体骨骼染色对肌间刺(IBs)形成的不同阶段进行了分期,同时采用qRT-PCR技术检测了Runx2b基因的... 详细信息

为探究Runx2b基因在翘嘴鲌肌间刺骨化过程中的调控作用,基于转录组数据和PCR扩增技术克隆获得了翘嘴鲌Runx2b基因全长编码序列。通过茜素红整体骨骼染色对肌间刺(IBs)形成的不同阶段进行了分期,同时采用qRT-PCR技术检测了Runx2b基因的时空表达水平。结果显示,Runx2b基因开放阅读框为1 401 bp,编码466个氨基酸,预测分子量为50.676 ku,理论等电点为9.35;氨基酸序列多重比对显示,翘嘴鲌Runx2b氨基酸序列与近源物种的同源性高达95%以上,且都具有高度保守的Runt和RunxI结构域;系统进化树分析表明,翘嘴鲌与团头鲂的亲缘关系最为接近。茜素红染色结果显示,在肌间刺发育前,翘嘴鲌的主轴骨骼和附肢骨骼已经发育完全;其中,孵化后15 d,尾部肌隔中开始出现小肌间刺;孵化后30 d,翘嘴鲌幼体的肌间刺发育完全。组织表达结果显示,Runx2b基因在翘嘴鲌各组织中均有表达,鳃中的表达量最高,其次是肌肉。此外,Runx2b基因在翘嘴鲌幼体不同生长阶段的表达模式与肌间刺骨化发生的时序保持一致,提示该基因与肌间刺骨化的相关性。研究结果可以为后续无肌间刺翘嘴鲌新种质的创制和肌间刺形成的分子机制提供基础数据。

关键词：翘嘴鲌肌间刺 Runx2b 基因表达骨化

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MsxC基因在斑马鱼肌间刺和大侧肌发育中的作用

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上海海洋大学学报 2022年第2期31卷 328-335页

作者：庞天抒车金远范纯新鲍宝龙上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

肌间刺存在于有些真骨鱼类的肌间隔中,作为Hox基因家族成员,MsxC(muscle segment homeobox C)基因的表达模式与唇䱻肌间刺形成有一定的相关性。为了进一步探究MsxC基因在肌间刺形成中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立斑马鱼MsxC... 详细信息

肌间刺存在于有些真骨鱼类的肌间隔中,作为Hox基因家族成员,MsxC(muscle segment homeobox C)基因的表达模式与唇䱻肌间刺形成有一定的相关性。为了进一步探究MsxC基因在肌间刺形成中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立斑马鱼MsxC基因纯合突变体(MsxC^(^(-/-)))。结果表明:与野生型斑马鱼相比,MsxC^(-/-)斑马鱼尾部的髓弓小骨和脉弓小骨平均缩短15%以上,差异极显著,而躯干部的肌间刺长度则无明显差异;MsxC^(-/-)斑马鱼大侧肌肌隔周围白肌细胞分布疏松,且排列混乱,越靠近尾部差异越明显;MsxC^(-/-)突变体红肌面积增大,越靠近尾部,红肌面积增大越明显,尾部红肌面积增大2.22%(P肌间刺的形成,同时也影响了大侧肌的发育。

关键词：斑马鱼 MsxC 肌间刺大侧肌 CRISPR/Cas9

基于runx2b基因敲除的无肌间刺团头鲂新种质创制

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基于runx2b基因敲除的无肌间刺团头鲂新种质创制

作者：董强华中农业大学

学位级别：硕士

我国主要养殖鱼类均存在一定数量的肌间刺,一定程度上影响了其加工和食用价值,还有受伤害的风险。近年来,肌间刺性状已成为鱼类遗传育种研究领域备受关注的改良性状之一。已有研究证明runx2b是鱼类肌间刺形成的关键基因,runx2b基因缺失... 详细信息

我国主要养殖鱼类均存在一定数量的肌间刺,一定程度上影响了其加工和食用价值,还有受伤害的风险。近年来,肌间刺性状已成为鱼类遗传育种研究领域备受关注的改良性状之一。已有研究证明runx2b是鱼类肌间刺形成的关键基因,runx2b基因缺失可以获得稳定的无肌间刺斑马鱼突变体,但尚未有研究聚焦于该基因的无肌间刺经济鱼类的研究。本研究以经济型鱼类团头鲂(Megalobrama amblycephala)为主要研究对象,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建缺失runx2b功能的突变体F0代,并筛选出肌间刺减少30%以上的突变体F0代,待其发育至性成熟进行自交繁殖,获得F1代;当F1代的群体生长至四月龄时,通过X光活体扫描F1代个体,筛选无肌间刺团头鲂,随后通过阳性克隆技术检测无肌间刺团头鲂F1代的基因型;采用Micro-CT分析野生型和无肌间刺团头鲂F1代骨骼的骨密度;茜素红整体骨骼染色法和X光扫描技术观察野生型和无肌间刺团头鲂F1代的骨骼发育情况;进一步采用q RT-PCR技术分析骨发育相关基因在野生型和无肌间刺团头鲂F1代尾部肌肉组织中的表达模式,并对野生型(含肌间刺)和团头鲂F1代(无肌间刺)肌肉的营养成分进行了分析。主要研究结果如下:1.团头鲂runx2b突变体F0代的构建、表型及基因表达模式分析本研究通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,在团头鲂受精卵的1细胞期之前进行多靶点注射,构建runx2b突变体F0代。采用2%琼脂糖凝胶电泳法检测48h受精卵的突变情况,检测结果为双条带的个体,进一步采用Sanger测序法测序并进行序列比对,靶点附近出现双峰则证明敲除成功;随机选取54尾70dpf的已筛选出的runx2b突变体F0代进行茜素红骨骼染色。结果显示,其中有6尾表现为肌间刺部分缺失的性状,肌间刺缺失的数量分别为43根、7根、17根、14根、7根、14根,肌间刺缺失比率分别为33.86%、5.74%、13.60%、11.48%、5.60%和11.29%。与野生型相比,少刺突变体F0代在背部和尾部均出现肌间刺部分缺失的情况,且脊椎、肋骨等其他骨骼发育正常;采用q RT-PCR技术分析发育到3月龄的runx2b突变体F0代尾部肌肉中骨发育相关基因的表达情况。结果显示,由于团头鲂突变体F0代中runx2b基因的缺失,与矿化相关的基因(entpd5a、entpd5b、spp1、scpp1)在runx2b突变体F0代中的表达量与野生型相比均显著降低(P肌腱发育相关基因tnmd在runx2b突变体F0代中的表达量与野生型相比没有显著差异(P>0.05)。2.无肌间刺团头鲂突变体F1代的培育、表型及基因表达模式分析为获得无肌间刺的团头鲂突变体F1代,本实验以筛选获得的团头鲂runx2b突变体F0代为基础,选择性成熟、肌间刺减少30%以上的runx2b突变体F0代进行强化培育,挑选发育良好的runx2b突变体F0代作为F1代团头鲂的亲本,自交繁殖获得F1代;随后选择60尾45dpf的runx2b突变体F1代进行茜素红骨骼染色观察表型。结果显示,27尾(占45%)runx2b突变体F1代的肌间刺完全缺失,且其他骨矿化正常,如肋骨、脊椎、神经棘和血管棘。当团头鲂runx2b突变体F1代生长至四月龄时,使用X射线对runx2b突变体F1代进行活体扫描,并从5000尾中筛选出共316尾完全没有肌间刺的团头鲂,Micro-CT结果也进一步明确,runx2b突变体F1代完全没有肌间刺。组织骨密度分析结果显示,生长至4月龄的野生型和runx2b突变体F1代团头鲂的脊椎、肋骨、神经棘、血管棘等骨骼的组织骨密度(tissue mineral density,TMD)值没有显著差异(P>0.05);为探究runx2b基因功能缺失的团头鲂突变体F1代的基因表达模式,随机选取发育到4月龄的runx2b突变体F0代,采用q RT-PCR技术分析其尾部肌肉中骨发育相关基因的表达情况。结果显示,由于无肌间刺团头鲂F1代中runx2b基因的缺失,与骨矿化相关的基因(alpl、bglap、entpd5a、entpd5b)在无肌间刺团头鲂F1代中的表达量与野生型相比均显著降低,且成骨相关基因sp7在无肌间刺团头鲂F1代中的表达量与野生型相比也显示出相对较低的表达水平。3.无肌间刺团头鲂突变体F1代的基因型分析和肌肉的营养成分分析为确定无肌间刺团头鲂突变体F1代的runx2b基因型,随机选择35尾无肌间刺团头鲂F1代进行阳性克隆检测。结果显示,runx2b靶点1、2、3突变类型分别为:靶点1为3种突变类型(1种插入类型,2种缺失类型),插入2 bp,缺失5 bp、8 bp;靶点2为13种突变类型(8种插入,5种缺失类型),插入4bp、5 bp、6 bp、8 bp、9 bp、16 bp、17 bp和25 bp;缺失2 bp、3 bp、4 bp、5 bp和

关键词：肌间刺团头鲂 runx2b 基因敲除表型分析基因分型差异表达基因分析营养成分分析

草鱼多态性微卫星标记开发及肌间刺数目性状遗传参数评估

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草鱼多态性微卫星标记开发及肌间刺数目性状遗传参数评估

作者：黄纬杰华中农业大学

学位级别：硕士

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是中国四大家鱼之一,也是产量最大的淡水鱼类,开展分子标记辅助育种研究具有重要的理论和实践意义。已有研究通过富集文库方法筛选草鱼微卫星分子标记,并应用于其生长、抗病等性状的辅助选育中;但这些标... 详细信息

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是中国四大家鱼之一,也是产量最大的淡水鱼类,开展分子标记辅助育种研究具有重要的理论和实践意义。已有研究通过富集文库方法筛选草鱼微卫星分子标记,并应用于其生长、抗病等性状的辅助选育中;但这些标记普遍以2碱基重复序列为主,极易产生基因分型误判,在草鱼亲子鉴定的实际使用过程中准确率受到一定影响。目前草鱼全基因组序列已经发布,这为在全基因组水平开发多态性高,且基因型容易判读的4-6碱基重复的微卫星标记提供了可能。此外,已有草鱼的育种工作主要集中在生长和抗病方面,但草鱼肌间刺的存在使得其可食用性和深加工性能都受到一定影响,有研究在草鱼雌核发育群体中发现生长、活动正常的无肌间刺草鱼突变体,因此培育少或无肌间刺的草鱼优良品种是可能的。因此本研究基于草鱼和多种鱼类的全基因组数据挖掘微卫星位点并分析其特征,开发高多态性微卫星标记,并用于构建草鱼亲子鉴定平台;在此基础上构建家系,评估草鱼肌间刺数目性状遗传参数,并探究肌间刺育种的可行性,为后续草鱼肌间刺性状的选择育种奠定基础。主要研究结果如下:1.草鱼全基因组微卫星特征分析与多态性标记开发利用MISA软件对包含草鱼在内的67种鱼类已发表的全基因组数据进行微卫星挖掘并分析其特征。结果显示67种鱼类的基因组大小为342.4 Mb-2966.89Mb,其中微卫星为160,420个-2,764,367个,平均698,242.24个,微卫星占比为0.26%-6.17%,平均1.57%。在12种鲤形目鱼类中,我们发现其基因组中微卫星数量与基因组大小呈显著正相关(R=0.8742,p肌间刺数目性状遗传参数评估将136尾草鱼亲本(66雄,70雌)分三组随机自然交配,随机挑选538尾子代测量生长性状并利用水煮法统计全身肌间刺数目。并利用6个微卫星位点对子代进行亲子鉴定,共区分出190个全同胞家系(父系半同胞家系58个,母系半同胞家系56个)。肌间刺统计结果表明草鱼肌间刺总数分布在102-127根,平均117根,变异系数3.22%。腹部肌间刺数目变异系数(5.52%)显著高于背部肌间刺变异系数(2.52%)。利用ASReml-R对肌间刺数目性状的遗传参数进行评估,并通过AIC和BIC值判断动物模型和亲本模型拟合优度,确定动物模型为最佳模型。通过动物模型评估,草鱼全身肌间刺数目遗传力为0.293±0.092,左侧与右侧肌间刺数目遗传力分别为0.347±0.101、0.183±0.073,

关键词：草鱼肌间刺微卫星遗传参数选择育种

“卖一塘亏一塘!”2024生鱼该如何逆风翻盘?未来机遇点在哪里?

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当代水产 2024年第5期49卷 60-61页

作者：彭可欣(文/图) 郑思桃(文/图) 当代水产

近年,随着水产预制菜蓬勃发展,生鱼凭借其无肌间刺、肉质鲜美等特点,成功乘上了预制菜的东风,价格也一度涨上12元/500g(2斤上发车价)。但好景不长,后疫情时代下,水产品流通受阻、成品鱼积压,生鱼价格也从高峰跌入泥沼。2023年,生鱼存塘... 详细信息

近年,随着水产预制菜蓬勃发展,生鱼凭借其无肌间刺、肉质鲜美等特点,成功乘上了预制菜的东风,价格也一度涨上12元/500g(2斤上发车价)。但好景不长,后疫情时代下,水产品流通受阻、成品鱼积压,生鱼价格也从高峰跌入泥沼。2023年,生鱼存塘积压严重、养殖周期不断拉长、塘租和人工等养殖成本增加,传统消费渠道难以消化过剩产量,生鱼也逐渐从大家口中的“卖一塘赚一套房”.

关键词：养殖周期养殖成本水产品流通生鱼肌间刺疫情积压

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原创“异育银鲫”，创造世界奇迹 004

原创“异育银鲫”，创造世界奇迹

肌间刺缺失突变对斑马鱼胚胎发育过程中肌肉发育的影响

中国科学报

作者：李思辉

1994年，一篇耸人听闻的文章在美国引起轩然大波。文章认为，随着人口增加和消费结构变化，以及城市化和工业化的推进，中国2030年粮食供应将比1994年减少20%，面临巨大的粮食缺口，到时候全世界都养活不了中国，会导致全球粮食危机... 详细信息

1994年，一篇耸人听闻的文章在美国引起轩然大波。文章认为，随着人口增加和消费结构变化，以及城市化和工业化的推进，中国2030年粮食供应将比1994年减少20%，面临巨大的粮食缺口，到时候全世界都养活不了中国，会导致全球粮食危机。这篇对中国充满悲观和偏见的文章长达14

关键词：异育银鲫肌间刺雌核生殖淡水养殖世界奇迹

来源： cnki报纸评论

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中国水产科学 2019年第2期26卷 296-303页

作者：杨建佟广香郑先虎孙志鹏吕伟华孙效文匡友谊上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

为阐明肌间刺缺失对斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育时期肌肉发育的影响,采用qRT-PCR的方法,检测分析了斑马鱼不同肌间刺表型间5个肌肉特异性基因(mef2、myf5、myod、myog和sox6)在囊胚期(3hpf,hourspost fertilization)、原肠胚期(6 hpf)... 详细信息

为阐明肌间刺缺失对斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育时期肌肉发育的影响,采用qRT-PCR的方法,检测分析了斑马鱼不同肌间刺表型间5个肌肉特异性基因(mef2、myf5、myod、myog和sox6)在囊胚期(3hpf,hourspost fertilization)、原肠胚期(6 hpf)、体节期(12 hpf)、咽囊期(24 hpf)和孵化期(72 hpf)5个发育时期的表达情况,对比分析了肌间刺缺失对斑马鱼胚胎发育过程中肌肉发育特异性基因的时序表达差异和肌肉发育的影响,以及对受精率、孵化率和畸形率的影响。结果显示, 5个特异性基因在肌间刺缺失突变型与野生型斑马鱼各发育时期的表达量无显著性差异(P>0.05)。其中,myf5、myod基因在原肠胚期表达量升高,在体节期和咽囊期开始逐步下降;mef2、myog和sox6基因在囊胚期和原肠胚期表达量很低,在体节期和咽囊期表达量迅速升高,并在孵化期开始下降。此外,受精率、孵化率和畸形率的统计结果显示,肌间刺突变型与野生型间亦无显著性差异(P>0.05)。综上,推测肌间刺的缺失对斑马鱼胚胎发育及胚胎发育过程中肌肉的发育没有影响。

关键词：肌间刺斑马鱼胚胎发育肌肉

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肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响

水生生物学报 2020年第3期44卷 546-552页

作者：杨建佟广香郑先虎孙志鹏吕伟华孙效文匡友谊中国水产科学研究院黑龙江水产研究所哈尔滨150070 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

利用斑马鱼(Danio rerio)野生型与肌间刺完全缺失突变型个体,从骨骼染色和骨骼发育相关基因表达两方面,初步评价了肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响。通过骨骼染色对比观察了两种肌间刺表型个体受精后8dpf(days post fertilization, d... 详细信息

利用斑马鱼(Danio rerio)野生型与肌间刺完全缺失突变型个体,从骨骼染色和骨骼发育相关基因表达两方面,初步评价了肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响。通过骨骼染色对比观察了两种肌间刺表型个体受精后8dpf(days post fertilization, dpf)到56dpf的骨骼发育情况,结果显示,两种肌间刺表型除肌间刺外,其他骨骼发育基本同步。此外,通过qRT-PCR实验检测分析了6个骨骼发育相关基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)在不同肌间刺表型5个胚胎发育时期(3hpf囊胚期、6hpf原肠胚期、12hpf体节期、24hpf咽囊期和72hpf孵化期)和5个胚后生长阶段(15、30、45、60和75dpf)的表达情况。结果显示:在胚胎发育时期,野生型和突变型个体中bmp2a、bmp4、smad1、smad4a基因和突变型个体中sp7基因的表达均呈现先升后降的变化趋势,且在体节期达到最高表达水平;野生型和突变型个体中runx2a基因和野生型个体中sp7基因则表现为逐渐上升的趋势。6个基因在囊胚期和原肠胚期表达量无显著差异, bmp2a的表达水平在体节期、咽囊期和孵化期无显著差异,野生型个体bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因在体节期、咽囊期和孵化期的表达水平明显高于突变型,而sp7基因则表现为突变型明显高于野生型。胚后发育阶段6个基因在5个生长阶段均呈现逐渐下降的趋势,且在两种肌间刺表型间其表达仅在个别时期差异显著。综上所述,肌间刺的缺失对斑马鱼骨骼发育表现型无显著影响,只在胚胎发育时期影响骨骼相关基因表达水平的变化;结合骨骼染色结果,推测肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育无显著影响。

关键词：肌间刺斑马鱼野生型突变型骨骼发育骨骼染色

唇䱻硬骨蛋白基因克隆及其在肌间刺发生过程中的表达

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水生生物学报 2021年第6期45卷 1201-1206页

作者：陈洁刘子明姜维吕耀平丽水学院生态学院丽水323000

为探究硬化蛋白(Sclerostin,SOST)与肌间刺发生之间的关系,研究通过转录组测序和RT-PCR获得了唇䱻(Hemibarbus labeo)硬化蛋白基因cDNA序列。序列分析表明,硬化蛋白由信号肽和成熟肽两部分组成,成熟肽包含一个胱氨酸结样结构域。系统进... 详细信息

为探究硬化蛋白(Sclerostin,SOST)与肌间刺发生之间的关系,研究通过转录组测序和RT-PCR获得了唇䱻(Hemibarbus labeo)硬化蛋白基因cDNA序列。序列分析表明,硬化蛋白由信号肽和成熟肽两部分组成,成熟肽包含一个胱氨酸结样结构域。系统进化树分析表明,唇䱻硬化蛋白与金鱼(Carassius auratus)硬化蛋白最为接近。通过荧光定量PCR检测发现唇䱻硬化蛋白基因mRNA在所有被检测的组织中均有表达,在鳃中的表达量最高。RNA原位杂交结果表明,硬化蛋白mRNA分布于肌膈,且随着肌间刺的发生信号逐步减弱。RTqPCR显示,在肌间刺4个发育阶段中,硬化蛋白基因mRNA的变化显著,在阶段Ⅰ表达量最高,随后逐步降低。综上,唇䱻硬化蛋白与肌间刺骨化存在一定的相关性。研究结果将为进一步调查鱼类硬化蛋白功能及硬化蛋白在肌间刺形成过程中的作用提供理论依据。

关键词：唇䱻 SOST 基因表达肌间刺骨化